Una sola célula de perfiles de neuronas de la retina en desarrollo y maduro

El objetivo general de este procedimiento es aislar células individuales para el análisis del transcriptoma basado en microarrays. Esto se logra primero mediante la disección de la retina a partir del tejido circundante y luego disociándola en células individuales. El segundo paso consiste en recolectar células individuales y depositarlas en tubos para PCR que contienen tampón de lisis.

Luego, las células se lisan y el ADNc se amplifica mediante transcripción inversa, seguida de una reacción en cadena de la polimerasa. En última instancia, la hibridación del ADNc de una sola célula en un microarreglo A iMatrix se utiliza para revelar los ARNm expresados en una sola célula. La principal ventaja de realizar el perfilado de la expresión génica en células individuales frente a los enfoques que utilizan tejidos completos es que el aislamiento de células individuales permite acceder a poblaciones celulares muy pequeñas que formarían parte del tejido completo.

Estas células podrían ser cualquier cosa, desde diferentes tipos de neuronas hasta pequeñas poblaciones de células madre. Lo que nos permite hacer la técnica de célula individual con estas células es identificar tanto los tipos celulares como los marcadores específicos para estas pequeñas poblaciones celulares, así como identificar las redes genéticas que se expresan en estos subconjuntos extremadamente raros de células. Además, la técnica de perfilado a nivel de célula individual nos permite identificar las redes genéticas que se expresan transitoriamente durante transiciones de desarrollo muy dinámicas en subconjuntos muy pequeños de células.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la genética del desarrollo, como cuándo comienzan las células progenitoras a expresar redes génicas asociadas con la diferenciación y cómo difieren esas células progenitoras entre sí. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia terapias celulares para enfermedades neurodegenerativas como el glaucoma, porque al elucidar las redes clave en el desarrollo de células individuales, estamos un paso más cerca de poder generar esas células para su uso en terapia de reemplazo celular. Comience este procedimiento colocando la retina de ratón en un recipiente lleno de PBS.

A continuación, retire el vítreo y el cristalino. Luego elimine todo el epitelio pigmentario de la retina. Incube la retina en un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros a 37 grados Celsius durante 10 minutos.

Posteriormente, golpee suavemente el tubo para desprender las células asentadas. Luego, pipeteé suavemente 10 a 20 veces con una pipeta P1000. Si persisten grumos grandes de tejido, incube por 10 minutos adicionales a 37 grados Celsius y repita la pipetación 10 a 20 veces.

A continuación, agregue cinco microlitros de ADN, uno a 10 unidades por microlitro, a la retina e incube durante cinco minutos. A temperatura ambiente, remueva suavemente con la pipeta P 1000 otros 10 a 20 veces más. Centrifugue a 3000 RPM durante tres minutos.

Luego, elimine el sobrenadante y deje entre 100 y 200 microlitros de líquido en el fondo. Golpee suavemente el tubo para despegar el precipitado. A continuación, agregue un mililitro de HBSS y resuspenda el precipitado con agitación suave.

Centrifúguelo a 3000 RPM durante tres minutos. Una vez finalizado, retire cuidadosamente el sobrenadante. A continuación, resuspenda en 450 microlitros de PBS que contenga 0,1 % de BSA en el siguiente paso, prepare dos placas de seis centímetros que contengan cinco mililitros de PBS suplementado con 0,1 % de BSA.

Plaque a continuación las células disociadas en un recipiente. Deje que las células se asienten durante al menos cinco minutos. Después de eso, coloque el recipiente con las células disociadas bajo un microscopio invertido.

Utilice una pipeta de punta fina con un tubo aspirador para recolectar una sola célula. Luego coloque la micropipeta cerca de la célula y esta entrará fácilmente en la micropipeta mediante acción capilar. Posteriormente, expulse la célula en un segundo recipiente y asegúrese de que solo se recolecte una célula para el perfilado de expresión génica.

Esto se realiza eliminando células extrañas o moviendo la célula de interés a una ubicación diferente con una nueva micropipeta. Cuando una célula individual está completamente aislada de las células vecinas, utilice una nueva micropipeta para aspirar la célula de interés. A continuación, expúlsela directamente en un tubo de PCR de 0,2 mililitros que contenga 4,5 microlitros de tampón de lisis celular.

Centrifugar brevemente la muestra en una microcentrífuga para sumergir la célula en tampón de lisis. Realizar esta centrifugación después de cada quinta célula y nuevamente al final de la recopilación. Recordar mantener el tubo en hielo durante todo el aislamiento de células individuales y recolectar las células individuales dentro de una ventana de dos horas posteriores a la disociación para obtener resultados óptimos en este procedimiento; centrifugar brevemente la muestra en una microcentrífuga para asegurar que la célula individual quede sumergida en el tampón de lisis celular.

Para favorecer la lisis celular, incube la muestra a 70 grados Celsius durante 90 segundos en un termociclador. Luego coloque inmediatamente el tubo de vuelta en hielo durante dos minutos. Para realizar la transcripción inversa, agregue 0,33 microlitros.

Superscript tres a 200 unidades por microlitro, 0,05 microlitros de inhibidor a 40 unidades por microlitro y 0,07 microlitros. T cuatro proteína del gen 32 al tubo. Incube la mezcla de reacción durante 50 minutos a 50 grados Celsius en un termociclador; tras 50 minutos, inactivar la enzima a 70 grados Celsius durante otros 15 minutos.

Una vez hecho esto, coloque el tubo nuevamente en hielo. Para eliminar el cebador libre, agregue 0,1 microlitros de tampón 10 x exonucleasa, 0,8 microlitros de H2O y 0,1 microlitros de exonucleasa, uno a 20 unidades por microlitro, al tubo incubado a 37 grados Celsius durante 30 minutos en un termociclador.

Después de 30 minutos, inactivar la enzima incubando la mezcla de reacción a 80 grados Celsius durante 25 minutos. Al final, colocar el tubo nuevamente en hielo. A continuación, añadir seis microlitros de la mezcla de reacción de poliadenilación a la muestra.

Incubarlo en el termociclador a 37 grados Celsius durante 20 minutos, a 70 grados Celsius durante 10 minutos y luego mantenerlo a cuatro grados Celsius. Posteriormente, agregar 10 microlitros de la muestra con cola a la mezcla de reacción de PCR. Realizar la síntesis de la segunda cadena y la amplificación por PCR para etiquetar el ADNc.

Con el fin de obtener una hibridación robusta en microarreglos iMatrix, primero fragmente el ADN cDNA añadiendo de 10 a 20 microlitros del ADN cDNA de célula individual a ocho microlitros de tampón uno x uno para todos. Luego, añada un microlitro de este ADN diluido a una solución de reacción de 80 microlitros. A continuación, añada 20 microlitros de tampón cinco XTDT, 2,5 microlitros de biotina, seis D-D-A-T-P y un microlitro de TDT diluido.

A continuación, agregue 20 microlitros de tampón XTDT, 2,5 microlitros de biotina, seis D-D-A-T-P y un microlitro de TDT. Incube la mezcla durante 90 minutos a 37 grados Celsius. Luego, durante cinco minutos a 65 grados Celsius.

Posteriormente, almacénelo a menos 20 grados Celsius o hibridícelo inmediatamente a un microarreglo a iMatrix. A continuación, se muestra un ejemplo representativo de manchas de ADNc de una sola célula y carriles de PCR específicos para genes: los carriles A-F-G-N-H contienen manchas de ADNc robustas, mientras que los carriles B, C, D y E son considerablemente menos robustos. Los ADNc se aislaron de células ganglionares retinianas fluorescentes y luego se analizaron mediante cebadores de PCR específicos para los marcadores de células ganglionares retinianas, BRN tres B y PAC seis, y PCR específica para el marcador de fotorreceptores.

CRX se utilizó para determinar el nivel de contaminación en la célula individual. Los ADNc y subconjuntos de células ganglionares de la retina se identificaron mediante el análisis de la presencia del gen tachykinin uno. Los resultados de microarreglos para genes seleccionados expresados en 22 células individuales distintas se muestran en un formato de mapa de calor.

Las intensidades de las señales de la matriz se han escalado para corresponder a la intensidad del color rojo, mientras que el negro indica la ausencia de señal en la matriz. Tras este procedimiento, se pueden utilizar métodos adicionales, como la QPCR, para confirmar el patrón de expresión génica observado en la micromatriz. Los resultados de la hibridación C también pueden utilizarse para responder preguntas adicionales que pueda tener sobre la localización de células que expresan genes particulares.

Después de ver este video, debería tener una idea bastante clara de cómo disociar retinas, aislar células individuales y generar ADNc a partir de esas células individuales, para hibridación en microarreglo.