Name: Determinación del recuento de células de mamíferos, el tamaño celular y la salud de la célula mediante el Moxi Z Mini contador automatizado de células (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 16 s
Description: Aprenda a utilizar el contador celular automatizado Moxi Z para determinar recuentos precisos, tamaño celular e índice de salud en cultivos de células de mamífero mediante impedancia y microfluidos de alta precisión.

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1. Preparación de las muestras <ol><li> Diluir la suspensión de células con ORFLO diluyente o un diluyente adecuado para que la concentración de células se encuentra dentro del rango de operación del instrumento (3.000 a 500.000 células / ml para Tipo casete M, o de 3.000 a 2.500.000 células / ml para casete Tipo S). </li><li> Una dilución de 1:5 a 1:20 (tipo cassette M) o ninguna dilución a 1:05 de dilución (cassette de tipo S) se recomienda para la mayoría de las líneas celulares de mamíferos, pero la dilución adecuada dependerá del tipo de célula y la densidad de siembra. El volumen requerido para un conteo exacto es de aproximadamente 75 l. </li></ol> 2. Las muestras de manejo de <ol><li> Gire a la Z Moxi pulsando el botón de encendido y la pantalla de inicio se mostrará. </li><li> Presione la bandeja hacia abajo e inserte un videocasete en la Z. Moxi La muestra con una pipeta 75μL ... Se mostrará la pantalla. </li><li> Pipetear una muestra de 75 l en el puerto de llenado de la cinta (óvalo azulmarcado 1 o 2, dependiendo de qué extremo del casete se inserta en el instrumento). Estas son las casetes desechables, que pueden ser utilizados para las pruebas 2. Nota: Coloque la punta de la pipeta directamente en la carga así a ~ 45 ° ángulo de modo que la punta está atrapado bajo el labio delantero del pozo. Cuando la dispensación, es importante que el vacío no &quot;salir adelante&quot; de la dispensación del líquido como podría causar bolsillos de aire entre en la cassette. Se recomienda tener una pequeña gota (el tamaño de entrada así) de forma fluida sobre el pozo durante la dispensación. </li><li> Para el recuento de células de mamíferos más, toque la pantalla en cualquier lugar para empezar. Para la cuantificación de partículas muy pequeñas (de 4 a 8 micras de diámetro promedio de tipo M y 3-8 micras de diámetro promedio de tipo S), el Z Moxi se puede ejecutar en modo de pequeñas partículas. Nota: el tipo de casete está indicado en la barra de negro en la parte superior de la pantalla. En este modo, Moxi Z establece la escala diámetro de 2 a 10 micras como el valor predeterminado y que realiza el recuento ucantar parámetros optimizados para la detección de células pequeñas. Pulse el botón de CONTACTO AQUÍ Pequeña modo de partículas (el cuadrado negro) para iniciar la prueba y se ejecutan en este modo. </li><li> El Z Moxi comenzará la prueba y los resultados del conteo de células se completará en aproximadamente 8 segundos (tipo casete M) o 15 segundos (cassette de tipo S). </li><li> El ajuste de curvas y cálculos MVI comenzará de forma automática y requiere sólo unos segundos adicionales. Cuando un ajuste adecuado se encuentra, los resultados entonces automáticamente se visualiza en la pantalla. </li><li> Para que el modo de adquisición de apertura de puerta por defecto, presione la curva de ajuste para activar el botón Cuenta en el modo de apertura de puerta. </li><li> En este punto la casete puede ser retirado de la unidad. </li></ol> 3. Gestión de datos <ol><li> Si la escala sección AutoMode está apagado, los resultados se muestran inicialmente para un recuento de ajuste de la curva en una escala de 2-34 micras de diámetro (tipo cassette M) o 2-26 μm (cassette de tipo S). Si el escalado Automode está activado, entonces el Z Moxi automáticamente la escala del eje horizontal (eje x) para el rango que está más cerca de la anchura de la población curva de ajuste asegurando al mismo tiempo todos los datos de ajuste de curva se muestra. </li><li> Si la escala sección AutoMode está apagado, para mostrar de forma manual los resultados en una resolución más alta, toque el icono de 2.26 micras (tipo M) o el icono de 2.18 micras (tipo S). Nota: El tipo de casete se indica en el cuadro azul en la parte superior izquierda de la pantalla. Esto se recomienda cuando contando células más pequeñas o partículas para mejorar tanto las capacidades de ajuste de curvas, así como la capacidad del usuario para discriminar visualmente matices de los datos. </li><li> Al aumentar la resolución horizontal, el botón de escala dinámicamente ajustar para permitir el ciclismo entre los rangos de escala disponibles eje x: 2-34, 2-26, 2-18 y 2-10 micras para el cassette de tipo M, o 2 -26, 2-18, y 2-10 micras de casete Tipo S. Esta función sólo está disponicable bifilar inmediatamente después de un recuento de células. </li><li> Contar información (células / ml) para el ajuste de curva cerrada o región se muestra en un recuadro negro bajo el lado izquierdo del histograma. El tamaño medio de información de la célula se muestra en el recuadro negro bajo el lado derecho del histograma. </li><li> El valor monetario se muestra un cuadro azul en la parte superior derecha del histograma. Si la prueba se ejecute en modo de pequeña partícula, el MVI no se aplica y se mostrará como &quot;MVI = SPM&quot;. Además, si la concentración de células se encuentra fuera del rango de operación MVI, un mensaje de &quot;MVI = Fuera de rango&quot; en la pantalla. </li><li> Para guardar el histograma actual, toque en el icono de Hecho. Esto guarda los datos con el nombre de &quot;Prueba de XXX&quot; donde XXX es el número de prueba correspondiente. </li><li> Para manualmente la puerta del histograma, toque para cambiar el ajuste de curva recuento de los resultados de botón. Esto hace que el modo de adquisición de apertura de puerta por defecto. A continuación, deslice cada marcador de puerta azul para configurar las puertas o toque ºflechas e izquierdo y derecho (aparecen al tocar el marcador de puerta azul) para los ajustes finos de puerta Sólo las células entre los marcadores se cuentan. La escala vertical del histograma se escala automáticamente sobre la base de la amplitud de la población de la curva de ajuste. Para ajustar la escala vertical, deslizar la pantalla hacia arriba o hacia abajo en la región del histograma. </li><li> Pulse el botón de Cuenta cerrada resultados para devolver la pantalla al modo de ajuste de la curva y que el modo de ajuste de la curva por defecto el modo de adquisición. </li><li> A continuación, pulse el icono de Listo para guardar los resultados y volver a la pantalla de inicio. Para eliminar los resultados, presione el icono de eliminar en cualquier momento para eliminar permanentemente los resultados de la prueba. </li></ol> 4. Análisis de los datos adquiridos con anterioridad <ol><li> Para abrir una prueba de guardado, pulse el icono de histograma en la pantalla de inicio. </li><li> Los iconos de hasta nueve histogramas guardados se mostrarán en la pantalla.Pulse el icono apropiado para la prueba de interés o presione la página o hacia abajo los iconos para ver más resultados de la prueba. </li><li> Cada histograma se abrió, ya sea en el modo de curva de ajuste o el modo de Conde Conde cerrada, dependiendo de cómo se salvó. En el modo de Conde cerrada, los marcadores de activación periódica se puede colocar como desee deslizando cada marcador de puerta azul de forma independiente. Puerta automática al tocar en la cima deseada. Toque para alternar entre el conde cerrada y los modos de ajuste de la curva Conde. </li><li> Pulse los iconos de zoom y Unzoom para ajustar la escala vertical del histograma. La escala vertical también se puede cambiar verticalmente deslizando un dedo sobre la pantalla de arriba (para aumentar) o hacia abajo (para disminuir). </li><li> Pulse el icono Eliminar para eliminar permanentemente los resultados de la prueba. </li><li> Pulse el icono de Listo paracerca de los resultados de la prueba y volver a la pantalla de inicio. (Nota: La vista ampliada no se guardarán.) </li></ol> 5. Transferencia de datos a un PC <ol><li> Los datos pueden transferirse a un PC utilizando la aplicación Moxichart Orflo oa través de transferencia USB conectando el Moxi Z cable USB a un PC o Mac. Para la transferencia de Bluetooth (MoxiChart), en primer lugar determinar el ID de la unidad Bluetooth pulsando en el icono de Bluetooth en la pantalla de inicio de la unidad de Moxi Z. </li><li> En el ordenador, abra la aplicación MoxiChart y haga clic en el icono Bluetooth en la esquina superior derecha. A continuación, seleccione el dispositivo que corresponde a la identificación de Bluetooth de la Z Moxi y seleccione una carpeta de destino para los archivos subidos. </li><li> Moxichart se transferirá automáticamente todos los archivos en el directorio especificado a través de la conexión Bluetooth. </li><li> Los archivos transferidos a través de Bluetooth (MoxiChart) o USB se puede abrir y análisiszado directamente con la aplicación MoxiChart o, debido a que tienen el formato. csv, se pueden abrir directamente en Microsoft Excel u otros programas de análisis de datos para el análisis, además, / personalizado. </li></ol> 6. Los resultados representativos Para evaluar la precisión y la exactitud de la Z Moxi, los conteos de células HEK-293, células HeLa, CHO-K1, levadura, Jurkat E6-1 células, las células PC12, y de precisión calibrados suspensiones de cuentas, con concentraciones que van desde las células 0-500,000 / ml (Tipo casete M) y 0-2-2.5e 6 células / ml (casete Tipo S) se contaron y se compararon mediante un Z2 Coulter y la Z. Moxi Todas las células de mamífero se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC) y se cultivó como se ha descrito anteriormente 7-11. Brevemente, las células fueron cultivadas en suspensión en 75 mm 2 frascos de cultivo de tejidos con medios de base de medio RPMI 1640 (Jurkat E6-1, PC12), las células del MEM (HEK-293, HeLa), o F12K (CHO-K1) células. Todos los medios se complementó con10% de suero fetal bovino y 100 U penicillin/100 estreptomicina g. Los matraces se mantuvieron en una incubadora a 37 ° C con 5% de CO 2. Las células se pasaron cada 3 días. Las células de levadura (X5, C. albicans, Vin 13) fueron donados y utilizados de inmediato conforme a lo dispuesto. Las concentraciones iniciales de muestra de ~ 500.000 células / ml para los datos de casetes Tipo M y ~ 2-2.5E 6 células / ml para el cassette del Type S se establecieron mediante el Z2 Coulter. Posteriores niveles de concentración teóricos se prepararon mediante diluciones seriadas con tampones fisiológicos (Isoton II o solución salina equilibrada de Hank). En cada concentración, muestras idénticas se midieron por ambos sistemas y se traza una contra la otra. Como se observa en la Figura 2, se produjo una fuerte correlación lineal (Tipo M r 2&gt; 0,9886, tipo S r 2&gt; 0,9781) entre los recuentos de todas las muestras. Las concentraciones también se compararon con las concentraciones de células esperados / teórica tanto con la Z y Z2 de la Moxi ( <strong&gt; Figura 3) y volvió a demostrar correlaciones lineales fuertes (tipo M r 2&gt; 0,9758, tipo S r 2&gt; 0,9774). Para evaluar la precisión, HEK-293 y el recuento de células HeLa se realizaron con el Z2 Coulter, Moxi Z, y un hemocitómetro. El coeficiente de variación (CV, n = 19) de los recuentos de células utilizando el Moxi Z (tipo cassette M), Z2 Coulter y un hemocitómetro se calcularon con la CV se mide a partir de 5 cuentas separadas en las 200.000-300.000 células por ml de rango. El pequeño CV medio (Figura 4) de la Z Moxi es comparable a la de la Z2 y es representativa de la alto nivel de precisión sólo alcanzable con Coulter tecnologías basadas en recuento. Dimensionamiento de la precisión del instrumento Moxi Z se evaluó la siguiente a través de la medición de los comprados, esferas de poliestireno de precisión calibrados. Valores medios de tamaño de partícula (n = 5) de Moxi Z se representaron frente tamaños fabricante reportados. Como puede verse in la figura 5, las medidas de Moxi Z siempre coincide con los valores del fabricante con una alta correlación lineal (r 2 = 0,9989). Más allá del tamaño y la información recuento, Moxi Z proporciona un reactivo libre, la evaluación general de salud cultivo celular de mamífero con un índice de viabilidad informó Moxi (MVI) valor. Este índice se genera a partir de una relación entre el número de células en la población de interés con respecto a los recuentos totales de partículas. Para demostrar las capacidades de medición de MVI, las lecturas de MVI (tipo cassette M) en comparación con el manual de normas y de citometría de flujo en vivo / muerto técnicas de medición. Las poblaciones de los muertos (&lt;10% viable) HEK-293 y las células HeLa fueron creados a través de las incubaciones durante la noche de las células vivas en un fluoruro de sodio en nutrientes libre, que contiene el diluyente (Isoton II, Beckman Coulter) a 37 ° C. Controlar los niveles de viabilidad teórica fueron preparados por ratiometrically concentraciones conocidas de la mezcla de células vivas y muertas. Res.ulting soluciones fueron analizadas para niveles de viabilidad por duplicado con los recuentos de ambos hemocitómetro y las mediciones del citómetro de flujo. Mediciones hemocitómetro se hicieron usando una tradicional mezcla 50/50 de 0,1% de solución azul de tripano y las células. Mediciones de citometría de flujo se hicieron usando un citómetro de Guayaba PCA (Merck) utilizando el reactivo Viacount y el fabricante especifica-protocolo (Merck). Como se muestra en la Figura 6, los valores de correlación de Pearson (R 2) &quot;del ajuste lineal de los datos MVI a análogos porcentajes hemocitómetro viabilidad para&quot; células HEK y células HeLa fueron de r 2 = 0,9937 y 2 r = 0,9728, respectivamente. Estos resultados demuestran que este enfoque proporciona información de referencia cultural de la salud a través de una amplia gama de viabilidades celulares que se comparan favorablemente con las mediciones en vivo / muerto obtenidos mediante un citómetro de flujo o un hemocitómetro. Tablas y Figuras (De Dittami et al, 2011). 15: Figura 1. De película delgada Conteo Coulter: La corriente eléctrica pasa a través de la Zona de la célula de detección de la casete de película delgada. Como las células fluir único archivo a través de la CSZ, los aumentos momentáneos de voltaje se miden por el Z. Moxi <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3842/3842fig2.jpg" /> Figura 2. Moxi recuentos Z son comparables a Coulter Z2 recuentos. Recuentos idénticas de suspensiones de células y el talón se contaron usando tanto un Z2 Coulter y la Z. Moxi Promediado valores de recuento (n = 3-4) de los recuentos de Moxi Z se representan con respecto a la Coulter Z2 correspondientes cuentas y valores de r 2 del ajuste lineal se determinaron. A) Tipo M casete - intervalo de concentración de 0 - 500.000 células / ml. B) Tipo de cassette S - rango de concentración de 0 - 2-2.5E 6 / Bares ml.Error indican ± 1 desviación estándar. Figura 3. Moxi mediciones de concentración de Z vs concentraciones teóricas de células. A) Tipo de cassette M - Los valores teóricos de concentración fueron preparados a partir de diluciones seriadas de una cantidad inicial de 500.000 células / ml de muestra B) Tipo S de cassette -. Los valores teóricos de concentración fueron preparados a partir de diluciones seriadas de un inicial 2 - 2.5E 6 células / ml de muestra. Barras de error indican ± 1 desviación estándar. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3842/3842fig4.jpg" /> Figura 4. Coeficiente de variación para el Z2 Coulter, Moxi Z (tipo cassette M), y el hemocitómetro. El coeficiente de variación (CV, n = 19) de HEK-293 y el recuento de células HeLa para cada método se calcularon con CV medidos a partir de 5 por separado cargos de HEK-293 y las células HeLa en el 200.000 - 300.000 células por ml de rango. Barras de error indican ± 1 desviación estándar. Figura 5. La precisión de las mediciones de tamaño de partícula usando Moxi Z-Moxi Z mide el tamaño de grano (tipo cassette M) vs fabricante informó de tamaño de las perlas. Barras de error indican ± 1 desviación estándar. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/3842/3842fig6.jpg" /> Figura 6. Cultura Evaluación de la Salud con MVI - Comparación de las mediciones de MVI (tipo cassette M) y la viabilidad de Guayaba PCA Viacount frente visuales, del azul tripán cuenta la viabilidad teñidas utilizando un hemocitómetro.

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Gregory M. Dittami y el Excmo Ayliffe son empleados de las Tecnologías de Orflo, la compañía que diseñó, fabrica y vende el Moxi Z. Richard D. Rabbitt ofrece a tiempo parcial, la experiencia de consultoría pagados a las Tecnologías de Orflo. La producción y el libre acceso a este artículo es patrocinado por las tecnologías de Orflo.

La aplicación del enfoque subyacente Coulter pueden ser altamente determinista de la precisión global de las mediciones. Un área crítica es la corrección de los recuentos de células primas para &quot;eventos coincidencia&quot; donde dos o más células simultáneamente pasan a través de la abertura y se mide como un evento eléctrico único. &quot;Eventos coincidencia&quot; contribuir a un error que varía en función de un número de factores incluyendo el tamaño celular y el grado de agrupamiento (Davis et al 1967) 6. Como resultado, la corrección de coincidencia necesaria para cualquier muestra dada no se puede predecir, variando ampliamente entre tipos de células / partícula e incluso entre diferentes culturas de tipos de células idénticas. Establecido teoría, basada en las publicaciones iniciales por Coulter, consiste en aplicar un ajuste logarítmica de los recuentos primas basadas en el número de eventos observados y una determinada empíricamente, de partícula específica del factor de corrección, z. Si bien el número exacto puede ser realizado con la tel algoritmo de corrección, se limita en su aplicación práctica, debido a las grandes variaciones en los valores de z entre tipos de células y la correspondiente dificultad en predecir con exactitud su valor. Aquí, utilizando la &quot;verdadera&quot; recuento de células identificadas por el ajuste de la curva Moxi Z en conjunción con el algoritmo de corrección de coincidencia, el Z Moxi dinámicamente corrige coincidencia para alcanzar las concentraciones reales. En comparación con los resultados obtenidos con alta gama Coulter Z2, el Z Moxi cuenta comparables producidas a través de un rango de concentración de 0 a 500.000 células / ml (tipo cassette M) y 3000 - 2-2.5E 6 células / ml (cassette de tipo S) . Además, el Z Moxi logra esta precisión recuento con un coeficiente bajo similar de variación en los recuentos y una precisión en partículas de tamaño que es característico del patrón oro, Coulter-técnica en el recuento de células. Por otra parte, los datos presentados aquí indican que la Z Moxi pueden proporcionar información valiosacon respecto a la salud general de los cultivos celulares. El Z Moxi aprovecha el enfoque de ajuste de curvas con un algoritmo de software propietario para determinar esta evaluación de seguridad y salud. Los cambios morfológicos asociados con la muerte celular, como blebbing, separándose y distorsiones volumétricas (Kataoka y Tsuruo 1996, Liegler et al 1995, Sheridan et al 1981) 12-14, hacen posible que el Moxi-Z para distinguir las diferencias entre los impedimetric viven las poblaciones y las poblaciones de células muertas / escombros. El valor monetario es generado por el análisis de la distribución del tamaño de la cultura / partícula para identificar las contribuciones relativas de partículas de desechos, reducidos células necróticas, y la curva de la población equipada célula de interés. El valor MVI lo refleja un índice de población o medida radiométrica de los recuentos de población monodispersas con respecto al perfil de partícula población general. Este valor se hace mediante algoritmos ajustados en función de las estadísticas basadas en la población y las observaciones empíricas. Because la MVI mira a otros parámetros que los enfoques de tinción tradicionales, no se espera para duplicar estas técnicas sino que proporciona una vista alternativa valiosa en la salud de un cultivo de células, particularmente con respecto a los restos y contaminantes microbianos. En resumen, el contador de células Moxi-Z es un instrumento de ultra sobremesa pequeño que proporciona ensayos precisas y reproducibles de recuento de células, el tamaño de celda, y la salud de células utilizando el Principio Coulter y de ajuste de curvas algoritmos de software combinada con una tecnología de sensores patentada de película delgada . Con el cassette de tipo M es capaz de contar partículas que van desde 4 - 25 micras de diámetro (rango dinámico de 2 - 34 micras), en 8 segundos. Con el casete Tipo S es capaz de contar partículas que van desde 3 - 20 micras de diámetro (rango dinámico de 2 - 26 micras), en 15 segundos. Además, el Moxi-Z lleva a cabo evaluaciones de salud sin el uso de reactivos. Es inte mucho menos trabajonsive y subjetivos que el recuento manual. En comparación con la norma recuento Coulter, la Moxi es más rápido, significativamente menor, proporciona más información, requiere un mantenimiento considerablemente menor, es más fácil de usar, y es una fracción del coste.

<table border="1" ><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> ORFLO diluyente </td><td> ORFLO </td><td> MXA006 </td><td></td></tr><tr><td> Casete dispensador </td><td> ORFLO </td><td></td><td> Almacena hasta 25 casetes para una cómoda dosificación </td></tr><tr><td> Cable USB </td><td> ORFLO </td><td></td><td> Conecta instrumento para PC / Mac o adaptador de corriente </td></tr><tr><td> Adaptador de corriente (modelos de Estados Unidos y la Unión Europea solamente) </td><td> ORFLO </td><td></td><td> Conecta el cable USB a una toma de CA </td></tr><tr><td> USB Flash Drive </td><td> ORFLO </td><td></td><td> Tiendas Moxi Z de software y manual del usuario </td></tr><tr><td> Cuentas Calibration Check </td><td> ORFLO </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cassette de calibración electrónica </td><td> ORFLO </td><td></td><td> Cassette de electrónica para verificar el funcionamiento correcto del sistema y de calibración </td></tr></tbody></table>

determinación del recuento de células de mamíferos, el tamaño celular y la salud de la célula mediante el moxi z mini contador automatizado de células

Determination of Mammalian Cell Counts, Cell Size and Cell Health Using the Moxi Z Mini Automated Cell Counter

El recuento de partículas y células se utiliza en diversas aplicaciones, incluyendo el cultivo celular de rutina, el análisis hematológico y los controles industriales1-5. Un avance fundamental en las tecnologías de recuento de células/partículas fue el desarrollo de la técnica de Coulter por Wallace Coulter hace más de 50 años. Esta técnica implica la aplicación de un campo eléctrico a través de una abertura de tamaño micrométrico y el enfoque hidrodinámico de partículas individuales a través de dicha abertura. La oclusión resultante de la abertura por las partículas produce un cambio medible en la impedancia eléctrica que puede correlacionarse directa y precisamente con el tamaño o volumen celular. El reconocimiento de este método como estándar en el recuento de células/partículas proviene de la extraordinaria precisión y exactitud en la medición del tamaño y el número de partículas, particularmente en comparación con las tecnologías manuales y basadas en imágenes (exactitudes del orden del 98 % para los contadores de Coulter frente al 75-80 % para los sistemas manuales y basados en visión). Esto puede atribuirse al hecho de que, a diferencia de los enfoques basados en imágenes para el recuento celular, la técnica de Coulter realiza una medición verdaderamente tridimensional (3D) de células/partículas, lo que reduce considerablemente las interferencias en el recuento provocadas por restos celulares y agrupaciones, al calcular información volumétrica precisa sobre las células/partículas. En conjunto, esto proporciona un medio para enumerar y dimensionar células de manera más precisa, menos tediosa, menos consumidora de tiempo y menos subjetiva que otras técnicas de recuento6.
A pesar de la importancia de la técnica de Coulter en el recuento celular, su uso generalizado en estudios biológicos rutinarios ha sido limitado debido al costo y tamaño de los instrumentos tradicionales. Aunque se ha desarrollado un instrumento basado en Coulter menos costoso, presenta limitaciones en comparación con sus homólogos más caros respecto a la corrección de «eventos de coincidencia», en los que dos o más células pasan simultáneamente por la abertura y son medidas al mismo tiempo. Otra limitación de las tecnologías de Coulter existentes es la falta de métricas sobre la salud general de las muestras celulares. Por consiguiente, a menudo deben utilizarse técnicas adicionales junto con el recuento de Coulter para evaluar la viabilidad celular. Esto alarga el tiempo y costo del montaje experimental, ya que los métodos tradicionales de evaluación de viabilidad requieren tinción celular y/o el uso de equipos costosos y voluminosos, como un citómetro de flujo.
El contador celular automatizado Moxi Z mini, descrito aquí, es un instrumento de tamaño ultra compacto para banco de trabajo que combina la precisión del Principio de Coulter con una tecnología de sensor de película delgada para permitir la medición precisa y el conteo de partículas en un rango de 3 a 25 micrones, dependiendo de la cinta para conteo celular utilizada. La cinta tipo M puede emplearse para contar partículas con diámetros promedio de 4 a 25 micrones (rango dinámico de 2 a 34 micrones), y la cinta tipo S puede utilizarse para contar partículas con un diámetro promedio de 3 a 20 micrones (rango dinámico de 2 a 26 micrones). Dado que el sistema utiliza un método de medición volumétrica, los 4-25 micrones corresponden a un rango de volumen celular de 34 a 8.180 fL, y los 3-20 micrones corresponden a un rango de volumen celular de 14 a 4.200 fL, lo cual es relevante cuando se miden partículas no esféricas. Para realizar conteos de células de mamífero utilizando el Moxi Z, las células a contar se diluyen primero con ORFLO o un diluyente similar. Se inserta una cinta para conteo celular en el instrumento, y la muestra se carga en el puerto de la cinta. Miles de células son aspiradas, en fila única, a través de una "Zona de Detección Celular" (CSZ, por sus siglas en inglés) en la membrana de película delgada durante un periodo de 8 a 15 segundos. Tras la corrida, el instrumento utiliza un ajuste de curva patentado junto con un algoritmo de software patentado para proporcionar corrección de eventos de coincidencia, así como una evaluación del estado general del cultivo mediante la determinación de la relación entre el número de células en la población de interés y el número total de partículas. Los conteos totales de partículas incluyen células muertas encogidas y descompuestas, así como otros residuos y contaminantes. Los resultados se presentan en formato de histograma con un ajuste automático de curva, con compuertas que pueden ajustarse manualmente según sea necesario.
En última instancia, el Moxi Z permite realizar recuentos con una precisión y exactitud comparables a las del Coulter Z2, el estándar actual de referencia, al tiempo que proporciona información adicional sobre la salud del cultivo. Además, logra estos resultados en menos tiempo, con un menor espacio ocupado, con una operación y mantenimiento significativamente más sencillos, y a una fracción del costo de tecnologías comparables.

El Moxi Z contador automático de células en miniatura es un instrumento novedoso que combina el Principio Coulter con la tecnología patentada de sensor de película delgada y un algoritmo de software propietario para realizar el dimensionado y el recuento de un amplio rango de tamaño de partículas, así como para determinar el estado general de salud de monodispersas cultivos de células de mamíferos. Este protocolo se describe el uso de este instrumento para contar y evaluar la salud de los cultivos celulares.

Determinación del recuento de células de mamíferos, el tamaño celular y la salud de la célula mediante el Moxi Z Mini contador automatizado de células

El recuento de partículas y células se utiliza para diversas aplicaciones, entre ellas el cultivo celular de rutina, el análisis hematológico y los controles industriales1-5. Un ...

El contador celular automatizado Mxi Z Mini es un instrumento de tamaño reducido para banco de trabajo que realiza conteos celulares y de partículas altamente precisos. Al combinar el principio TER, estándar de oro, con una tecnología patentada de sensores de película delgada, las cassettes utilizadas con el Mxi Z son sensores microfluídicos de precisión para obtener los conteos celulares.Se inserta un cartucho en la parte frontal del equipo y se cargan 75 microlitros de muestra en el puerto de muestra. Cuando comienza el análisis, las células pasan en fila individual a través de una zona de detección celular en la membrana de película delgada del cartucho, contabilizándose miles de células por muestra mientras atraviesan la zona de detección. El volumen preciso de cada una se determina mediante una medición de impedancia.Después de ocho segundos, se muestran la concentración celular promedio, el tamaño celular promedio y el índice de salud celular, junto con un histograma completo de alta resolución de toda la población de partículas. En la muestra, los datos pueden analizarse y almacenarse directamente en el instrumento o transferirse a una Mac o PC mediante Bluetooth o USB. La ventaja principal de esta técnica frente a otros sistemas, como los hemocitómetros, citómetros o contadores celulares automatizados basados en imágenes, es que es mucho más confiable, con una exactitud y precisión superiores al 95 %, en comparación con el 75 a 80 % de los sistemas basados en imágenes.Además, mide el tamaño celular, es mucho más rápido y no es subjetivo. Aunque este método es ideal para recuentos de un millón de células. Puede aplicarse a una amplia variedad de aplicaciones de recuento celular debido a su amplio rango dinámico.Dichas aplicaciones incluyen recuentos de glóbulos blancos, glóbulos rojos, protozoos, algas y levaduras. Comience este experimento diluyendo una suspensión recién separada de células HEK 293 en un medio con conductividad fisiológica, como diluyente para flujo o PBS, hasta la concentración adecuada. Triture suavemente para minimizar la formación de agregados celulares y asegúrese de que la unidad esté desconectada de la fuente de alimentación. Luego encienda el mxi Z presionando el botón de encendido; se mostrará la pantalla de inicio. El mxi Z utiliza cassettes desechables del tipo M o S, que son sensores microfluídicos de precisión. Cada cassette tiene dos puertos de carga indicados por óvalos azules y etiquetados como uno o dos.Cada cartucho puede utilizarse para dos pruebas. Los cartuchos del tipo M tienen un rango de operación de 3000 a 500 000 células por mililitro. El rango para los cartuchos del tipo S es de 3000 a 2,5 millones de células por mililitro.Presione la bandeja hacia abajo e inserte un casete para garantizar la homogeneidad de la muestra invirtiéndola lentamente varias veces. Luego, aspire 75 microlitros de muestra. Coloque la punta de la pipeta firmemente en el puerto de muestra, sosteniendo la pipeta en un ángulo de 45 grados, y luego desprenda la muestra en el puerto en un solo movimiento suave, asegurándose de que toda la muestra haya sido dispensada.Toque la pantalla en el círculo designado o en cualquier lugar excepto en el cuadro del modo de partículas pequeñas para comenzar a contar. El mxi Z iniciará la prueba y los resultados del recuento de células estarán completos en ocho segundos. Con el cassette Tipo M, los resultados se muestran automáticamente mediante un algoritmo patentado de ajuste de curva que ajusta la población de células individuales de interés y también corrige el recuento total por coincidencia.Eventos o sucesos en los que múltiples partículas o agrupaciones pasan simultáneamente por la zona de detección de la celda. Tenga en cuenta que, aunque estos eventos de coincidencia quedan fuera del área de ajuste de la curva hacia la derecha, aún se incluyen en el recuento total. Una vez encontrado un ajuste adecuado, se muestra un histograma de alta resolución de toda la población de la muestra junto con los valores numéricos de la concentración celular, el diámetro promedio y el volumen promedio.Además, se proporciona un índice de población Moxie o valor MPI como indicador de la salud general del cultivo. Las cuentas situadas más a la izquierda del histograma son normales y representan el umbral de ruido de fondo del sistema, ajustado para optimizar la sensibilidad del sistema y las posibles cuentas de restos de la muestra. Una vez finalizada la ejecución de la muestra, retire el casete de la unidad, seleccione listo para guardar y regresar a la pantalla de inicio.Un indicador visual confirma que la muestra ha sido analizada. Si se va a analizar una segunda muestra, gire el cartucho e insértelo en el dispositivo. Nuevamente, tras un análisis en modo normal, los resultados se muestran como un ajuste de curva en una escala de tamaño de cuatro a 34 micrómetros para el cartucho tipo M o de tres a 26 micrómetros para el tipo S; para reescalar el eje x de cuatro a 26 micrómetros, pulse el icono de reescalado.A continuación, pulse sucesivamente el icono de reescalar para cambiar la escala del eje x mediante las siguientes escalas: de cuatro a 18 micrones, de cuatro a 10 micrones, y de vuelta a cuatro a 34 micrones. Cambie nuevamente al modo de ajuste de curva si lo desea. El número de prueba para el análisis actual se muestra en la parte superior del histograma dentro de un cuadro verde.Los datos se guardarán como el número de prueba; toque el icono de compuerta para alternar el modo de compuerta, lo que permite el ajuste manual de la compuerta en el histograma. Esto establece la compuerta como modo de adquisición predeterminado. Las compuertas pueden modificarse deslizando los marcadores de compuerta azules izquierdo y derecho, o tocando cualquiera de los marcadores y luego moviéndolos progresivamente con las teclas de flecha que aparecen.Los recuentos mostrados y la información promedio de tamaño se calculan únicamente a partir de las partículas dentro del rango de selección. Presione el icono de finalizado para guardar los resultados y regresar a la pantalla principal. Para abrir una prueba guardada, presione el icono de histograma en la pantalla principal.Se mostrarán simultáneamente iconos para hasta nueve histogramas guardados; toque la página hacia abajo o hacia arriba, o deslice hacia arriba o hacia abajo para visualizar más resultados de pruebas según sea necesario y seleccione el icono correspondiente a la prueba de interés. Cada histograma se abrirá en el modo de ajuste de curva o en el modo con compuerta.Dependiendo de cómo se haya guardado, en la parte superior izquierda de la pantalla se indicará el tipo de casete utilizado para la prueba, ya sea M o S. Guardado. Los histogramas también se pueden alternar entre modos de adquisición por compuertas y ajuste de curva; para realizar automáticamente la compuerta, toque el pico deseado. Esto establece las posiciones óptimas de compuerta para el pico seleccionado.Esto es especialmente útil en situaciones con múltiples picos. Para indicar un pico de interés, presione las flechas de zoom y deszoom para ajustar la escala de conteo en el eje Y del histograma. La escala vertical también puede cambiarse deslizando un dedo sobre el pico hacia arriba para disminuir o hacia abajo para aumentar; presione el icono de retroceso para cerrar esta prueba y regresar a la pantalla de inicio.Los datos se pueden transferir a una Mac o PC utilizando la aplicación moxie chart. Para hacerlo, primero presione el icono de Bluetooth en la pantalla de inicio de la unidad Moxie Z. La unidad mostrará su identificación de Bluetooth en la computadora; abra la aplicación moxie chart y haga clic en el icono de Bluetooth en la esquina superior derecha.Luego, seleccione el dispositivo que corresponda al ID de Bluetooth de la Z y la carpeta de destino seleccionada para los archivos cargados, además de Bluetooth. Otra forma de transferir datos desde la Mxi Z a una computadora es utilizando un cable USB y tratándola como un dispositivo USB normal. Con los archivos de datos, se pueden copiar archivos de datos de una unidad Mxi Z conectada mediante USB a cualquier directorio en la computadora.Los archivos se pueden abrir y analizar directamente con la aplicación Mxi Charles o, dado que están en formato CSV, se pueden abrir directamente en Microsoft Excel u otros programas de análisis de datos para realizar un análisis comparativo de los resultados del recuento en el Mxi Z con los obtenidos. Utilizando un contador de flujo, se contaron suspensiones idénticas de microesferas calibradas con precisión y células de mamífero mediante ambos métodos. Se probaron cuatro tipos diferentes de microesferas de tamaños que oscilan entre 6 y 15,6 micrones de diámetro, además de varias líneas celulares diferentes.Se representó gráficamente el promedio de tres a cuatro conteos, como se puede observar aquí. Los conteos obtenidos fueron casi idénticos, lo que indica que el Moxie Z es capaz de obtener conteos precisos en un amplio rango de tamaños para demostrar el intervalo de concentraciones que pueden evaluarse con precisión utilizando el Mxi Z. Las mismas cuentas y células se diluyeron seriamente desde una concentración inicial de 500.000 células por mililitro para la cinta tipo M o aproximadamente 2,5 millones de células por mililitro para la cinta tipo S. Luego, se representaron gráficamente las concentraciones teóricas de células frente a los conteos obtenidos, como se muestra aquí. Las concentraciones medidas coincidieron con las concentraciones teóricas de células, demostrando un conteo preciso a lo largo del rango dinámico de cada cinta: de 3000 a 500.000 células por mililitro para las cintas tipo M y de 3000 a 2,5 millones de células por mililitro para las cintas tipo S. Para examinar la variabilidad de los resultados, se obtuvieron cinco conteos independientes de células HEK 293 y células HELOC en el rango de 200.000 a 300.000 células por mililitro, utilizando un Call to Z, un Moxi Z y un hemocitómetro.Como puede observarse en este gráfico, el coeficiente medio de variación fue comparable entre el Z two y el mxi Z, y mucho menor que el del hemocitómetro, lo que indica que la reproducibilidad del Mxi Z es comparable a la del Z two y superior a la del hemocitómetro. Para demostrar la precisión del Mxi Z en la determinación del tamaño de partículas, se midieron esferas fabricadas utilizando el Mxi Z. Se realizaron cinco mediciones para cada tamaño de esfera, se promediaron y se representaron frente al tamaño de esfera indicado por el fabricante. El Mxi Z midió las esferas en el tamaño reportado por el fabricante.El valor de R cuadrado fue de 0.9989 para demostrar la capacidad del Mxi Z para evaluar la cultura. Se registraron mediciones del índice de salud celular mediante el Mxi Z para preparaciones idénticas de células muertas agregadas, células HEK y células HeLa, y se compararon con los resultados visuales de exclusión de azul de trian de los mismos porcentajes de viabilidad del hematoma o con el análisis del citómetro de flujo Guava PCA a efectos comparativos. Las mediciones de viabilidad para las muestras también se representaron en la gráfica, como se puede observar aquí.La viabilidad calculada para las células HGK y LAR obtenida mediante el Mxi Z fue comparable a las mediciones de viabilidad obtenidas con el método de exclusión de azul de tripano, con valores de r cuadrado de 0,9937 y 0,9728, respectivamente. Los datos obtenidos también son comparables a los obtenidos mediante guava PCA con el citómetro de flujo, con valores de R cuadrado de 0,9724 para las células EK y 0,9585 para las células hela. Aunque en ciertos casos el índice de salud celular puede coincidir con los enfoques estándar de viabilidad, se trata de una técnica completamente nueva y diferente para la evaluación de la salud, por lo que no siempre será idéntica a las técnicas anteriores.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo obtener fácilmente información sobre la salud celular, el tamaño celular y el recuento de células al realizar este procedimiento. Es importante asegurarse de que la densidad celular se encuentre dentro del rango correcto.

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Determinación del recuento de células de mamíferos, el tamaño celular y la salud de la célula mediante el Moxi Z Mini contador automatizado de células (Video) | JoVE Journal

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