Name: La medición de la quimiotaxis celular con ECIS / taxis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-01T11:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Aprende a medir la quimiotaxis celular en tiempo real con el sistema ECIS/Taxis utilizando sensores de impedancia eléctrica. Este método automatizado permite observar el movimiento celular hacia electrodos objetivo mediante cambios en la resistencia.

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Este trabajo fue apoyado por becas de los Institutos Nacionales de Salud (ES07408 y EB00208).

1. ECIS / taxis Preparación de electrodos <ol><li> La superficie de oro de la matriz de electrodos ECIS / taxis (que consta de 8 cámaras por diapositiva) se estabiliza por primera pre-tratamiento con cisteína estéril 10 mM en agua desionizada (dH 2 O) durante 15 min a temperatura ambiente bajo condiciones estériles. </li><li> Aspirar la solución de cisteína de cada cámara de electrodo, enjuagar 3 veces con agua estéril O dH 2, y reemplazar con 250 l de medio completo (RPMI 1640, FBS al 10%, 25 mM de tampón HEPES). </li><li> Conecte el conjunto de electrodos en contacto con alfileres en tenedor del instrumento matriz para realizar la comprobación de los electrodos. </li><li> Cámaras que estén debidamente conectadas se resaltan en verde en la pantalla del ordenador. Si las cámaras se resaltan en rojo, no están conectados y los electrodos se deben volver a colocar en el titular de la matriz para establecer contactos para todas las cámaras. </li><li> Una vez que todas las cámaras están conectadas, haga clic en el botón "Check" en el controlador de software para disuadir a losminar la resistencia inicial y los valores de capacitancia para cada cámara. Los valores de resistencia debe ser de entre 1600 y 2000 ohmios, y los valores de capacitancia debe ser de entre 5 y 6 nanofaradios para una matriz de la cámara 8. Si una cámara no está dentro de estos parámetros aceptables, la cámara individual no debe ser utilizado para recoger datos. </li><li> Desconecte el electrodo de soporte de serie para preparar las cámaras individuales de agarosa. Aspirar el medio de las cámaras y lave cada cámara de 3 veces con agua estéril dH 2 O. </li></ol> 2. Preparar agarosa Cámaras <ol><li> En un tubo de polipropileno estéril de 15 ml cónico, medida de 0,03 g de Seakem GTG agarosa y se añade 1 ml de PBS estéril. Colocar la tapa del tubo sin apretar, y fundir la agarosa en autoclave durante un ciclo de 2 minutos líquido (punto de fusión en un horno de microondas no es eficaz para este ensayo). Este breve periodo de tiempo no se derrita el tubo cónico. Para las células menos exigentes que no requieren suero para el cultivo, (por ejemplo Dictyostelium discoideum) 0,5%agarosa se puede hacer en el medio apropiado y se fundió en un horno de microondas. El autoclave es necesario para las células que requieren suero, ya que esto se desnaturalizó si fundió en horno de microondas. </li><li> Añadir 5 ml de medio RPMI completo calentó en un baño de agua (55 ° -60 ° C) directamente a la agarosa caliente, a una concentración final de 0,5% de agarosa y pipeta hacia arriba y hacia abajo suavemente para mezclar. </li><li> Pipetear 300 l de medio de agarosa derretida en cada cámara, vuelva a colocar los ECIS / cobertura amplia taxis y permita que el gel a la temperatura ambiente. </li><li> Pipetee restante de agarosa en la tapa del tubo de 15 ml para evaluar gelificante agarosa. Este exceso de agarosa se utilizará también en la parte 4: Cortar en los pozos de agarosa. </li></ol> 3. La construcción y afilado de la cánula de herramientas de corte bien <ol><li> Afilar dos cánulas de calibre 14 extremo romo, utilizando un 5/64 "bits. Girar la punta de la broca en cada abertura de la cánula con un taladro de velocidad lenta, asegurándose de que la broca corta borde entero interior de cada op cánuladatorio formar un borde de corte afilado (Figura 4A). </li><li> Haga dos agujeros a través de 1 "x 2" x ¼ "de plexiglás (Figura 4B-D) con un 5/64" en una prensa de taladro. Inserte cada afilado cánula de calibre 14 por lo que sobresale a la misma distancia a través de cada agujero de plexiglás. </li></ol> 4. Corte de Wells en agarosa <ol><li> Esterilizar las cánulas de calibre 14 por la ligera llama de la punta. Antes de cortar los pozos en la cámara de ECIS, permitir que la cánula se enfríe a temperatura ambiente, o enfriar las cánulas tocando la agarosa en el tapón del tubo de 15 ml. Si la temperatura de la cánula es demasiado alta, la agarosa se derretirá como los pozos de cámara se cortan, haciendo que los pozos deforme y defectuoso. </li><li> Alinear el par cánula por encima de los dos puntos de oro que rodean el electrodo de destino en cada cámara (Figura 2c y 5). Insertar la cánula verticalmente, sin ningún tipo de movimiento horizontal, deteniéndose en contacto suave entre la cánula yla superficie del electrodo. Retire con cuidado la cánula, de nuevo sin ningún tipo de movimiento horizontal. La colocación de pozos adicionales para oponerse a gradientes también es posible con una reconfiguración de la plantilla cánula. </li><li> Suavemente aspirar el tapón de agarosa dejado por la cánula, utilizando un estéril 9 "pipeta Pasteur, conectado a presión bajo vacío, con una trampa de vacío atrapar los residuos de agarosa. </li><li> Añadir 300 l de medio RPMI completo a la superficie de cada cámara a 37 ° C, durante 2 minutos para saturar la agarosa, y luego suavemente aspirar los medios de comunicación desde la superficie y los pozos sin perturbar la agarosa. </li></ol> 5. Carga de la Wells <ol><li> Cada bien es capaz de contener un volumen de 7 l. Para un pozo en cada cámara, añadir 7 l de suspensión de células. Para células Jurkat T, use 2 x 10 7 células / ml. Estas células responden a 7 l de 200 ng / ml SDF-1α diluida en RPMI incompleto, que carece de suero. Utilice los medios de comunicación completos solo como un cont negativorol. </li><li> Después de que los pozos se cargan, ver cada cámara de la matriz con un microscopio invertido para asegurar que todos los pocillos se cortaron y se llena apropiadamente. Las células deben estar en dentro de los confines de los límites del pozo. Si se ven tanto en los pozos, o se están extendiendo más allá del borde de la celda y, a continuación, una brecha se ha formado bajo la agarosa. Tenga en cuenta los pozos mal configurada, ya que los datos no pueden ser interpretados de forma fiable a partir de esas cámaras. </li></ol> 6. Recopilación de datos <ol><li> Coloque el electrodo en el soporte de la matriz y volver a conectar los electrodos de oro en la matriz de electrodos a los pines pogo resorte del titular y haga clic en "Configuración". Los pozos que estén debidamente conectadas se resaltan en color verde. Si los pozos son de color rojo, que no están conectados y el electrodo debe ser recolocado en el soporte de matriz. </li><li> Seleccione "8WE1" (8 y 1 electrodo) desde el menú desplegable en el panel de software para indicar la configuración de la matriz. </li><li> Seleccione "Buscar" en el software de contrPanel ol para determinar la resistencia inicial y los valores de capacitancia para cada pocillo. Los valores de resistencia debe estar entre 1600 y 2000 ohmios, mientras que los valores de capacidad debe ser de entre 5 y 6 nanofarads. </li><li> Seleccione múltiples frecuencias para medir la resistencia a distintas frecuencias. Hay una opción de personalización de frecuencias, o utilizando un conjunto de frecuencias recomendadas. Los valores estándar de múltiples frecuencias de adquisición de la captura de datos en 11 frecuencias preestablecidas (52.5, 125, 250, 500, 1.000, 2.000, 4.000, 8.000, 16.000, 32.000 y 64.000 Hz) a una velocidad de 8 pozos por minuto. El intervalo de tiempo entre las mediciones también se pueden personalizar. La recopilación de datos de múltiples frecuencias permite el análisis de la capacitancia, impedancia y resistencia. Recopilación de los valores de resistencia a 4.000 Hz suele ser suficiente para los estudios de células de mamíferos quimiotaxis, pero las frecuencias adicionales puede proporcionar información en otros contextos 12,13. </li><li> Duración de la prueba total se puede establecer, en la mano derechapanel, o el experimento se puede detener manualmente, haciendo clic en "Finalizar" una vez que las células han desarrollado cierta resistencia que son indicativos de la llegada al electrodo. El tiempo que tarda para que las células llegan a la electrodo depende del tipo de célula utilizado. </li><li> Haga clic en "Inicio" para iniciar la recolección de datos. </li></ol> 7. Gestión de Datos <ol><li> Aunque los datos pueden ser exportados a Excel, el software de ECIS 1600R, que acompaña al sistema de ECISθ es el método más eficiente para analizar los datos de ECIS / taxis. </li><li> Los datos de software de análisis de barra de herramientas contiene los botones de radio Z, R y C. Se trata de determinar si la impedancia, la resistencia o capacitancia, respectivamente, se representa en el eje vertical contra el eje x (tiempo transcurrido). </li><li> ECIS / taxis de datos es más eficiente se demuestra como resistencia en el tiempo a 4.000 Hz. Las fluctuaciones rápidas de la resistencia, o microtransients (Figura 1), son una muestra del movimiento celular sobre el electrodo. Compilar, ohurgar en la basura r los puntos de datos a fin de que no todos los puntos se grafican, no se recomienda para ECIS / taxis, ya que microtransients promedio de los datos. </li><li> Una vez que el gráfico ha sido realizado con el software ECIS1600R, que pueden ser exportados por la elección de "gráfico de exportación" en el menú archivo, y se guarda como un archivo. Tif o. Jpg. </li></ol> 8. Los resultados representativos Cellular quimiotaxis es indicado por un aumento en la resistencia a 4.000 Hz. La llegada de las células en el electrodo de destino también está indicada por la aparición de fluctuaciones rápidas en la resistencia llamados microtransients o micromovimiento como se describe en Opp et. al., 2009 (Figura 1) 14. Un resultado negativo se indica por coherente, o un ligero descenso, en la resistencia a 4.000 Hz, como se ve en rojo en la Figura 1. La ausencia de microtransients es también un signo de una ausencia de movimiento de las células hacia el electrodo. El aumento de la resistencia es directamenteproporcional al número de las células que atraviesan el electrodo 10. La adición de anticuerpo monoclonal específico para un quimioatrayente o toxinas conocidas para interferir con los receptores acoplados a proteínas G pueden bloquear la quimiotaxis 11. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig1.jpg"> Figura 1. La quimiotaxis de células Jurkat T humanos en respuesta a SDF1α. Las células Jurkat T (2.0x10 6 células / ml) fueron expuestos a un gradiente de SDF-1α (a partir de la concentración de 100 ng / ml) o medio RPMI 1640 como un control negativo. La resistencia normalizada a 4000 Hz se graficó. Humanos células Jurkat T movido en respuesta a SDF-1α, como lo demuestra el aumento de la resistencia y microtransients, mientras que ningún movimiento se observó con la exposición a RPMI 1640. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig2.jpg"> Figura 2. Vista superior de un electrodo ECIS / taxis without agarosa. Cada electrodo ECIS / taxis está formado por 8 cámaras individuales. Cada cámara comparte un electrodo grande (una), y contiene un electrodo objetivo individual (b). Cada cámara también cuenta con 2 círculos de oro (c), que se utilizan como guía para cortar los pozos de la agarosa con las cánulas. Los cuadrados de oro (d) son las superficies de contacto que se conectan a los pasadores pogo con el fin de aplicar la corriente alterna al electrodo. Los electrodos objetivo individuales son cada uno en circuito con el electrodo contador mayor (e). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig3.jpg"> Figura 3. Dos pocillos se corta en cada cámara de agarosa-llenado. Cuando el quimioatrayente se añade a un bien se difunde para crear un gradiente en la agarosa, con la mayor concentración de chemoattract más cercano al quimioatrayente bien. Las células se desplazan por debajo de la agarosa hacia mayores concentraciones de quimioatrayente y puede pasar sobre el electrodo de destino. Comolas células cruzar el electrodo de destino, un aumento de la resistencia es registrado por el software ECIS 1600R. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig4.jpg"> Figura 4. La inserción de dos cánulas de calibre 14 en plexiglás. A) A, B 5/64 "broca se utiliza para afilar la punta de la cánula.) Dos agujeros deben ser perforados en metacrilato para dar cabida a las cánulas de calibre 14 de acuerdo con el disparo de diseño. C) Use un taladro para asegurar que los agujeros son perpendiculares a la superficie pleixglass. D) Dos cánulas afilado se insertan a través de ¼ "de plexiglás, 2 mm de distancia (medida desde el borde interior). Estas cánulas afilado son cuidadosamente insertado en agarosa para cortar los pozos. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig5.jpg"> Figura 5. Alineación de cánulas con puntos de oro en el ECIS / taxis de la cámara. Para cortar los pozos, la cánula debe afiladoestar alineados con los puntos de oro que flanquean el electrodo de destino en el fondo de la cámara ECIS / taxis. La cánula se debe insertar verticalmente, sin ningún tipo de movimiento horizontal, y se retira de la misma manera.

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</ol>

David A Knecht y Michael A Lynes tienen una patente concedida por la tecnología ECIS / taxis, la cual ha sido licenciada por la Universidad de Connecticut para Biofísica Aplicada, Inc.

Nuevas características de la prueba de ECIS / taxis incluyen su capacidad de automatizar la recopilación de datos en tiempo real, como las células responden a quimioatrayente. Aunque la aplicación más común de esta tecnología consiste en medir la respuesta celular a los gradientes quimiotácticos individuales, o de los gradientes de compuestos de mezclas de agonistas y antagonistas de la quimiotaxis, el enfoque de ECIS / taxis también es susceptible a las modificaciones de estas configuraciones que pueden ser muy útiles ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre de Reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> ECIS Zθ </td><td> Biofísica Aplicada </td><td></td><td> <a href="http://www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php">http://www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php</a> </td></tr><tr><td> ECIS conjunto de electrodos </td><td> Biofísica Aplicada </td><td> 8W quimiotaxis </td><td> <a href="http://www.biophysics.com/cultureware.php">http://www.biophysics.com/cultureware.php</a> </td></tr><tr><td> Seakem GTG agarosa </td><td> BioWhittaker Molecular de aplicaciones </td><td> 50070 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI1640 </td><td> Cellgro </td><td> 10-040 </td><td></td></tr><tr><td> HyClone de suero fetal bovino </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH300703 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin / estreptomicina </td><td> MP Biomedicals </td><td> 1670049 </td><td> La penicilina 5.000 UI / ml; estreptomicina 5 mg / ml </td></tr><tr><td> Tampón HEPES </td><td> MP Biomedicals </td><td> 1688449 </td><td> Solución 1 M, célula grado cultura </td></tr><tr><td> 14 Gauge cánula de acero inoxidable (2) 4 pulgadas </td><td> Laboratorio General de Abastecimiento </td><td> 5-8365-1 </td><td> Punta roma </td></tr></tbody></table>

la medición de la quimiotaxis celular con ecis / taxis

Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

El movimiento celular en respuesta a los estímulos externos es fundamental para muchos procesos celulares, incluyendo la cicatrización de heridas, la inflamación y la respuesta a la infección. Un método común para medir la quimiotaxis es el ensayo de la cámara de Boyden, en el cual las células y quimioatrayentes están separados por una membrana porosa. Como las células migran a través de la membrana hacia el quimioatrayente, se adhieren a la parte inferior de la membrana, o una caída en los medios de comunicación subyacentes, y posteriormente se tiñeron y visualmente contado 1. En este método, las células se exponen a un gradiente quimioatrayente empinada y transitorios, que se piensa que es una representación pobre de gradientes encontrados en tejidos 2. Otro sistema de ensayo, el bajo-agarosa quimiotaxis ensayo, 3, 4 movimiento de las células medidas a través de un sustrato sólido en una delgada película acuosa que forma bajo la capa de agarosa. El gradiente que se desarrolla en la agarosa es poco profunda y se piensa que es una aplicaciónropriate representación de origen natural gradientes. La quimiotaxis puede ser evaluada por la imagen microscópica de la distancia recorrida. Tanto el ensayo de la cámara de Boyden y el ensayo de bajo-agarosa se suelen configurar como ensayos de punto final. El sistema automatizado de ECIS / taxis sistema combina el enfoque de menores de agarosa con detección de impedancia eléctrica de la célula-sustrato (ECIS) 5, 6. En este ensayo, los electrodos de destino se encuentra en cada una de 8 cámaras. Una gran contra-electrodo se ejecuta a través de cada una de las cámaras 8 (Figura 2). Cada cámara está llena de agarosa y dos pozos pequeños son el corte en la agarosa a cada lado del electrodo de destino. Uno así se llena con la población de células de prueba, mientras que el otro tiene las fuentes de quimioatrayente difusora (Figura 3). Actual pasa a través del sistema se puede utilizar para determinar el cambio en la resistencia que se produce como células pasan sobre el electrodo de destino. Las células en el objetivo electrode incrementar la resistencia del sistema 6. Además, las rápidas fluctuaciones en la resistencia representan cambios en las interacciones de las células con la superficie del electrodo y son indicativos de cambios en la forma en curso celulares. El sistema ECIS / taxis pueden medir el movimiento de la población celular en tiempo real durante períodos prolongados de tiempo, pero también es lo suficientemente sensible para detectar la llegada de una sola célula en el electrodo de destino. Dictyostelium discoidium se sabe que migran en presencia de un gradiente de folato 7, 8 y su respuesta quimiotáctica puede medir con precisión por ECIS / taxis 9. Quimiotaxis de los leucocitos, en respuesta a SDF1α y antagonistas de quimiotaxis También se ha medido con ECIS / taxis 10, 11. Un ejemplo de la respuesta de leucocitos a SDF1α se muestra en la Figura 1.

El sistema de ECIS / taxis es un sistema automatizado en tiempo real, análisis que mide la quimiotaxis celular. En este ensayo, las células se mueven por debajo de una capa de agarosa para llegar a un electrodo de destino. Movimiento celular se mide por la aparición de resistencia a 0 corriente alterna.

La medición de la quimiotaxis celular con ECIS / taxis

El movimiento celular en respuesta a estímulos externos es fundamental para muchos procesos celulares, incluyendo la cicatrización de heridas, la inflamación y la respuesta a...

El objetivo general de este procedimiento es medir la quimiotaxis en un ensayo automatizado en tiempo real, que utiliza la detección impedimétrica celular por sustrato eléctrico, o EISs. Esto se logra primero preparando los electrodos axxis llenando cada cámara con agaros al 0,5 % en medio RPMI completo. El siguiente paso consiste en cortar simultáneamente dos pozos en el agaros de cada cámara con una plantilla de cánula de calibre 14 y aspirar los dos tapones de agaros de cada cámara.Un pocillo se llena con una suspensión simple de células, mientras que el otro se llena con un quimioatractante. A continuación, el electrodo se conecta al sistema ISIS theta mediante el soporte de matriz que se coloca en una incubadora ajustada a los parámetros atmosféricos adecuados para el tipo de célula que se está analizando. Finalmente, la quimiotaxis celular puede observarse midiendo el cambio en la resistencia en tiempo real a medida que las células alcanzan el electrodo objetivo entre los dos pocillos.La principal ventaja del ensayo axxis frente a métodos existentes como el ensayo de cámara de Boyden o los ensayos convencionales bajo agaros basados en microscopio es que permite mediciones automatizadas en tiempo real del quimiotaxismo sin necesidad de manipulaciones continuas del sistema. Para comenzar la preparación de los electrodos, estabilice la superficie de oro del arreglo de electrodos ISIS Texas mediante un pretratamiento con 10 milimolares de cisteína estéril en agua desionizada durante 15 minutos a temperatura ambiente bajo condiciones estériles. Tras el pretratamiento, aspire la solución de cisteína de cada cámara de electrodo.Lave tres veces con agua desionizada estéril y sustitúyala por 250 microlitros de medio completo. A continuación, conecte la matriz de electrodos a los pines de contacto del soporte de la matriz del instrumento para realizar una verificación de los electrodos. Las cámaras correctamente conectadas se resaltarán en verde en la pantalla del ordenador.Si las cámaras están resaltadas en rojo, no están conectadas, y el electrodo debe reposicionarse en el soporte de la matriz para establecer contactos en todas las cámaras. Una vez que todas las cámaras estén conectadas, haga clic en el botón de verificación en el controlador del software ISYS Theta para determinar los valores iniciales de resistencia y capacitancia de cada cámara; los valores de resistencia deben estar entre 1600 y 2000 ohmios, y los valores de capacitancia deben estar entre cinco y seis nanos para una matriz de ocho cámaras. Si una cámara individual no se encuentra dentro de estos parámetros aceptables, no debe utilizarse para recopilar datos.A continuación, desconecte el electrodo del soporte de matriz para preparar las cámaras individuales de aros. Aspire el medio de las cámaras y lave cada cámara tres veces con agua desionizada estéril. Para comenzar el montaje de las cámaras de aros, prepare una solución de aros que contenga medio RPMI, como se describe en el protocolo escrito.Pipetee 300 microlitros de medio aros fundido en cada cámara, pipetee el agros restante en la tapa de un tubo de 15 mililitros. Para evaluar la gelificación del agros, reemplace la tapa del arreglo ISIS axxis y deje que se gelifique a temperatura ambiente para construir la cánula reutilizable. Afilar la herramienta de corte con dos cánulas romas de calibre 14.Utilizando una broca de cinco 64avos de pulgada, gire la punta de la broca en cada abertura de la cánula con una taladradora de baja velocidad, asegurándose de que la broca corte todo el borde interior de cada abertura de la cánula. Para formar un filo cortante, taladre dos orificios a través del plexiglás con una broca de cinco 64avos de pulgada. Utilizando una taladradora de banco, inserte cada cánula de calibre 14 afilada en uno de los orificios de manera que todas sobresalgan a la misma distancia del plexiglás.Sterilice la herramienta de cánula de calibre 14 al flamear ligeramente las puntas de la cánula antes de cortar los pocillos en la cámara de EIS. Enfríe la cánula tocando los agros en la tapa del tubo de 15 mililitros. Si la temperatura de la cánula no se enfría, los aros se derretirán al cortar los pocillos de la cámara, lo que provocará que los pocillos queden deformes y defectuosos.Cortar los pozos sin comprometer la integridad de los agros es el aspecto más difícil de este procedimiento. Esto requiere una alineación cuidadosa de la cánula y una presión de vacío muy baja. Alinee el par de cánulas por encima de los dos puntos dorados que rodean el electrodo objetivo en cada cámara.Inserte la cánula verticalmente sin ningún movimiento horizontal, deteniéndose al producirse un contacto suave entre la cánula y la superficie del electrodo. Retire cuidadosamente la cánula nuevamente sin ningún movimiento horizontal, utilizando una pipeta Pasteur estéril de cinco pulgadas conectada a una presión de vacío baja con un trampa de vacío. Para recoger los residuos de agarosa, aspire suavemente los tapones de agarosa dejados por la herramienta de la cánula.Luego, agregue 300 microlitros de medio RPMI completo a la superficie de cada cámara a 37 grados Celsius durante dos minutos para saturar los aros. Después de dos minutos, aspire suavemente el medio de la superficie y de los pocillos sin perturbar los aros. Cada pocillo puede contener un volumen de siete microlitros por pocillo en cada cámara y siete microlitros de suspensión celular.En esta demostración, se utilizan células T jca a una concentración de dos veces diez a la siete células por mililitro. Luego, cargue siete microlitros del quimioatractante en el segundo pocillo de las cámaras. Para las células T jca, 200 nanogramos por mililitro de sdf uno alfa diluido en incompleto.El RPMI se utiliza como atrayente químico para una carga de control negativo. Siete microlitros de medio completo solo en el segundo pozo. Después de cargar los pozos, observe cada cámara de la matriz con un microscopio invertido para asegurarse de que todos los pozos fueron cortados y llenados adecuadamente.Las células deben estar dentro de los límites del borde de los pocillos. Si se observan células en ambos pocillos o si se extienden más allá del borde del pocillo celular, entonces se forma un espacio bajo los aros. Tenga en cuenta que los pocillos configurados incorrectamente no permiten interpretar de manera confiable los datos obtenidos de esas cámaras.Para comenzar la recopilación de datos, coloque el electrodo en el soporte de la matriz. Vuelva a conectar las almohadillas de oro de la matriz de electrodos a los pasadores de resorte del conjunto de conexión del soporte configurado en el software ISIS theta. Los pozos que estén correctamente conectados se resaltarán en verde.Si los pozos son rojos, no están conectados y el electrodo debe reposicionarse en el soporte de la matriz mediante el menú desplegable. En el panel del software, seleccione ocho W uno punto y coma. Esto indica la configuración de la matriz.Ocho.En el panel de control del software, seleccione una poceta para determinar los valores iniciales de resistencia y capacitancia. Para cada poceta, seleccione múltiples frecuencias para medir la resistencia en varias frecuencias. La recopilación de datos de múltiples frecuencias permite el análisis de la capacitancia, la impedancia y la resistencia.Hay una opción para personalizar las frecuencias o utilizar un conjunto de frecuencias recomendadas. La configuración estándar de adquisición multifrecuencia capturará datos en 11 frecuencias preestablecidas a una velocidad de ocho pocillos por minuto. El intervalo de tiempo entre mediciones también puede personalizarse.La duración total del experimento se puede establecer en el panel derecho. Alternativamente, el experimento puede detenerse manualmente haciendo clic en finalizar. Una vez que las células hayan producido resistencia, lo que indica que han llegado al electrodo, haga clic en iniciar para comenzar la recopilación de datos.Aunque los datos se pueden exportar a Excel, el software EISs 1600 R que acompaña al sistema EISs theta es el método más eficiente para analizar los datos de impuestos EISs. La barra de herramientas de análisis de datos del software contiene botones de opción, Z, R y C. Estos determinan si se representa gráficamente la impedancia, la resistencia o la capacitancia, respectivamente, en el eje vertical frente al eje X, que es el tiempo transcurrido. Los datos de impuestos EISs se muestran de forma más eficiente como resistencia frente al tiempo a 4.000 hercios.Las fluctuaciones rápidas en la resistencia o los microtransitorios son evidencia de movimiento celular sobre el electrodo. Compilar o doblar los puntos de datos de forma que no todos los puntos sean graficados no se recomienda para el eje y, ya que promediará y eliminará los microtransitorios de los datos. Una vez que se haya creado el gráfico, con el software ISIS 1600 R, se puede exportar seleccionando "exportar gráfico" en el menú de archivo y guardarlo como archivo PNG o JPEG.Se expusieron células T JERK CAT humanas a un gradiente de SDF uno alfa para estimular el movimiento o a RPMI 1640 como control negativo. Aquí se muestra la resistencia normalizada a 4.000 hercios. La quimiotaxis celular se indica mediante un aumento en la resistencia a 4.000 hercios cuando las células T J CAT humanas se desplazan en respuesta al SDF uno alfa.La llegada de células al electrodo objetivo se indica por la aparición de fluctuaciones rápidas en la resistencia denominadas microtransitorios. El aumento en la resistencia es directamente proporcional al número de células que cruzan el electrodo. Un resultado negativo se indica por una resistencia estable o por una ligera disminución en la resistencia a 4.000 hertz.Esto se observa cuando las células se exponen al RPMI 1640. La ausencia de microtransitorios también es un indicio de la falta de movimiento celular en el electrodo. Además de este procedimiento básico, se pueden realizar otras modificaciones para utilizar el Esys, Texas, con el fin de monitorear el movimiento celular en presencia de anticuerpos monoclonales específicos para un quimioatractivo, modificadores farmacéuticos o toxinas.

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