Un ensayo de cribado para la identificación de moduladores fluorescente de canales GIRK
24 de abril de 2012
Un tiempo real procedimiento de detección para identificar los medicamentos que interactúan con la proteína G-gated K hacia el interior del rectificador + (GIRK) canales se describe. El ensayo utiliza la membrana potencial sensibles tintes fluorescentes para medir la actividad GIRK canal. Esta técnica es adaptable para su uso en un número de líneas celulares.
El objetivo general de este procedimiento es identificar nuevos fármacos que modulen los canales de grk. Esto se logra colocando primero las celdas A TT 20 en la placa de 96 pocillos. El segundo paso es diluir los compuestos de prueba utilizando el sistema de manipulación de placas líquidas Verset.
A continuación, los compuestos de prueba diluidos se aplican a las células utilizando el verso. El paso final es insertar la placa de 96 pocillos en el lector de placas fluorescentes Synergy dos e inyectar las soluciones de control y somatostatina en los pocillos. En última instancia, el lector de placas fluorescentes se utiliza para mostrar los compuestos que alteran la señal fluorescente inducida por somatostatina y, por lo tanto, modulan los canales Grk.
La ventaja de este procedimiento sobre los métodos existentes, como el registro de parches, es que un gran número de compuestos se pueden cribar rápidamente para determinar si modulan los canales gerk. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento del dolor, ya que se pueden identificar compuestos que activan el canal de Gerk, que conducen a la inhibición de la transmisión nociceptiva de FI. Las placas de 96 pocillos y el recubrimiento de las celdas es Maribel Vásquez.
Un estudiante de mi laboratorio Comience este procedimiento cultivando las células pituitarias A TT 20 en DMEM suplementado con suero de caballo al 10% a 37 grados centígrados en una atmósfera humidificada con 5% de CO2. Mantenga el cultivo subcultivando las células cada cinco a siete días utilizando un procedimiento de estandarización. A continuación, cubra los pozos del negro transparente.
Placa inferior de 96 pocillos con 50 microlitros de lisina poliL. Deje que los pocillos se sequen durante 30 minutos en la incubadora. A continuación, retire el exceso de placa de lisina poli L de las células de la placa de 96 pocillos que contiene 200 microlitros de medio a una densidad de 30.000 células por pocillo.
Después de eso, almacene las células en la incubadora durante tres o cuatro días. Utilice una configuración de aspiración para aspirar lentamente el medio de cultivo de la monocapa celular, luego lave las células con 200 microlitros de solución tampón normal. Posteriormente, agregue 200 microlitros de solución tampón que contenga el tinte sensible al potencial de membrana a cada uno.
Incubar bien las células durante 40 minutos a 37 grados centígrados. Después de 40 minutos, retire las células A TT 20 de la incubadora y deje que vuelvan a la temperatura ambiente, aspire el tampón viejo. A continuación, aplique una solución tampón fresca que contenga el MPD a las células.
A continuación, utilice el sistema de manejo de líquidos para aplicar varias concentraciones de los compuestos de prueba y soluciones de control a las celdas. En la placa de 96 pocillos, incube las células durante cinco minutos con compuestos de prueba para las mediciones fluorescentes. En este procedimiento, inserte la placa de 96 pocillos en un lector de placas fluorescentes de biotech synergy two.
Obtenga la señal fluorescente de fondo a una longitud de onda de exudación de 520 nanómetros y una longitud de onda de misión de 560 nanómetros. A continuación, aplique los ligandos G PCR R o la solución de control a los pocillos para activar los canales GIR utilizando el sistema de dos inyectores Synergy. A continuación, recoja los puntos de datos a intervalos de diez segundos durante un período de muestreo número 302.
En las longitudes de onda de excitación y emisión. Calcule el factor Z para determinar la fiabilidad del ensayo. Los factores en el rango de 0,5 a 1,0 indican que la calidad del ensayo es excelente.
Se excluyen las placas con factores Z inferiores a 0,5. A partir del análisis, los compuestos que modulan la señal fluorescente se vuelven a probar en presencia de cloruro de bario de dos milimolares o 500 nano molares de terapina Q para confirmar la especificidad del canal de potasio rectificador entrante, aquí se muestra una señal fluorescente representativa de HLB 0 2 1 1 15 2 medida a lo largo del tiempo en las células A TT 20 con la adición de somatostatina o solución de control. La relación de la intensidad fluorescente en el eje Y se calculó dividiendo la señal en presencia de somatostatina o de la solución de control por la señal basal medida antes de la adición de somatostatina o solución de control.
Aquí se muestra el tratamiento de las células A TT 20 con 500 nano molares. Terapin Q inhibe la disminución de la señal fluorescente mediada por somatostatina al unirse a dos y bloquear los canales G. Y aquí se muestra el tratamiento de las células A TT 20 con propafenona de 20 micromolares, que también inhibe la disminución de la señal fluorescente mediada por la somatostatina Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos horas si se realiza correctamente.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo identificar medicamentos que modulan los canales grk utilizando un lector de placas fluorescentes.
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Visión general
Este artículo describe un procedimiento de detección en tiempo real para identificar fármacos que interactúan con los canales de potasio rectificador de entrada dependientes de proteína G (GIRK). El ensayo emplea colorantes fluorescentes sensibles al potencial de membrana para medir la actividad del canal GIRK, lo que lo hace adaptable para varias líneas celulares.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Farmacología
- Neurociencia
- Electrofisiología
Antecedentes
- Los canales GIRK juegan un papel crucial en la señalización neuronal.
- Identificar moduladores de los canales GIRK puede conducir a nuevas estrategias terapéuticas.
- Los ensayos en tiempo real mejoran la eficiencia de la detección de fármacos.
- Los colorantes fluorescentes proporcionan una medida sensible de la actividad del canal.
Propósito del estudio
- Desarrollar un procedimiento para detectar fármacos que modulan los canales GIRK.
- Utilizar un formato de alto rendimiento para probar múltiples compuestos.
- Mejorar la comprensión de la farmacología del canal GIRK.
Métodos utilizados
- Plantar células A TT 20 en una placa de 96 pocillos.
- Usar el sistema de manejo de líquidos Verset para diluir los compuestos de prueba.
- Aplicar compuestos diluidos a las células con el Verset.
- Usar un lector de placas fluorescentes Synergy two para medir las respuestas.
Resultados principales
- Identificación de compuestos que alteran las señales inducidas por somatostatina.
- Demostración de la adaptabilidad del ensayo a varias líneas celulares.
- Modulación exitosa de la actividad del canal GIRK por los compuestos probados.
- Validación de la efectividad del lector de placas fluorescentes en la detección.
Conclusiones
- El ensayo desarrollado es una herramienta valiosa para el descubrimiento de fármacos dirigidos a los canales GIRK.
- La detección en tiempo real puede acelerar la identificación de potenciales terapéuticos.
- Se necesitan más estudios para explorar las implicaciones clínicas de los compuestos identificados.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
This assay enables high-throughput identification of GIRK channel modulators, supporting target validation in neuroscience and cardiovascular drug discovery. By providing real-time, quantitative fluorescence readouts, it reduces reliance on low-throughput electrophysiology and accelerates hit-to-lead progression. The method enhances predictive confidence in early discovery by linking compound effects to functional channel activity in a physiologically relevant cellular context.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring functional GIRK channel modulation in response to GPCR ligands.
- Operational Value: Enables rapid screening of compound libraries to identify activators or inhibitors with mechanistic specificity.
- Predictive Value: Supports target de-risking by confirming on-target activity through fluorescence signal changes correlated with K+ efflux.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Uses membrane potential-sensitive dyes (DiBAC4(3) or HLB 021-152) to generate quantifiable, real-time signals upon GIRK activation.
- Reproducibility: Z-factor calculation (excellent range: 0.5–1.0) ensures assay robustness for hit selection and campaign reproducibility.
- Scalability: Compatible with 96-well format and liquid handling systems (e.g., Verset) for automated compound dispensing and screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Modulators identified may inform therapeutic strategies for neuropathic pain, addiction, and cardiac arrhythmias via GIRK-mediated neuronal inhibition.
- Translational Continuity: Fluorescent readouts provide a bridge from target engagement to functional output, supporting preclinical phenotype anchoring.
- Mechanistic De-risking: Specificity confirmed using inhibitors like barium chloride or Terapin Q to distinguish GIRK-mediated effects from off-target activity.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation to lead identification, enabling functional screening of GIRK modulators prior to downstream optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking GPCR activation to GIRK-dependent fluorescence changes, clarifying pathway modulation.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized dye loading, compound application, and kinetic fluorescence measurement over 300 seconds.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements (fluorescence intensity ratios) enabling comparison of compound potency and efficacy.
- Translational Research: Connects to preclinical work by identifying compounds that alter neuronal excitability via GIRK, relevant to pain and addiction models.
- Enterprise Reuse: Platform-adaptable across cell lines and GPCR ligands, promoting reuse across multiple target validation campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target modulation by reducing mechanistic ambiguity in ion channel drug screening.
- Operational Value: Offers standardization, reproducibility, and real-time kinetic data unattainable with endpoint assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early functional validation, reducing late-stage failure risk due to lack of target engagement.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of compounds with confirmed GIRK activity for advancement to lead optimization.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture (AT T20 cells), fluorescent dye handling, and kinetic plate reader operation.
- Dependent on fluorescence plate reader with injection capability (e.g., Synergy 2) and compatible excitation/emission settings (520 nm/560 nm).
- Necessitates standardization of dye loading, incubation times, and buffer conditions across wells and plates.
- Adaptation to other cell lines requires validation of GIRK expression and dye loading efficiency.
- Practical limitation: Assay specificity must be confirmed using orthogonal inhibitors (e.g., Ba2+, Terapin Q) to exclude non-GIRK-mediated fluorescence changes.
