Una sola célula de perfiles de neuronas de la retina en desarrollo y maduro
April 19th, 2012
Un método para el aislamiento de células de la retina individuales y la amplificación posterior de sus ADNc se describe. Una sola célula de la transcriptómica revela el grado de heterogeneidad presente celular en un pañuelo de papel y descubre nuevos genes marcadores de poblaciones celulares raras. El protocolo de acompañamiento se puede ajustar para adaptarse a diferentes tipos de células.
El objetivo general de este procedimiento es aislar células individuales para el análisis de transcriptoma basado en microarrays. Esto se logra diseccionando primero la retina del tejido circundante y luego disociándola en células individuales. El segundo paso es recolectar células individuales y depositarlas en tubos de PCR que contienen tampón de lisis.
A continuación, las células se lisan y el ADNC se amplifica mediante transcripción inversa, seguida de una reacción en cadena de la polimerasa. En última instancia, la hibridación de la CD NA de una sola célula en un microarray A iMatrix se utiliza para revelar los ARNm expresados en una sola célula. La principal ventaja de perfilar la expresión génica en células individuales en comparación con el uso de enfoques de tejido completo es que el aislamiento de una sola célula le permite acceder a poblaciones muy pequeñas de células que comprenderían todo el tejido.
Estas células pueden ser cualquier cosa, desde diferentes tipos de neuronas hasta pequeñas poblaciones de células madre. Lo que la técnica de una sola célula nos permite hacer para estas células es identificar ambos tipos de células, marcadores específicos para estas pequeñas poblaciones de células, e identificar redes de genes que se expresan en estos subconjuntos extremadamente raros de células. Además, la técnica de perfil de una sola célula nos permite identificar las redes de genes que se expresan transitoriamente durante transiciones de desarrollo muy dinámicas en subconjuntos muy pequeños de células.
Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la genética del desarrollo, como cuándo las células progenitoras comienzan a expresar redes de genes asociadas con la diferenciación y cómo esas células progenitoras difieren entre sí. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia las terapias celulares para enfermedades neurodegenerativas como el glaucoma, ya que al dilucidar las redes clave en el desarrollo de células individuales estamos un paso más cerca de poder generar esas células para su uso en la terapia de reemplazo celular. Comience este procedimiento colocando la retina del ratón en un plato lleno de PBS.
A continuación, retire el vítreo y la lente. A continuación, retira todo el epitelio pigmentario de la retina. Incubar la retina en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros a 37 grados centígrados durante 10 minutos.
Después, golpee suavemente el tubo para desalojar las células sedimentadas. A continuación, trifique suavemente, de 10 a 20 veces con una pipeta P 1000. Si persisten grandes grupos de tejido, incube durante 10 minutos adicionales a 37 grados centígrados y refrigérelo de 10 a 20 veces.
A continuación, añade cinco microlitros de ADN, uno de 10 unidades por microlitro a la retina, e incuba durante cinco minutos. A temperatura ambiente, vuelva a puntuarlo suavemente con la pipeta P 1000 otras 10 a 20 veces después. Centrifugar a 3000 RPM durante tres minutos.
Luego retire el sobrenadante y deje de 100 a 200 microlitros de líquido en el fondo. Golpee el tubo para desalojar el pellet. A continuación, agregue un mililitro de HBSS y vuelva a suspender el pellet con tación suave.
Centrifugar a 3000 RPM durante tres minutos. Cuando esté listo, retire con cuidado el sobrenadante. Luego resus, suspenderlo en 450 microlitros de PBS que contiene 0.1%BSA en el siguiente paso, prepare dos platos de seis centímetros que contienen cinco mililitros de PBS suplementado con 0.1%BSA.
En la siguiente placa, las células disociadas en una sola placa. Deje que las células se asienten durante al menos cinco minutos. Después de eso, coloque el plato de células disociadas bajo un microscopio invertido.
Utilice una pipeta de punta fina con un tubo aspirador para recolectar una sola célula. A continuación, coloque la micropipeta cerca de la célula y entrará fácilmente en la micropipeta mediante una acción capilar. Posteriormente, expulse la célula a una segunda placa y asegúrese de que solo se recoja una célula para el perfil de expresión génica.
Esto se hace mediante la eliminación de células extrañas o moviendo la célula de interés a una ubicación diferente con una nueva micropipeta. Cuando una célula individual esté completamente aislada de las células vecinas, utilice una nueva micropipeta para aspirar la célula de interés. A continuación, expúlselo directamente a un tubo de PCR de 0,2 mililitros que contenga 4,5 microlitros de tampón de lisis celular.
Haga girar la muestra brevemente en una microcentrífuga para sumergir la célula en tampón de lisis. Haga esto girando después de cada quinta celda y luego nuevamente al final de la recolección. Recuerde mantener el tubo en hielo durante la duración del aislamiento de una sola célula y recoger las células individuales dentro de una ventana de dos horas después de la disociación para obtener resultados óptimos en este procedimiento, haga girar brevemente la muestra en una microcentrífuga para asegurarse de que la célula individual esté sumergida en el tampón de lisis celular.
Para promover la lisis celular, incube la muestra a 70 grados centígrados durante 90 segundos en un termociclador. A continuación, vuelva a colocar el tubo en hielo durante dos minutos. Para realizar la transcripción inversa, agregue 0,33 microlitros.
Superíndice tres a 200 unidades por microlitro, 0,05 microlitros inhibidor a 40 unidades por microlitro y 0,07 microlitros. Proteína T cuatro gen 32 al tubo. Incubar la mezcla de reacción durante 50 minutos a 50 grados centígrados en un termociclador después de 50 minutos, inactivar la enzima a 70 grados centígrados durante otros 15 minutos.
Una vez hecho esto, vuelva a colocar el tubo en hielo. Para eliminar la imprimación libre, agregue 0,1 microlitros, 10 x tampón exonucleasa, 0,8 microlitros, D H2O y 0,1 microlitros. Exonucleasa, una a 20 unidades por microlitro al tubo incubado a 37 grados centígrados durante 30 minutos en un termociclador.
Después de 30 minutos, inactive la enzima incubando la mezcla de reacción a 80 grados centígrados durante 25 minutos. Al final, vuelva a colocar el tubo en hielo. A continuación, agregue seis microlitros de la mezcla de reacción de relaves a la muestra.
Incubarlo en el termociclador a 37 grados centígrados durante 20 minutos, a 70 grados centígrados durante 10 minutos y luego mantenerlo a cuatro grados centígrados. Posteriormente, agregue 10 microlitros de la muestra con cola a la mezcla de reacción de PCR. Realice la síntesis de la segunda cadena y la amplificación por PCR para marcar CDNA.
Con el fin de obtener una hibridación robusta en un microarray iMatrix, primero fragmente el CD NA agregando de 10 a 20 microlitros del CD NA de una sola celda a ocho microlitros, uno x uno para todos los tampones. A continuación, añada un microlitro de este ADN diluido a una solución de reacción de 80 microlitros. A continuación, agregue 20 microlitros, cinco tampones XTDT, 2,5 microlitros de biotina y seis D-D-A-T-P y un TDT diluido de microlitros.
A continuación, añádele 20 microlitros, cinco tampones XTDT, 2,5 microlitros, biotina y seis D-D-A-T-P y un TDT de microlitros. Incubar la mezcla durante 90 minutos a 37 grados centígrados. Luego cinco minutos a 65 grados centígrados.
Posteriormente, guárdelo a menos 20 grados centígrados o hibridéelo inmediatamente en un microarray iMatrix. Este es un ejemplo representativo de frotis de CD NA de una sola célula y PCR específicas de genes: los carriles A-F-G-N-H contienen frotis de CD NA robustos, mientras que los carriles B, C, D y E son considerablemente menos robustos. Los CDNA se aislaron de células ganglionares fluorescentes de la retina y luego se probaron utilizando cebadores de PCR específicos para los marcadores de células ganglionares de la retina, BRN tres B y PAC seis, PCR específica del gen para el marcador fotorreceptor.
Se utilizó CRX para determinar el nivel de contaminación en la celda individual. Los ADNc y los subconjuntos de células ganglionares de la retina se identificaron mediante el cribado para detectar la presencia del gen taquicina uno. Los resultados de los microarrays para genes seleccionados expresados en 22 células individuales distintas se muestran en un formato de mapa de calor.
Las intensidades de las señales del microarray se han escalado para que correspondan a la intensidad del color rojo, mientras que el negro indica la ausencia de señal en el microarray. Después de este procedimiento, se pueden utilizar métodos adicionales, como la QPCR, para confirmar el patrón de expresión génica observado en la microrradiografía. Los resultados de la hibridación C también se pueden usar para responder preguntas adicionales que pueda tener sobre la ubicación de las células que expresan genes particulares.
Después de ver este video, debería tener una idea bastante clara de cómo disociar las retinas, aislar células individuales y generar CDNA a partir de esas células individuales. Para hibridación en microarray.
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Visión general
Este artículo describe un método para aislar células retinianas individuales y amplificar sus cDNAs para el análisis transcriptómico. La técnica permite a los investigadores explorar la heterogeneidad celular e identificar genes marcadores para poblaciones celulares raras.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Genética
Antecedentes
- La transcriptómica de células individuales proporciona información sobre la diversidad celular.
- Entender la expresión génica en células individuales es crucial para la genética del desarrollo.
- Este método puede revelar redes génicas transitorias durante el desarrollo.
- Tiene implicaciones para las terapias celulares en enfermedades neurodegenerativas.
Propósito del estudio
- Aislar células retinianas individuales para un perfil detallado de expresión génica.
- Identificar marcadores específicos para pequeñas poblaciones de células.
- Elucidar redes génicas involucradas en la diferenciación celular.
Métodos utilizados
- Disección de la retina y disociación en células individuales.
- Lisi celular y amplificación de cDNA mediante transcripción inversa y PCR.
- Hibridación en microarrays para analizar la expresión de mRNA.
- Aislamiento de células individuales usando una pipeta de punta fina.
Principales resultados
- Aislamiento exitoso de células retinianas individuales para el análisis transcriptómico.
- Identificación de perfiles de expresión génica en poblaciones celulares raras.
- Insitios en transiciones del desarrollo en tipos celulares específicos.
- Aplicaciones potenciales en la comprensión de enfermedades neurodegenerativas.
Conclusiones
- El método mejora la comprensión de la heterogeneidad celular.
- Proporciona un marco para estudiar la expresión génica en pequeñas poblaciones celulares.
- La investigación futura podría aprovechar esta técnica para avances terapéuticos.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Single-cell transcriptomic profiling of retinal neurons enables biopharma teams to resolve cellular heterogeneity and identify rare cell populations critical for CNS target validation. This approach enhances predictive confidence in early discovery by revealing gene networks and markers that are masked in bulk tissue analyses. The method supports risk-adjusted portfolio decisions by clarifying developmental transitions and cell fate determinants relevant to neurodegenerative disease research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables identification of cell-type specific markers in rare neuronal subsets for functional target validation.
- Reveals gene expression programs active during transient developmental transitions, supporting mechanistic de-risking.
- Facilitates molecular classification of neuronal cell types, improving predictive confidence in target selection.
Screening & Assay Development
- Prepares validated single-cell gene expression profiles for downstream assay development and screening workflows.
- Supports assay reproducibility by enabling quantitative measurement of mRNA expression in individual cells.
- Allows for the detection of contamination and specificity through gene-specific PCR validation of isolated cells.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by elucidating gene networks implicated in neurodegenerative disease models.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by mapping developmental gene expression trajectories.
- Supports identification of candidate genes for cellular therapy development in CNS disorders.
Pipeline & Workflow Integration
This single-cell profiling method integrates at the interface of early discovery and preclinical research, bridging hypothesis-driven target validation with translational biomarker identification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by resolving heterogeneity and clarifying gene networks in rare cell types.
- Screening: Delivers quantitative, cell-specific gene expression data for assay standardization and reproducibility.
- Analytics: Provides microarray and PCR-based readouts to compare gene expression across individual cells and conditions.
- Translational Research: Enables mapping of developmental gene expression relevant to disease modeling and biomarker discovery.
- Enterprise Reuse: Adaptable protocol for profiling diverse tissues and cell types across R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Standardizes single-cell isolation and transcriptomic analysis for reproducible, scalable workflows.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by clarifying cell fate determinants and gene networks in rare populations.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets and candidate genes for neurodegenerative disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-cell isolation, microarray analysis, and quantitative PCR.
- Demands access to specialized instrumentation for cell handling and transcriptomic profiling.
- Necessitates rigorous cross-team standardization to ensure reproducibility and data comparability.
- Protocol is adaptable to various tissues but may require optimization for different cell types or developmental stages.
- Potential limitations include technical variability in cell capture and amplification efficiency.
