Name: 위반 항생제 효능을 테스트하는 인공 가래 매체의 사용 녹농균 낭성 섬유증의 폐 관련성이 높은 조건에서 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: 배우세요 인공 가래 매체를 사용하여 낭성 섬유증 폐 환경에서 녹농균 바이오필름의 항생제 내성을 평가하는 방법을. 이 기술은 생리학적 조건에서 항생제 효능을 정량화하여 만성 감염 치료 전략 개선에 기여합니다.

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우리는 건강 연구를위한 영국 국립 연구소, 박사 Hadwen 트러스트 동물 애호 연구소, 영국의 선도적인 의료 연구 자선 기금은 독점적이 아닌 동물 연구 기법을 동물 실험을 대체하기 위해, 그리고 Wellcome 트러스트 (그랜트 089215)의 지원을 인정합니다. 우리는 또한 노바티스 제약 영국 공사 (무제한 교육 교부금)을 인정합니다.

1. 인공 가래 매체의 준비 (ASM) <ol><li> 몇 시간에 걸쳐 매우 느리게 생선 정자에서 250 ML 멸균 물에 4g의 DNA를 추가합니다. DNA는 완전히 분해하는 데 몇 시간이 소요되며 실온에서 하룻밤 흔들 수있다. </li><li> mucin가 완전히 해소되기 전까지 돼지의 복부 (타입 II) 느리게 250 ML 멸균 물에서 5g의 mucin을 추가합니다. 솔루션은 4에서 하룻밤 흔들 수있다 ° C. </li><li> 100 ML 멸균 물 속에서, L-티로신과 L-시스테인의 예외와 함께, 각 필수 및 비 필수적인 L-아미노산의 0.25 g를 해산. 0.5 M의 수산화 칼륨 25 ML 멸균 물의 L-티로신의 (M R 56.11 g / 몰) 및 0.25 g의 25 ML에 L-시스테인의 0.25 g를 해산. </li><li> 5.9 MG diethylenetriaminepentaacetic 산 (DTPA), 멸균 물 100 ML에서 KCl의 5g NaCl 2.2 g을 용해. </li><li> 1리터 병에 DNA, Mucin, L-아미노산, DTPA, NaCl과 KCl을 결합. </li><li> 계란 노른자 전자의 5 ML 추가mulsion 및 멸균 물 약 850 ML로 채웁니다. </li><li> 1 M 트리스 (산도 8.5; M R 121.14)과 6.9로 산도를 조절하고 살균 물로 볼륨 1리터로 와요. </li><li> 각각 0.22 μm의 45 mm의 구멍과 목에 크기로 Vacuubrand ME 2 격막 진공 펌프 및 Millipore Steritop 필터 장치를 이용하여 여과하여 ASM을 소독. 각 Steritop 필터 유닛은 세 번 즉시 다시 사용할 수 있지만 필터 다시 사용하기 전에 멸균 물로 두 번 씻어서해야합니다. 여과 과정은 느리게 그리고 2 일 동안 수행할 수 있습니다. ASM의 다른 버전 대신에 가능한 약물 상호 작용에 의한 여과 그러나 11의 항생제의 추가를 사용하는 것이 개발되어, 우리는이 특정 응용 프로그램에 대한 방법을 권장하지 않습니다. </li><li> 필터없는 그리고 ASM 필터링은 어두운에서 4 ° C에 보관해야합니다. 신선한 ASM을 사용하는 것은 권장하지만, 그것은 1 개월 최대 이러한 조건 하에서 보관하실 수 있습니다. </lI&gt; </ol> 2. Planktonic 고착의 셀 최소 신진 대사 억제 농도 (PSMIC)의 결정 <ol><li> 15 planktonically 성장 P.의 최소 신진 대사 억제 농도 (PSMIC) 값을 확인하려면 녹농균이라는 박테리아의 분리, 항균 화학 요법 BSAC 12 영국 사회의 가이드라인에 설명된대로 microdilution 방법은, 수행하여야한다. 선택의 항생제,이 경우 tobramycin의 황산염에 순차적으로 항생제 농도의 적절한 범위를 제공하기 위해 96 - 웰 플레이트에 microtitre Luria-Bertani (LB) 배지에 희석한다. </li><li> P.의 야간 문화를 희석 0.05의 OD 600 ~ LB에서 박테리아 (± 0.01)과 순차적으로 희석 항생제 100 μl를 포함하는 96 - 웰 microtitre 플레이트의 우물에 100 μl 볼륨을 추가합니다. 0.5 μg / ML -이 경우, tobramycin 황산염의 최종 농도는 512 사이에서 원거리. 여덟은 각 antib의 복제iotic 집중력이 수행되어야한다. </li><li> 각 격리에 대한 부정적 제어 우물은 더 항생제가 추가되지되는, 설정해야합니다. 또한, 여덟 웰스는 다운 스트림 분석하는 동안 공백으로 사용 (제 2.6)에 대해서만 LB를 포함해야합니다. </li><li> (5 % O이 10 % CO 2, 그리고 85% N 2) 에어로빅이나 microaerophilic 조건 하에서 떨지 않고 37 ° C에서 2 일 - 1 96 - 웰 microtitre 번호판을 품어. Microaerophilic 조건은 대형 무산소 항아리에 CampyGen 가스 생성 팩을 사용하여 얻을 수 있습니다. </li><li> 부화 후, 세균성 성장 Fluostar 오메가 microplate 리더와 MARS 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 600 nm의 파장의에서 각도의 세균성 문화의 흡광도를 측정하여 결정됩니다. </li><li> 항생제 - 처리 planktonic 문화 (항생제 치료 planktonic 세포)과 부정적인 컨트롤 (제어 부정)에서 흡수에서 흡수 뺀것에 의해 해결되어야유일한 우물이 포함된 LB (빈)에서 얻은 배경 흡광도의 이온. 생존의 비율 억제는 이후 X 100 % (항생제 치료 planktonic 전지를 의미 / 부정적인 통제를 의미)로 계산됩니다. PSMIC 90은 planktonic 세균의 성장을 90 % 억제를 일으키는 항생제 농도로 정의됩니다. </li><li> 선택의 항생제, 10 0.02 %의 μl (V / V) resazurin이 (증류수에 희석) 각도에 추가되고 접시가 1 호기성 조건 하에서 incubated하고 치료 후 세균의 생존을 결정하기 위해서 - 37.2에서 2 H ° C, 150 rpm으로 떨고있는 동안. 실행 가능한 세포가 형광 핑크 resorufin 양식으로 푸른 resazurin을 염색 줄어 듭니다. </li><li> resazurin과 부화에 따라 각각 아니라 540 nm의의 여기 파장과 Fluostar 오메가 microplate Reader에서 590 nm의의 방출 파장을 사용하는 형광을 모니터합니다. 이 설명한 것처럼 데이터를 분석해야낮은. </li></ol> 3. Biofilm 고착의 세포 최소 억제 농도의 결정 (BSMIC) <ol><li> P.의 숙박 문화 녹농균이라는 박테리아가 (이 경우, P. 박테리아의 15 분리가 사용됩니다) 0.05의 OD 600 (± 0.01), 신선한 ASM에 나서 더욱 희석 1:100으로 LB에 희석한다 (총 판매량 1.8 ML). </li><li> 희석 문화 (1.8 ML)는 24 잘 조직 문화 처리 강판의 각도에 추가되어 있어야합니다. 세 우물은 다운 스트림 분석하는 동안 공백 (제 3.9)로 사용하기 위해 ASM 포함되어야합니다. </li><li> 75 rpm으로 떨고있는 동안, 37 ° C에서 에어로빅이나 microaerophilic 조건 하에서 3 일간 실험실 parafilm과 부화로 24 잘 번호판을 고정합니다. Microaerophilic 조건은 대형 무산소 항아리에 CampyGen 가스 생성 팩을 사용하여 얻을 수 있습니다. </li><li> 신선한에 적절한 농도 범위를 제공하기 위해,이 경우 tobramycin의 황산염에 선택의 항생제를 희석ASM. 1 μg / ML -이 경우, 최종 농도 512 사이의 원거리. 24 잘 플레이트의 적절한 우물에 200 μl의 볼륨에서 항생제의 각 농도를 추가합니다. 넷은 각 항생제 농도 복제 수행해야합니다. 선택의 항생제에 노출되지 Biofilms는 부정적인 제어로 사용되었다. </li><li> 75 rpm으로 떨고있는 동안, 37의 추가 24 H를위한 에어로빅이나 microaerophilic 조건 ° C 하에서 실험실 parafilm과 부화로 24 잘 번호판을 고정합니다. </li><li> 선택의 항생제의 존재에서 부화 후 100 100 μl MG / ML cellulase (0.05 M의 구연산 완충액으로 희석 [9.6 g / L Citrate.H NaOH와 물, 산도 2 0-4.6]를 사용하여 세균성 biofilms를 중단 1 H 150 rpm으로 흔들어하면서)와, 37 ° C에서 호기성 조건 하에서 24 잘 번호판을 품어. 필요한 경우, biofilms는 더 이상이 단계에서 수동 pipetting에 의해 중단될 수 있습니다. </li><li> 신진 대사 활동을 확인하려면교란 biofilms에서 풀려나 세균 세포, 0.02 % 100 μl (V / V)이 resazurin은 (증류수에 희석) 24 잘 플레이트의 각도에 추가되어 있어야하며 1 incubated - 37 ° C에서 2 시인데 150 rpm으로 떨고있는 동안. </li><li> resazurin과 부화에 따라 각각 아니라 540 nm의의 여기 파장과 Fluostar 오메가 microplate 리더와 MARS 데이터 분석 소프트웨어에서 590 nm의의 방출 파장을 사용하는 형광을 측정합니다. </li><li> 항생제 - 대우 biofilms (F-항생제 치료를 biofilms)과 부정적인 컨트롤 (F 부정적인 컨트롤)에서 형광의 형광은 ASM 들어있는 우물에서 얻은 배경 형광 뺄셈에 의해 해결되어야만이 (F 빈). 생존의 비율 억제는 이후 X 100 % (F 항생제 치료를 biofilms의 의미 / F 부정적인 통제를 의미)로 계산됩니다. BSMIC 90은 antibio로 정의됩니다안면 경련 농도는 대사 활동의 90 % 억제를 일으킨다. </li></ol> 4. 대표 결과 ASM biofilm 형성은 소형 (2 ML) 볼륨에 가능하며 biofilms 완전히 삼일 (그림 1A) 내에 형성된다. 이것은 엄격하게 방해하기 어려울해야 biofilm을 pipetting으로 증명 할 수 있습니다. microcolonies 더 큰 볼륨 4 (그림 1B)에서 자란 것과 비교할 수 있습니다. 그림 2는 전자 현미경 이미지 분석에 의해 감지로 planktonically 및 biofilm의 성장 세포 사이의 주요 차이점을 보여줍니다. Biofilm 문화는 분명히 biofilm 내의 세포 및 개인 구조를 둘러싼 세포외 기질의 상당한 수준을 파악하기 어려운 보여줍니다. 몇몇 연구들은 biofilm 생활은 항균 자화율 13, 14에 영향을 미칠 수있는 것이 좋습니다. 저희 소규모 ASM 분석은 dete하는 데 사용할 수 있습니다동시에 여러 개의 분리에 대한 여러 항생제의 BSMIC을 rmine. 분석의 흐름은 그림 3에 표시됩니다. 세균 세포 생존 능력에 대한 항생제의 효과 resazurin 분석을 사용하여 측정할 수있다. 항생제,이 경우 tobramycin에 설립 biofilm에 추가할 수와 24 H를 위해 incubated. 이 biofilm이 파손되고 resazurin이 추가되면. Metabolically 활성 세포는 분홍색 (resorufin) 15 블루 (resazurin)에서 색상 변화가 발생 resazurin 염료를 줄일 수 있습니다. 그림 4A는 예제 분석을 표시하는 P. 박테리아는 microtitre 플레이트의 biofilm 장애 및 resazurin의 추가 이전 tobramycin의 다양한 농도로 incubated되었다. 실행 가능한 세포가 형광 핑크 형태 resorufin에 염료를 줄이고 반면에 청색이 아닌 형광 컬러가 아닌 실행 가능한 세포를 나타냅니다. SMIC는 다음 백분율로 형광 변환하여 계산할 수세균 생존에 남아. 그림 4B하면 증가 tobramycin 농도와 %의 생존 능력의 변화를 보여줍니다. 10 %의 생존 능력은 SMIC 90을 계산하기 위해 절단으로 선정되었다. 호기성 조건에서 tobramycin SMIC 90 값은 planktonic 문화보다 biofilm로 성장 세포에 대해 높은 있습니다. 표 1은 테스트를 모두 분리를위한 PSMIC 90 BSMIC 90의 편차를 보여줍니다. LB (planktonic 모드)에 비해 ASM (biofilm 모드) 재배 때 호기성 조건 하에서, tobramycin에 대한 저항의 극적인 증가 (2 SMIC에서&gt; 32 배 증가)가 가장 분리에 대한 관찰되었다는 표 2 보여줍니다. 호기성 조건 하에서 재배 biofilms에 비해 또한, microaerophilic 조건 하에서 재배 biofilms 2 사이&gt; 128 배로 증가 SMIC을 전시. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3857/3857fig1.jpg" /> 그림1. ASM P.의 P. 박테리아의 Biofilm 형성 녹농균이라는 박테리아 스트레인 PAO1은 ASM 재배 macroscopically 보이는 대단히 짧은 시간을 (microcolonies) 형성합니다. 스크류 캡 유리 듀란 flasks. B, 2 ML ASM 문화의 Biofilm 형성 (7 일 성장 후 30 ML ASM 문화에서, Biofilm 형성 (대규모) 소규모) 24 - 잘 폴리스티렌 플레이트 3 일 성장 후. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3857/3857fig2.jpg" /> 그림 2. ASM biofilms의 TEM의 micrographs / C TEM 현미경, PAO1 중 (X 27,000) PAO1grown planktonic의 B / D TEM 현미경 (x57, 000), 각각 planktonically와 ASM의 성장 및 ASM에서 각각. Planktonically 성장 박테리아는 LB의 국물에서 하룻밤 재배되었다. Biofilms 30 ML ASM 문화 7 일간 재배되었다. 검은색 화살표는 biofilm 내에서 셀 참조와 별이 세포외 공간을 참조하십시오. 스케일 바 = 1μm의. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3857/3857fig3.jpg" /> 그림 3. ASM biofilm 항균 자화율 분석의 워크플로우. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3857/3857fig4.jpg" /> 4 그림. 세균성 세포는 다른 항생제의 농도와 잔여 신진 대사 활동이 resazurin을 사용하여 결정되었다들과 incubated 있었다 항생제 감정의 결정에 대해 resazurin 사용., resazurin의 블루 비 형광 산화 양식이 아닌 실행 가능한 세포를 지적하고 신진 대사에 의해 감소됩니다 핑크색 형광 resorufin. B에 활성 세포는 형광 강도가 남아있는 세균의 생존의 비율로 변환됩니다. 10 %의 생존 능력은 MSMIC90을 계산하기 위해 절단으로 선정되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3857/3857fig4large.jpg" target="_blank">고맙다을 보려면 여기를 누르십시오</a>GER 그림. </span&gt; <table border="1"><tbody><tr><td rowspan="2"> 변종 </td><td colspan="2"> PSMIC 90 (μg / ML) 1 </td><td colspan="2"> BSMIC 90 (μg / ML) 1 </td></tr><tr><td> 호기성의 </td><td> Microaerophilic이 </td><td> 호기성의 </td><td> Microaerophilic이 </td></tr><tr><td> PAO1 </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 8 </td><td> &gt; 512 </td></tr><tr><td colspan="5"> 리버풀 전염병 스트레인 (레) 분리 </td></tr><tr><td> LESB58 21 </td><td> 8 </td><td> 64 </td><td> 64 </td><td> 128 </td></tr><tr><td> LES400 22 </td><td> 32 </td><td> 128 </td><td> 8 </td><td> 256 </td></tr><tr><td> LESB25 </td><td> 16 </td><td> 32 </td><td> 256 </td><td> 512 </td></tr><tr><td> LESB55 </td><td> 16 </td><td> 64 </td><td> 64 </td><td> &gt; 512 </td></tr><tr><td> LESB64 </td><td> 16 </td><td> 64 </td><td> &gt; 512 </td><td> &gt; 512 </td></tr><tr><td> LES431 22 </td><td> 4 </td><td> 8 </td><td> 32 </td><td> &gt; 512 </td></tr><tr><td> LESB49 </td><td> 16 </td><td> 64 </td><td> 64 </td><td> 256 </td></tr><tr><td> LES109 </td><td> 32 </td><td> 128 </td><td> 32 </td><td> &gt; 512 </td></tr><tr><td colspan="5"> 비 레 분리 </td></tr><tr><td> 49,461 </td><td> 16 </td><td> 32 </td><td> 16 </td><td> &gt; 512 </td></tr><tr><td> 59,032 </td><td> 0.5 </td><td> 2 </td><td> 4 </td><td> &gt; 512 </td></tr><tr><td> 59,073 </td><td> &gt; 512 </td><td> &gt; 512 </td><td> &gt; 512 </td><td> &gt; 512 </td></tr><tr><td> 59,076 </td><td> 16 </td><td> 32 </td><td> 32 </td><td> &gt; 512 &lt;/ TD&gt; </tr><tr><td> 27 </td><td> 8 </td><td> 16 </td><td> 4 </td><td> &gt; 512 </td></tr><tr><td> 45 </td><td> 16 </td><td> 32 </td><td> 4 </td><td> &gt; 512 </td></tr></tbody></table> 표 1. tobramycin에 P. 박테리아의 자화율. PSMICs 및 BSMICs tobramycin 결정에 대한 1은 2 배 시리얼 dilutions에 사용되었다 512에 이르기까지 - 0.5 μg / ML (N = 각 농도 8) 및 512-1 μg / ML (N = 4 각 농도), 각각; PSMICs는 표준을 사용하여 결정됩니다 microdilution 방법 1. 이 Microaerophilic 조건 5 % O이 10 % CO 2, 그리고 85% N이 있었다. <table border="1"><tbody><tr><td rowspan="2"> 변형 </td><td colspan="4"> PSMIC 90 / BSMIC 90 배 변화 1 </td></tr><tr><td> PSMIC 에어로빅 → PSMIC microaerophilic </td><td> BSMIC 에어로빅 → BSMIC microaerophilic </td><td> PSMIC 에어로빅 → BSMIC 에어로빅 </td><td> microaerophilic PSMIC → BSMIC microaerophilic </td></tr><tr><td> PAO1 </td><td> 0 </td><td> &gt; 64 </td><td> 2 </td><td> 128 </td></tr><tr><td colspan="5"> 레 분리 </td></tr><tr><td> LESB58 </td><td> 8 </td><td> 2 </td><td> 8 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> LES400 </td><td> 4 </td><td> 32 </td><td> 0.25 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> LESB25 </td><td> 2 </td><td> 2 </td><td> 16 </td><td> 16 </td></tr><tr><td> LESB55 </td><td> 4 </td><td> &gt; 8 </td&gt; <td> 4 </td><td> &gt; 8 </td></tr><tr><td> LESB64 </td><td> 4 </td><td> ND </td><td> &gt; 32 </td><td> &gt; 8 </td></tr><tr><td> LES431 </td><td> 2 </td><td> &gt; 16 </td><td> 8 </td><td> &gt; 64 </td></tr><tr><td> LESB49 </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> LES109 </td><td> 4 </td><td> 16 </td><td> 0 </td><td> &gt; 4 </td></tr><tr><td colspan="5"> 비 레 분리 </td></tr><tr><td> 49,461 </td><td> 2 </td><td> &gt; 32 </td><td> 0 </td><td> &gt; 16 </td></tr><tr><td> 59,032 </td><td> 4 </td><td> &gt; 128 </td><td> 8 </td><td> &gt; 256 </td></tr><tr><td> 59,073 </td><td> ND </td><td> ND </td><td> ND </td><td> ND </td></tr><tr><td> 59,076 </td><td> 2 </td><td> &gt; 16 </TD&gt; <td> 2 </td><td> &gt; 16 </td></tr><tr><td> 27 </td><td> 2 </td><td> &gt; 128 </td><td> 0.5 </td><td> &gt; 32 </td></tr><tr><td> 45 </td><td> 2 </td><td> &gt; 128 </td><td> 0.25 </td><td> &gt; 16 </td></tr></tbody></table> 표 2. PSMICs 및 tobramycin에 BSMICs의 공간 변화. 결정되지 일 노스다코타; 굵게 표시된 값은 SMIC 배 변경&gt; 10를 나타냅니다.

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</ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

본 연구에서는 P.을 복제하기 위해 ASM을 기반으로 체외 모델에서 소설을 사용한 CF의 폐 사 내에서 박테리아의 biofilm 조건입니다. 모델은 항균 대리인의 소규모 높은 처리량 테스트를 성공적으로 바뀌었습니다. 이 분석의 중요한 단계는 다음과 같습니다 <ol><li> ASM 미디어 및 유지 불임의 일관된 준비. 우리는 각각의 구성 요소를 재현할 결과 때마다을 달성하기 위해 추가되는 방식을 최적화로 오랜 시간을 헌신했다. ASM의 여과가 느린지만 mucin 구성 요소가 손상될 수 있습니다 autoclaving에 바람직합니다. 이것은, 상당한 선택적 압력, 드라이브 변이를 부과 prophage 용해 16를 유도하고 상당히 여러 세균성 유전자의 표현을 변경할 수 있기 때문에 우리는 타인 11 시까지 제안 항생제의 추가, 조언하지 않습니다. </li><li> 분석은 볼륨 O에 따라 최적화되어야합니다F ASM이 사용됩니다. 떨고있는 속도보다 작은 볼륨 증가하고 짧은 biofilm 생명주기가 관찰된다. </li></ol> 소규모 ASM biofilm 모델의 명백한 응용 프로그램은 biofilm 항균 감정 (BSMIC 90)의보다 현실적인 결정이다. 무산소와 microaerophilic 틈새는 CF의 폐에 존재하며 산소가 성숙 biofilms 2, 17 안에 깊은 제한되어있다는 증거가있다. 여기 보여주는 그 14분의 10 임상 P. ASM의 microaerophilic 조건 하에서 tobramycin에 대한 감수성의 감소 - CF 환자 sputa에서 박테리아의 분리는 상당한 (≥ 128 배 4) 전시. 본 연구의 결과는 tobramycin과 같은 항생제가, P. 대해 덜 효과적일 수 있다고 제안 기존의 자화율 시험 방법에 의해 표시된 것보다 CF의 폐에 박테리아 감염. 이러한 결과는 biofilms 10 항균 자화율에 대한 이전의 연구를 반영합니다. 소형규모 ASM assays 따라서 더 나은 치료 결정을 알리기 위해 의미있는 항생제 자화율 데이터를 생성하는 간단한 높은 처리량 플랫폼을 제공합니다. 분석은 그 하나의 식민지에서 기존의 항생제 자화율 시험으로 전체 인구를 대표하지 않을 수 있습니다 스크리닝을 위해 선택되고 같은 방법으로 제한됩니다. 그러나이 아닌 표면에 부착된 biofilm 성장과 microaerophilic 조건 (2) 적용을 사용하는 접근 방식은 (i), 명확한 대안과 기존 방법에 대한 잠재적인 개선을 나타냅니다 있다고 생각합니다. 이 분석은 P.를 공부하기 적합한 모델입니다 결론 녹농균이라는 박테리아의 biofilm의 인구. 임상 설정에서 더 자세한 테스트는 항생제 감정이 biofilm - 성장 P. 토대로 여부를 확인할 것 박테리아는 잠재적으로 향상 미생물과 임상 결과와 다른 항생제의 선택으로 이어질 수 있습니다. 고전 biofilm 모델을 사용하여 비슷한 조사는 BSMIC 가치가 이어질 것으로 나타났습니다항생제 치료 5,17에 대해 다른 권장합니다. 안티 infective 요원의 효과에 대한 테스트 이외에도, ASM 시스템은 P.의 다양성을 이해 겨냥한 것과 연구를위한 동물 모델로 저렴, 간단하고 재현성 대안을 나타냅니다 녹농균이라는 박테리아의 집단. 우리는 P. 자연 인구에 광범위한 이질을 관찰했습니다 박테리아는 CF 환자 sputa 18 일, 19 일부터 회복. 비슷한 phenotypic 및 genotypic 다양성은 그것 CF 폐 조건의 체외 모델의 매력 만들기, ASM 4 (우리의 게시되지 않은 데이터) 성장하는 동안 볼 수 있습니다. ASM 모델의 상대적인 단순 그것이 쉽지 장기 적응 실험은 P.에 항생제 또는 다른 스트레스의 효과를 모니터링에서, 예를 들어, 목표로 설계하게 녹농균이라는 박테리아 인구 발산. 또한, 다른 세균성 병원균은 재배하실 수 있습니다ASM. 예를 들어,. 2007 S.하여 biofilm 형성을 연구하기 위해 ASM Fouhy 외 사용했을 maltophillia 20.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 어류 정자의 DNA </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 74,782 </td></tr><tr><td> 돼지의 위, 2 형에서 Mucin </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> M2378 </td></tr><tr><td> L-알라닌 </td><td> Acros의 생명체 </td><td> 102,830,250 </td></tr><tr><td> L-아르기닌 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> A5006 </td></tr><tr><td> L (+)-아스파라긴 일수화물 </td><td> Acros의 생명체 </td><td> 175,271,000 </td></tr><tr><td> L (+)-아스파르트산 </td><td> Acros의 생명체 </td><td> 105,041,000 </td></tr><tr><td> L-시스테인 </td><td> 시그마 - Adrich </td><td> 168,149 </td></tR&gt; <tr><td> L (+)-Glutamic 산 </td><td> Acros의 생명체 </td><td> 156,211,000 </td></tr><tr><td> L-글루타민 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> G3126 </td></tr><tr><td> 글리신 </td><td> Acros의 생명체 </td><td> 220,911,000 </td></tr><tr><td> L-히스티딘 </td><td> 시그마 - Adrich </td><td> H8000 </td></tr><tr><td> L-이소 류신 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> I2752 </td></tr><tr><td> L-류신 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> L8000 </td></tr><tr><td> L (+)-라이신 염산염의 </td><td> Acros의 생명체 </td><td> 125,222,500 </td></tr><tr><td> L-메티오닌 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> M9625 </td></tr><tr><td> L-페닐알라닌 </td><td> Acros의 생명체 </td><td> 130,310,250 </td></tr><tr><td> L-프롤린 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> P0380 </td></tr><tr><td> L-세린 </td><td> Acros의 생명체 </td><td> 132,660,250 </td></tr><tr><td> L-트레오닌 </td><td> Acros의 생명체 </td><td> 138,930,250 </td></tr><tr><td> L (-)-트립토판 </td><td> Acros의 생명체 </td><td> 140,590,250 </td></tr><tr><td> L-티로신 </td><td> Acros의 생명체 </td><td> 140,641,000 </td></tr><tr><td> L-발린 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> V0500 </td></tr><tr><td> Diethylenetriaminepentaacetic 산 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 32,318 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 피셔 과학 </td><td> S/3160/60 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> BDH </td><td> BDH0258 </td></tr><tr><td&gt; 코이 </td><td> BDH </td><td> BDH0262 </td></tr><tr><td> 계란 노른자 유제 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 17,148 </td></tr><tr><td> ME 2 격막 진공 펌프 </td><td> Vacuubrand </td><td> 696,126 </td></tr><tr><td> Steritop 필터 (구멍 크기 : 0.22 μm의, 목이 크기 : 45 ㎜) </td><td> Millipore </td><td> SCGPT10RE </td></tr><tr><td> Luria-Bertani 매체 </td><td> 시그마 </td><td> L2897 </td></tr><tr><td> 96 - 웰 microtitre 플레이트 </td><td> Sarstedt </td><td> 82.1581 </td></tr><tr><td> 24 잘 조직 문화 처리 접시 </td><td> 이와키 </td><td> 3820-024 </td></tr><tr><td> CampyGen 가스 생성 팩 </td><td> Oxoid </td><td> CN0025 </td></tr><tr><td> Microaerophilic 챔버 </td><td> Oxoid </td><td> HP0011 </td></tr><tr><td> Tobramycin 황산염 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> T1783 </td></tr><tr><td> Cellulase, Aspergillus 니제르에서 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 22,178 </td></tr><tr><td> Resazurin </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 199,303 </td></tr><tr><td> Citrate.H 2 0 </td><td> BDH </td><td> BDH0288 </td></tr><tr><td> Fluostar 오메가 microplate 리더 </td><td> BMG-Labtech </td><td> SPECTROstar 오메가 </td></tr></tbody></table>

위반 항생제 효능을 테스트하는 인공 가래 매체의 사용<em&gt; 녹농균</em&gt; 낭성 섬유증의 폐 관련성이 높은 조건에서

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

P.의 분리에 적용했을 때 체외 항균 자화율 시험에의 관련성에 대한 우려가 증가하고 낭성 섬유증 (CF) 환자에서 박테리아. 기존 방법은 하나의 의지 또는 몇 분리가 aerobically 및 planktonically 성장. 미리 결정된 컷 오프는 박테리아가 민감하거나 특정 항생제 1 ~ 내성 여부를 정의하는 데 사용됩니다. 그러나, CF, P.의 만성 폐 감염시 녹농균이라는 박테리아의 인구는 biofilms에 존재하고 환경이 크게 microaerophilic이라는 증거가있다. 폐 및 진단 테스트를하는 동안 이들의 박테리아 사이의 조건에서 뚜렷한 차이는 질문에이 테스트 3도 신뢰성과 타당성을 촉구했다. 인공 가래 매체 (ASM)는 아미노산, mucin과 무료 DNA를 포함한 CF 환자의 가래의 구성 요소를 포함하는 문화 매체입니다. P. 박테리아 &lt;/ 그들을 자기 수렴 biofilm 구조와 인구 발산 4,5,6의 형성과 CF 감염, 중 ASM 싫어하지 &#39;의 성장에&gt; 성장. 본 연구의 목적은 피의 항균 자화율 공부를 microtitre-플레이트 분석을 개발하는 것이었다 박테리아는 microaerophilic 및 호기성 조건 모두에 적용 ASM, 성장을 바탕으로. ASM 분석은 microtitre 플레이트 형식으로 개발되었습니다. P.는 녹농균이라는 박테리아의 biofilms은 24 시간 동안 서로 다른 농도에서 사전 항균 대리인과 부화까지 3 일간 개발할 수있게되었다. biofilm 장애 후 세포 생존 능력은 resazurin으로 더럽히는 것으로 측정되었습니다. 이 분석은 15 종류의 P. 위해 tobramycin의 고착의 세포 최소 억제 농도 (SMIC)를 확인할 사용된 에어로빅과 microaerophilic 조건과 SMIC 가치관 하에서 박테리아의 분리는 표준 국물의 성장과 함께 얻은 사람에 비해되었다. 거기 렸죠그들의 planktonic의 대응에 비해 ASM 재배 분리를위한 증가 마이크 값에 대한 증거, 가장 큰 차이점은 ASM 시스템의 tobramycin에 대한&gt; 128 배 이상에 훨씬 증가 저항이 나타나기 microaerophilic 조건에서 테스트 박테리아 발견되었을 때 호기성 조건에서 실시 assays에 비해. 현재의 자화율 시험 방법과 임상 결과 사이 협회의 부족 3 전류 방식의 타당성에 의심을하고있다. 체외 모델에서 몇몇은 P.를 공부하기 위해 이전에 사용되었습니다 녹농균이라는 박테리아의 biofilms 7, 8. ASM biofilms이 CF의 폐 9 관찰 이들과 유사한 반면, 그러나, 이러한 방법은 표면 첨부된 biofilms에 의존하고 있습니다. 또한, 점액의 감소 산소 농도는 P.의 동작을 변경을 보여줘왔다 박테리아 2와 항생제 자화율 10 달러에 영향을 미칩니다. 따라서 usinmicroaerophilic 조건에서 g ASM은 항균 자화율를 연구하기에서보다 현실적인 환경을 제공할 수 있습니다.

현재 진단 항균 자화율 테스트는 영양소 풍부한 호기성 조건에서 분리의 planktonic 성장에 의존하고 있습니다. 여기서는 낭성 섬유증의 폐 더 많은 대표적인 두 에어로빅과 microaerophilic 조건에서 녹농균의 biofilms의 항균 자화율 공부를 대체 인공 가래 매체를 사용합니다.

낭성 섬유증 환자로부터 분리한 P. aeruginosa 균주에 적용할 때, 체외 항균제 감수성 시험의 관련성에 대한 우려가 커지고 있습니다.

본 실험의 목적은 정의된 인공 가래 배지를 사용하여 낭성 섬유증 폐의 만성 감염을 대표하는 조건 하에서 pseudomonas Aerogen 바이오필름에 대한 항생제의 효능을 평가하는 것입니다. 세균 바이오필름은 24웰 마이크로타이터 플레이트에서 배양됩니다.그다음 바이오필름을 항생제에 노출시킵니다. 이어서 항생제 처리된 배양물을 셀룰라아제(cellulase)를 사용하여 분해하고, 생존 세포에 의해 청색에서 분홍색으로 환원되는 대사 염료인 srin과 함께 배양합니다. 웰의 흡광도를 측정함으로써, 생리적 조건과 유사한 환경에서의 항생제 감수성을 정량화하기 위한 바이오필름 세균 최소 억제 농도(B-S-M-I-C)를 결정할 수 있습니다.부유 배양 기반의 최소 억제 농도 결정과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 가래의 모든 성분이 포함된 특수 배지에서 박테리아를 배양하여 바이오필름 형성을 촉진한다는 점입니다. 이러한 바이오필름은 항생제에 훨씬 더 높은 내성을 보입니다. 배지를 만들기 위해, 먼저 첫 번째 병에 250 milliliters의 멸균수를 담은 병 두 개를 준비하십시오.교반하며 서서히 4g의 어류 정자 DNA를 250mL의 멸균수에 첨가합니다. 실온에서 용액을 교반하여 DNA를 완전히 용해시킨 후 두 번째 병에 옮깁니다. 5g의 돼지 위 유래 2형 뮤신을 서서히 첨가하며 교반합니다.DNA와 뮤신 용액이 준비되면, L-tyrosine과 L-cysteine을 제외한 아미노산들을 100 mL의 멸균수에 녹입니다. L-tyrosine과 L-cysteine은 각각 25 mL의 물 또는 25 mL의 0.5 M potassium hydroxide에 녹여야 합니다. 다음으로, 5.9 mg의 DTPA, 5 g의 sodium chloride, 2.2 g의 potassium chloride를 100 mL의 물에 녹입니다. 이 모든 용액들을 1 L 병에 합친 후, 5 mL의 난황 에멀젼을 추가하고 물을 부어 혼합물의 최종 부피를 850 mL로 맞춥니다.1 M Tris를 사용하여 pH를 6.9로 조정한 후, 멸균을 위해 증류수를 더해 최종 부피를 1 L로 맞춥니다. Vacuum brand ME 2 다이아프램 진공 펌프와 45 mm 넥 및 0.2 µm 공극 크기의 Millipore Stericup 필터 유닛을 사용하여 배지를 여과합니다. 여과 과정은 이틀에 걸쳐 진행할 수 있습니다. A SM 배지는 4 °C에서 최대 한 달 동안 보관할 수 있습니다.먼저 밤새 배양한 *Pseudomonas aeruginosa* 배양액을 LB 배지로 희석하여 OD 0.05로 맞춥니다. 그다음, 희석된 박테리아를 SM 배지 플레이트에 1:100 비율로 추가 희석합니다. 24웰 조직 배양 플레이트의 21개 웰에 희석된 박테리아 배양액을 웰당 1.8 milliliters씩 분주하고, 나머지 3개 웰에는 공백 음성 대조군으로 사용할 동일한 부피의 SM 배지를 분주합니다. 24웰 플레이트를 밀봉하고, 바이오필름이 형성될 수 있도록 미호기성 조건 하에 둡니다. 이러한 조건은 대형 혐기성 자(jar) 내에 Campden 가스 발생 팩을 사용하여 조성할 수 있습니다.배양액을 37 °C에서 75 RPM으로 설정된 쉐이커에서 3일 동안 배양합니다. 3일 후면 박테리아 세포를 포함하는 젤라틴성 덩어리 형태의 바이오필름이 형성되며, 이는 피펫팅으로 분해되지 않습니다. 바이오필름이 형성되면 각 웰에 단계적으로 희석된 농도의 항생제를 200 µL씩 첨가합니다. 테스트할 각 약물 농도당 최소 4개의 반복구를 설정하고, 음성 대조군으로 사용할 바이오필름 포함 웰 4개는 처리하지 않은 상태로 둡니다.그 다음, 항생제 배양 후 플레이트를 24시간 동안 추가로 배양합니다. 바이오필름을 분해하기 위해 시트르산 완충액(citrate buffer)으로 100 mg/mL로 희석한 셀룰라아제(cellulase)를 웰당 100 µL씩 사용하며, 플레이트를 37 °C의 호기성 조건에서 150 RPM으로 설정된 쉐이커에서 1시간 동안 배양합니다. 이 배양 단계 이후, 배지에 세포 덩어리가 보일 경우 피펫팅을 통해 바이오필름을 추가로 분산시킬 수 있습니다.다음으로, 바이오필름에서 방출된 세포의 생존력을 정량화하기 위해 웰당 100 µL의 rezin을 첨가하고 세포를 1~2시간 동안 배양합니다. 37 °C에서 생존 가능한 세포만이 청색 zarin 염료를 분홍색 형광 형태로 대사할 수 있습니다. 배양 후, 샘플을 96 웰 플레이트로 옮기고 540 nm의 들뜸 파장과 590 nm의 방출 파장을 사용하여 웰의 형광을 측정합니다.박테리아의 생존력과 약물 감수성을 정량화하려면, 먼저 공백 대조군의 배경 형광 값을 다른 웰의 값에서 뺍니다. 그다음, 각 농도의 평균 형광 값을 처리하지 않은 대조군의 평균 형광 값으로 나누고 100을 곱하여 억제 백분율을 계산합니다. B-S-M-Y-C는 대사 활성을 90% 억제하는 항생제 농도로 정의되며, 이 전자현미경 사진에서 볼 수 있듯이 바이오필름 내에서 성장한 세포는 플랑크톤 배양으로 성장한 박테리아와 상당히 다릅니다.특히, 노란색으로 표시된 다량의 세포외 기질이 녹색의 바이오필름 내 세포들을 둘러싸고 있는 반면, 부유성 콜로니에서는 나타나지 않습니다. 또한, 본 실험에서 바이오필름 내의 박테리아는 일반적으로 항생제에 대해 더 높은 내성을 보입니다. 파란색으로 표시된 Pseudomonas aerogen 부유 배양액에 대한 tobramycin의 최소 억제 농도는 약 4 µg/mL로 측정되었습니다.이와 대조적으로, 빨간색으로 표시된 바와 같이 바이오필름 내 박테리아의 100%가 512 micrograms per milliliter의 항생제 농도에서도 생존했습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 정의된 인공 객담 배지에서 박테리아를 배양하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 또한, 낭성 섬유증 폐와 더 유사한 환경에서 박테리아 성장을 억제하는 데 필요한 최소 억제 농도를 결정하기 위한 항생제 감수성 테스트를 수행할 수 있어야 합니다.

use-artificial-sputum-medium-to-test-antibiotic-efficacy-against

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

출처: Vieira, J., et al. 낭포성 섬유증 기도 마이크로바이옴에 대한 보충 산소의 효과를 연구하기 위한 모델의 설계 및 개발.  J. Vis. 경험. (2021).이 비디오는 낭포성 섬유증 폐 가래의 점도, 영양 조성 및 pH를 모방한 인공 가래 배지의 준비를 보여줍니다. 생성된 배지는 생체 외 연구를 위한 생리학적으로 관련된 플랫폼을 제공합니다.

낭포성 섬유증 폐 가래를 생체 외에서 모방하기 위한 인공 가래 배지의 준비

Source: Jackson, L., et al. Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the in situ visualization of Pseudomonas aeruginosa within chemically cleared cystic fibrosis sputum using fluorescent labeling and confocal microscopy to reveal bacterial localization and biofilm structure.

Visualization of Pseudomonas aeruginosa in Sputum Samples from Cystic Fibrosis Patients

점액은 낭포 성 섬유증의기도가 (CF) 환자는 미생물 병원균이 번창 할 수있는 이상적인 환경이다 연결. 원고들은 화학 조건의 질병 및 방법 변경의 원인이 모방 미생물 역학을 구동 할 수있는 환경에서 CF 폐 마이크로 바이 옴을 연구하기위한 새로운 방법을 설명합니다.

WinCF 모델 - 폐렴의 미생물학을 연구하기 위해 점액으로 촘촘하게 밀집된 Bronchiole의 저렴하고 견고한 소우주

당사는 CFBE41o-세포, THP-1 대식세포 및 슈도모나스 아에루기노사(공기-액체인터페이스)에 설립된 감염된 기도의 3차원 공동 배양 모델에 대한 프로토콜을 설명합니다.- 이 모델은 항생제 효능, 상피 장벽 기능 및 염증 성 마커를 동시에 테스트하는 새로운 플랫폼을 제공합니다.

P. 아루기노사 감염된 3D 기관상피세포 및 대식세포의 공동 배양

이 프로토콜은 낭포성 섬유증 환자의 객담 내에서 박테리아 세포 및 다당류 합성 위치(Psl) 다당류의 시각화 방법을 제공합니다.

낭포성 섬유증 환자의 객담 내 녹농균의 시각화

이 워크플로우는 낭포성 섬유증을 가진 개별의 폐에 있는 세균성 생물막의 확립된 ex vivo 모형을 사용하여 항생제 감수성 시험을 능력을 발휘하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 모델의 사용은 MBEC의 임상 타당성을 향상시킬 수 (최소한의 생물 막 박멸 농도) 에세이.

낭포성 섬유증 폐에 있는 슈도모나스 아에루기노사 및 황색포도상구균 생물막의 Ex vivo 모형에 있는 항생제 효능 시험

합성 낭포성 섬유증 가래 배지(SCFM2)는 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사 및 형광 활성화 세포 분류와 함께 사용하여 고해상도에서 세균 응고체를 관찰할 수 있다. 이 논문은 향후 연구를 위한 플랫폼으로서 항균 치료 중 집계 인구를 평가하는 방법을 자세히 설명합니다.

슈도모나스 아에루기노사 감염 모델의 실시간 평가를 위한 도구

이 프로토콜의 목표는 낭포성 섬유증 기도 미생물 지역 사회에 hyperoxia의 효력을 위한 모형 시스템을 개발하는 것입니다.  인공 가래 배지는 가래의 조성을 모방하고, 과옥배양 조건은 폐 미생물 공동체에 대한 보충 산소의 효과를 모델링한다.

낭포성 섬유증 기도 미생물군유전체에 대한 보충 산소의 효과를 연구하는 모델의 설계 및 개발

이 프로토콜은 박테리아 종간 상호 작용의 영향을 탐구하는 데 사용할 수 있는 낭포성 섬유증(CF) 폐 관련 4종 다미생물 생물막 모델을 설명합니다.

커뮤니티 표현형을 조사하기 위한 낭포성 섬유증 관련 다미생물 생물막 성장

이 방법론을 통해 연구 및 임상 실험실에서 항균성 감수성 테스트를 위해 낭포성 섬유증에서 다미생물 생물막 모델을 구축할 수 있습니다. 이 모델은 다양한 출력에 걸쳐 정확하고 신뢰할 수 있는 결과를 제공합니다.

낭포성 섬유증에서 항균제를 테스트하기 위한 다미생물 집락 생물막 모델 개발

이 연구는 낭포성 섬유증 폐 환경을 반영하는 녹농균 유전자 발현을 평가하기 위해 응집체 다미생물 생물막 모델을 개발하고 RNA 추출 프로토콜을 최적화하기 위한 프레임워크를 설명합니다. 응용 분야에는 항균 효과 평가 및 낭포성 섬유증과 관련된 조건에서 항생제 대안 연구가 포함됩니다.

감염 관련 유전자 발현을 연구하기 위한 낭포성 섬유증 응집체 생물막 모델

배우세요 인공 가래 매체를 사용하여 낭성 섬유증 폐 환경에서 녹농균 바이오필름의 항생제 내성을 평가하는 방법을. 이 기술은 생리학적 조건에서 항생제 효능을 정량화하여 만성 감염 치료 전략 개선에 기여합니다.

위반 항생제 효능을 테스트하는 인공 가래 매체의 사용

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