Preparación de las células embrionarias de fibroblastos de ratón adecuados para el cultivo de células estaminales embrionarias humanas pluripotentes inducidas, y

El objetivo general de este procedimiento es preparar fibroblastos embrionarios de ratón adecuados para el cultivo de células madre embrionarias humanas y células madre pluripotentes inducidas. Esto se logra primero separando cada embrión y eliminando la cabeza y los órganos rojos. A continuación, el tejido se tritura finamente y se digiere.

Luego, las células se siembran, de tres a cuatro embriones por frasco, y se expanden. Finalmente, los mitos inactivados se utilizan para preparar el medio acondicionado. En última instancia, el ensayo de LSA se emplea para determinar la concentración óptima de activina en un medio acondicionado que sostiene el crecimiento indiferenciado de células madre pluripotentes.

Generalmente, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque el procedimiento debe estandarizarse para producir fibroblastos embrionarios de ratón de alta calidad, lo que permitirá el crecimiento indiferenciado tanto de células madre embrionarias humanas como de células madre pluripotentes inducidas. La demostración visual de este método es fundamental, ya que el aislamiento y la disección de los embriones son pasos difíciles de aprender, dado que el manejo del embrión de ratón requiere ciertas habilidades manuales. El procedimiento será demostrado por la Dra. Justina Suk, quien es postdoctoranda en mi laboratorio, y por la estudiante de posgrado Caterina Dres.

Después de sacrificar un ratón preñado a los 13 o 14 días posteriores a la inseminación y extraer los cuernos uterinos, enjuáguelos brevemente en etanol al 70 % y colóquelos en un tubo Falcon que contenga PBS, utilizando condiciones asépticas bajo una campana de cultivo de tejidos. Coloque los cuernos uterinos en una placa de Petri y separe cada embrión de su placenta y saco embrionario. Retire la cabeza y los órganos rojos, lave los restos del embrión con PBS y colóquelos en una placa de Petri limpia utilizando una cuchilla estéril.

Finalmente, pique el tejido hasta que sea posible pipetearlo. A continuación, agregue un mililitro de trips al 0,05 % en EDTA y 100 K unidades por embrión de DNAsa I. Luego, transfiera el tejido a un tubo Falcon de 50 mililitros e incúbelo durante 15 minutos a 37 °C.

Después de cada cinco minutos de incubación, separe las células pipeteando cuidadosamente hacia arriba y hacia abajo. Inactive la tripsina añadiendo aproximadamente un volumen de medio meth.Medium recién preparado. Centrifugue las células durante cinco minutos a baja velocidad.

Retire cuidadosamente el sobrenadante y resuspenda el sedimento en medio metílico tibio. Prepare frascos recubiertos con gelatina al 0,2 % e incúbelos durante al menos dos horas. A temperatura ambiente, siembre las células procedentes de aproximadamente tres a cuatro embriones en cada frasco recubierto con gelatina al 0,2 %. Los fibroblastos son las únicas células con capacidad de adherirse a los frascos recubiertos con gelatina.

Después de aproximadamente 24 horas, cuando las células alcancen una confluencia del 80 al 90 %, congele algunas células a menos 80 grados Celsius. Para uso futuro, amplíe las células restantes hasta el pase tres o pase cuatro. Para preparar las células alimentadoras utilizando los matraces pase tres o pase cuatro, comience por recubrir frascos T150 con gelatina al 0,2 % e incubar a temperatura ambiente durante al menos dos horas.

Diluya la mitomicina C en PBS y filtre a través de un filtro de jeringa. Aspire el medio del met y lávelos con PBS sin calcio ni magnesio. Añada 20 mililitros de medio que contenga 10 microgramos por mililitro de mitomicina C sobre los met y incúbelos durante dos horas a 37 grados Celsius.

A continuación, lave las células dos veces con PBS y trípselas. Después de la incubación y resuspensión, suspenda las células en medio met., luego centrifugue las células y resuspenda en medio met. tibio. Siembre las células a una densidad de 56.000 células por centímetro cuadrado en frascos T uno 50 y encúbrelas durante la noche al día siguiente de sembrar las células met.

Sustituya el medio de cultivo por medio no acondicionado para HESC, suplementado con cuatro nanogramos por mililitro de FGF2, y coloque en el incubador a 37 grados Celsius. 24 horas después, recoja el medio acondicionado de los frascos y sustitúyalo por medio fresco para HESC. Almacene el medio recolectado a menos 20 grados Celsius.

Repita la recogida durante un total de seis días después de la sexta recogida. Combine todo el medio y filtre el líquido. Luego, almacénelo en alícuotas de 50 mililitros a menos 80 grados Celsius.

Para medir el activo en a, en medio enriquecido, llevar todas las muestras y reactivos a temperatura ambiente. Diluir el anticuerpo contra el activo en a en PBS con 1% de BSA y añadir 100 microlitros a los pocillos de una microplaca. Incubar durante toda la noche a temperatura ambiente tras 24 horas.

Lave los pocillos tres veces con PBST. Luego bloquee los pocillos durante una hora a temperatura ambiente. Mientras tanto, prepare una curva estándar activa, que incluya siete diluciones y una muestra en blanco utilizando un rango de trabajo de 0,25 a 32 nanogramos por mililitro.

Agregue duplicados de los patrones y muestras a los pocillos e incube durante dos horas a temperatura ambiente. Lave los pocillos tres veces con PBST. A continuación, agregue un anticuerpo secundario biotinilado e incube durante dos horas a temperatura ambiente.

Luego, lave los pocillos tres veces con PBST y añada estreptavidina HRP. Después de mezclar y añadir el sustrato, envuelva las placas para protegerlas de la luz e incube durante 20 minutos a temperatura ambiente. Añada 100 microlitros de solución de parada a cada pocillo y mezcle suavemente.

Finalmente, configure el lector de microplacas a cuatro 50 nanómetros con corrección de longitud de onda a cinco 40 o cinco 70 nanómetros, y determine la densidad óptica de cada pocillo mostrado. A continuación se muestra la morfología típica de las CEP h indiferenciadas, cultivadas en presencia de células alimentadoras, medio acondicionado y medio definido. En estos ejemplos, las CIP h se cultivan en presencia de células alimentadoras.

Estas imágenes muestran la morfología de los mitos y las células alimentadoras inactivadas utilizadas para preparar el medio acondicionado. En general, las células deben estar confluentes 24 horas después del aislamiento y listas para ser congeladas o expandidas. Sin embargo, a veces puede llevar de dos a tres días obtener cultivos confluentes.

El medio condicionado debe prepararse a partir de células en el pase cuatro y no después. Esto es crucial porque las células primarias solo pueden expandirse durante cuatro a cinco pases antes del inicio de la senescencia. Se considera que la citocina activa en a es uno de los factores más críticos secretados por las células alimentadoras para el sostenimiento del crecimiento indiferenciado de células pluripotentes.

Medir el nivel de activo en un medio acondicionado, como se muestra aquí, es un ensayo cuantitativo conveniente para monitorear la calidad de los mets. Una vez dominado, el aislamiento de fibroblastos embrionarios de ratón puede realizarse en una a dos horas si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar criar los animales con anticipación y preparar y autoclavar todos los instrumentos de antemano.