Name: Expresión y purificación de la proteína transmembrana de la fibrosis quística regulador de la conductancia en la Saccharomyces cerevisiae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 56 s
Description: Aprende a expresar y purificar la proteína CFTR en Saccharomyces cerevisiae utilizando marcadores GFP para monitorear niveles de expresión. Este método facilita la investigación sobre fibrosis quística y el diseño de fármacos.

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Agradecemos a la Fundación de Fibrosis Quística (CFF) para la financiación de este trabajo a través de su Consorcio CFTR Estructura 3D (el número de concesión FORD08XX0). Reconocemos la enorme contribución de todos nuestros colegas en el Consorcio a este trabajo, en particular en el diseño de los genes CFTR. También reconocemos la valiosa contribución de los Dres. James Birtley (NCSR Demócrito, Grecia), Mark Young (Universidad de Cardiff, Reino Unido) y David Drew (Imperial College de Londres, Reino Unido) en las primeras etapas de la obra. Agradecemos especialmente a la Dra. Ina Urbatsch (Texas Tech. Universidad de Lubbock) para la lectura crítica del manuscrito.

<ol><li>Ford, R. C., Birtley, J., Rosenberg, M. F., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+three-dimensional+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">CFTR three-dimensional structure.</a> Methods Mol. Biol. 741, 329-346 (2011).</li>
<li>Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+crystallization+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22CFTR%29.+J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> CFTR). J. Biol. Chem. 279, 39051-39051 (2004).</li>
<li>Zhang, L., Aleksandrov, L. A., Riordan, J. R., Ford, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domain+location+within+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+protein+investigated+by+electron+microscopy+and+gold+labelling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Domain location within the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein investigated by electron microscopy and gold labelling.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1808, 399-404 (2011).</li>
<li>Kiser, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+degradation+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Expression and degradation of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in Saccharomyces cerevisiae.</a> Arch. Biochem. Biophys. 390, 195-205 (2001).</li>
<li>Huang, P., Stroffekova, K., Cuppoletti, J., Mahanty, S. K., Scarborough, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+expression+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Functional expression of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in yeast.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1281, 80-90 (1996).</li>
<li>Ahner, A., Nakatsukasa, K., Zhang, H., Frizzell, R. A., Brodsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+heat-shock+proteins+select+deltaF508-CFTR+for+endoplasmic+reticulum-associated+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Small heat-shock proteins select deltaF508-CFTR for endoplasmic reticulum-associated degradation.</a> Mol. Biol. Cell. 18, 806-814 (2007).</li>
<li>Fu, L., Sztul, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER-associated+complexes+%28ERACs%29+containing+aggregated+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+%28CFTR%29+are+degraded+by+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">ER-associated complexes (ERACs) containing aggregated cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are degraded by autophagy.</a> Eur. J. Cell. Biol. 88, 215-226 (2009).</li>
<li>Sun, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derlin-1+promotes+the+efficient+degradation+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+%28CFTR%29+and+CFTR+folding+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Derlin-1 promotes the efficient degradation of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and CFTR folding mutants.</a> J. Biol. Chem. 281, 36856-36863 (2006).</li>
<li>Zhang, Y., Michaelis, S., Brodsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+expression+and+ER-associated+degradation+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">CFTR expression and ER-associated degradation in yeast.</a> Methods Mol. Med. 70, 257-2565 (2002).</li>
<li>Drew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP-based+optimization+scheme+for+the+overexpression+and+purification+of+eukaryotic+membrane+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nat. Protoc. 3, 784-798 (2008).</li>
<li>Knight, A. W., Billinton, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+the+wood+through+the+trees%3A+A+review+of+techniques+for+distinguishing+green+fluorescent+protein+from+endogenous+autofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Seeing the wood through the trees: A review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence.</a> Anal. Biochem. 291, 175-197 (2001).</li>
<li>Robinson, K. M., Lemire, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+nucleotide+sequence+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+gene+for+the+succinate+dehydrogenase+flavoprotein+subunit%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Isolation and nucleotide sequence of the Saccharomyces cerevisiae gene for the succinate dehydrogenase flavoprotein subunit.</a> J. Biol. Chem. 267, 10101-10107 (1992).</li>
<li>Gnann, A., Riordan, J. R., Wolf, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+degradation+depends+on%5BTitle%5D)+AND+%22the+lectins+Htm1p%2FEDEM+and+the+Cdc48+protein+complex+in%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator degradation depends on.</a> the lectins Htm1p/EDEM and the Cdc48 protein complex in. 15, 4125-4135 (2004).</li>
<li>Yoo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-conventional+trafficking+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+through+the+early+secretory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Non-conventional trafficking of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator through the early secretory pathway.</a> J. Biol. Chem. 277, 11401-11409 (2002).</li>
<li>Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+protein+and+structural+changes+associated+with+phosphorylation+and+nucleotide+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Architecture of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein and structural changes associated with phosphorylation and nucleotide binding.</a> Journal of Structural Biology. 167, 242-251 (2009).</li>
<li>Wellhauser, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-molecule+modulator+interacts+directly+with+deltaPhe508-CFTR+to+modify+its+ATPase+activity+and+conformational+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">A small-molecule modulator interacts directly with deltaPhe508-CFTR to modify its ATPase activity and conformational stability.</a> Mol. Pharmacol. 75, 1430-148 (2009).</li>
<li>Ramjeesingh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+monomer+is+the+minimum+functional+unit+required+for+channel+and+ATPase+activity+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A monomer is the minimum functional unit required for channel and ATPase activity of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Biochemistry. 40, 10700-10706 (2001).</li>
<li>Huang, P., Liu, Q., Scarborough, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysophosphatidylglycerol%3A+a+novel+effective+detergent+for+solubilizing+and+purifying+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Lysophosphatidylglycerol: a novel effective detergent for solubilizing and purifying the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Anal. Biochem. 259, 89-97 (1998).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Este documento proporciona un método para la expresión de proteína CFTR murino en células de levadura, que debería facilitar la investigación sobre la fibrosis quística. El objetivo es vincular este trabajo con el lanzamiento de la construcción de ratón CFTR ADN, que estará disponible a través de la Fundación de Fibrosis Quística ( <a href="http://www.cff.org/research/CFFT/">http://www.cff.org/research/CFFT/</a> ). Otros orthologs debería estar disponible más tarde. La transformación de las células de levadura con el vector que contiene CFTR es sencillo, pero es importante para la detección de colonias que expresan altos niveles de CFTR. Niveles variables de expresión pueden derivarse de varios factores, pero el número de copias del plásmido por célula probablemente representa un importante grado de variación. Los pasos críticos que se describen aquí debe permitir la producción de CFTR que expresan las células de levadura y que contienen membranas microsomales CFTR. Una vez que la transformación, crecimiento, cosecha y la lisis de las células de levadura han sido dominadas, Purificación de la proteína debe ser posible, y en la Figura 3 se ha dado un ejemplo de la pureza que debe ser alcanzable en este caso como una referencia útil. No es nuestra intención en este manuscrito para proporcionar una metodología detallada para la purificación de la proteína. Sin embargo, hay algunos pasos críticos intermedios de purificación que son específicos para el sistema de expresión S.cerevisae, tales como la lisis celular y purificación microsoma, y éstos se han incluido en detalle en este manuscrito. Cabe mencionar, sin embargo, que, aparte de los dos métodos que hemos utilizado, alternativas de levadura métodos ruptura celular pueden ser empleados, tales como el uso de una célula de presión Francesa. La proteína recombinante tiene una TEV-escindible dominio C-terminal GFP que permite que la proteína a ser rastreados después de la inducción (fig. 4). La levadura tiene una proteína intrínseca 70kDa (probablemente succinato deshidrogenasa 12) que presenta fluorescencia bajo las mismas condiciones 11, y esto puede proporcionar una herramienta útil entreestándar de calibración nal para los niveles de expresión relativos de CFTR en extractos de células enteras o microsomas (fig. 3). Es evidente a partir de los datos mostrados en la Figura 4 que el momento de la recolección de células después de la inducción con galactosa es crucial. Los rendimientos de caída de CFTR precipitadamente después de aproximadamente 16 horas de inducción, de modo que apenas hay CFTR detectable en células de levadura después de 24 horas de inducción. El rendimiento de proteína purificada es de aproximadamente 1-2mg proteína CFTR por 15 litros cultura fermentador. La recuperación puede ser estimado como aproximadamente 70% del total de CFTR-proteína GFP hasta la fase de microsoma, y ​​alrededor del 25% de recuperación de la proteína purificada. Caracterización de la S. cerevisiae, expresó CFTR está en curso. Como se ve en la fig. 4, la localización de la proteína en la célula puede ser controlado por microscopía de fluorescencia. Aunque gran parte de la fluorescencia se encuentra alrededor de la periferia de la célula como se esperaba 10, parte de la proteína muestra una localización puntiforme, ya sea en ojusto dentro de la membrana plasmática, que podría ser debido a CFTR de reciclaje a través de una tarde de Golgi / endosomal vía 14 o tal vez un compartimiento posterior de la brotación de las vesículas de transporte de la sala de emergencia 4. El tratamiento con PNGasaF, una enzima que deglycosylates proteínas, mostró un cambio mínimo en la migración de la banda de proteína CFTR en SDS-PAGE, lo que implica que se no glicosilada, o tiene glicosilación mínima 15. Los experimentos en el estado de fosforilación de la proteína están en marcha. En algunos de los detergentes ensayadas hasta ahora, la proteína purificada muestra la actividad de ATPasa (que es inhibida por un inhibidor específico CFTR 16) a tasas que son similares a los publicados anteriormente 2,15. Medición de la actividad del canal CFTR requerirá la reconstitución de la proteína purificada, lo que implica una etapa de purificación final en un detergente que tiene una concentración crítica de micelas relativamente alta (CMC) 17. Levadura microsomas containing CFTR puede solublised con varios detergentes comúnmente empleados 18, incluyendo detergentes como dodecilsulfato maltósido 2, que son generalmente considerados como &quot;suave&quot;. Sin embargo la mayoría de los detergentes cmc alta han demostrado ser ineficientes para solubilsation, hasta ahora, lo que sugiere que el intercambio en estos detergentes deben ser considerados en una etapa tardía en cualquier esquema de purificación.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo / equipo </td><td> Empresa </td><td> N ° de catálogo </td></tr><tr><td> FGY217 S.cerevisiae cepa, con pep4 supresión 10 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> La levadura base de nitrógeno sin aminoácidos </td><td> Formedium </td><td> CYN0410 </td></tr><tr><td> Completa mezcla de suplemento sin uracilo </td><td> Formedium </td><td> DCS0169 </td></tr><tr><td> Agar bacteriológico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A5306 </td></tr><tr><td> D-galactosa </td><td> Pescador </td><td> BP656-500 </td></tr><tr><td> D-glucosa </td><td> Pescador </td><td> D16-500 </td></tr><tr><td> Un Pepstatina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4265 </td></tr><tr><td> Leupeptina </td><td> Merck </td><td> 108975 </td></tr><tr><td> Quimostatina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7268 </td></tr><tr><td> Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7626 </td></tr><tr><td> Epoxysuccinyl-leucylamido-butano (E-64) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E3132 </td></tr><tr><td> Aminoethylbenzenesulfonyl fluoruro (AEBSF) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A8456 </td></tr><tr><td> Benzamidina clorhidrato de </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 434760 </td></tr><tr><td> Dimetilsulfóxido (DMSO) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8418 </td></tr><tr><td> ditiotreitol (DTT) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 43815 </td></tr><tr><td> ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) </td><td> Pescador </td><td> BP120500 </td></tr><tr><td> Tris-base </td><td> Formedium </td><td> TRIS01 </td></tr><tr><td> Tris-HCl </td><td> Pescador </td><td> P631 </td></tr&gt; <tr><td> D-sorbitol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S1876 </td></tr><tr><td> Glicerol </td><td> Pescador </td><td> 065017 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S6191 </td></tr><tr><td> n-dodecil-β-D maltopiranósido </td><td> Affymetrix </td><td> D310S </td></tr><tr><td> Azul de bromofenol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 114391 </td></tr><tr><td> PageRuler Plus estándares preteñidos proteínas </td><td> Fermentas </td><td> SM1811 </td></tr><tr><td> NuSep tris-Gly 4-20% geles de gradiente </td><td> NuSep </td><td> NB10-420 </td></tr><tr><td> Instantánea azul de Coomassie </td><td> Novexin </td><td> ISB1L </td></tr><tr><td> Cuentas de vidrio, lavados con ácido </td><td> Sigma </td><td> G8772 </td></tr><tr><td> 50 ml estériles Tubos Falcon </td><td> Sarstedt </td><td> 62.547.254 </td></tr><tr><td> 2 mlEstériles con tapa de rosca viales </td><td> Sarstedt </td><td> 72.694.005 </td></tr><tr><td> 250 ml estéril Erlenmeyers desconcertado </td><td> BD Biosciences </td><td> 355119 </td></tr><tr><td> Erlenmeyer estéril 2l desconcertado frascos </td><td> BD Biosciences </td><td> 355131 </td></tr><tr><td> Tubos de 2 ml de microfuga </td><td> Sarstedt </td><td> 72.695 </td></tr><tr><td> 0.2μM filtro de jeringa </td><td> Sartorio </td><td> FC121 </td></tr><tr><td> tubos de ultracentrífuga </td><td> Beckman Coulter </td><td> 355618 </td></tr><tr><td> tubos de centrífuga </td><td> Beckman Coulter </td><td> 357000 </td></tr><tr><td> Potes de 1 litro de centrifugadoras </td><td> Beckman Coulter </td><td> 969329 </td></tr><tr><td> Incubadora de agitación orbital con control de temperatura </td><td> New Brunswick Scientific </td><td></td></tr><tr><td> Deltavision RT microscopio de la restauración </td><td> Visión Aplicada </td><td></td></tr><tr><td> Centrífuga de mesa </td><td> HERMLE </td><td> Z300 </td></tr><tr><td> Microcentrífuga de mesa </td><td> Pescador </td><td> 13-100-511 </td></tr><tr><td> Vortex mezclador de </td><td> Star Labs </td><td></td></tr><tr><td> El tifón escáner Trio </td><td> GE Healthcare </td><td> 63-0055-87 </td></tr><tr><td> LAS3000 sistema de imagen </td><td> Fuji </td><td></td></tr><tr><td> Recipiente fermentador 20l y unidad de control </td><td> Applikon </td><td></td></tr><tr><td> Constante de los sistemas de disruptor celular </td><td> Sistemas de constantes </td><td></td></tr><tr><td> Beadbeater disruptor celular </td><td> BioSpec </td><td> 1107900 </td></tr><tr><td> Mini-beadbeater-16 </td><td> BioSpec </td><td> 607 </td></tr><tr><td> JA-17 rotor </td><td> Beckman Coulter </td><td> 369691 </td></tr><tr><td> Optima L-100 Ultracentrífuga </td><td> Beckman Coulter </td><td> 392050 </td></tr><tr><td> Rotor de 50.2Ti </td><td> Beckman Coulter </td><td> <a href="https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=337901" target="_blank">337901</a> </td></tr></tbody></table>

expresión y purificación de la proteína transmembrana de la fibrosis quística regulador de la conductancia en la saccharomyces cerevisiae

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

La fibrosis quística transmembrana regulador de la conductancia (CFTR) es un canal de cloruro, que cuando está mutado, puede dar lugar a la fibrosis quística en humans.There es por lo tanto, un considerable interés en esta proteína, pero los esfuerzos para estudiar su estructura y actividad se han visto obstaculizados por la dificultad de expresión y purificación de cantidades suficientes de la proteína 1-3. Al igual que muchos de los difíciles de proteínas de membrana eucariotas, la expresión en un organismo de crecimiento rápido es deseable, pero difícil, y en la levadura S. cerevisiae, hasta ahora cantidades bajas se obtuvieron y una rápida degradación de la proteína recombinante se observó 4-9. Las proteínas involucradas en el procesamiento de CFTR en la levadura recombinante se han descrito 6.9. En este informe se describe una metodología para la expresión de CFTR en la levadura y su purificación en cantidades significativas. El protocolo describe cómo los problemas de la proteólisis anteriores se pueden superar y cómo los niveles de expresión deCFTR puede ser mejorado mediante la modificación de las condiciones de crecimiento de células y mediante el control de las condiciones de inducción, en particular, el período de tiempo antes de la recolección de células. Los reagants asociados con este protocolo (CFTR murino que expresan las células de levadura o plásmidos de levadura) se distribuyen a través de los EE.UU. Fundación de Fibrosis Quística, que ha patrocinado la investigación. Un artículo que describe el diseño y síntesis de la CFTR constructo empleado en el presente informe se publicará por separado (Urbatsch, I.;. Thibodeau, P. et al, inédito). En este artículo vamos a explicar nuestro método de inicio de la transformación de las células de levadura con la construcción de CFTR - la levadura que contiene el plásmido (Fig. 1). La construcción cuenta con una proteína verde fluorescente (GFP) fusionada a la secuencia CFTR en su extremo C-terminal y sigue el sistema desarrollado por Drew et al. (2008) 10. El GFP permite la expresión y purificación de CFTR que debe seguirse con relativa facilidad. El protoc Jove visualizaracabados ol después de la preparación de microsomas de las células de levadura, aunque incluyen algunas sugerencias para la purificación de la proteína a partir de los microsomas. Los lectores pueden añadir sus propias modificaciones en el procedimiento de purificación de microsomas, depende de los experimentos finales que se llevarán a cabo con la proteína y el equipo local a su disposición. La levadura expresa la proteína CFTR puede ser parcialmente purificada usando iones metálicos cromatografía de afinidad, usando una etiqueta polihistidina depuración intrínseca. Después de exclusión por tamaño cromatografía produce una proteína que parece ser&gt; 90% de pureza, según se juzga por SDS-PAGE y tinción con Coomassie del gel.

Los intentos para expresar la transmembrana de la fibrosis quística regulador de la conductancia (CFTR) en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;, Hasta ahora, dado cantidades relativamente bajas de proteína. Este protocolo y los reactivos asociados distribuidos a través de la Fundación de Fibrosis Quística debe permitir la preparación de cantidades de miligramos de esta &quot;difícil&quot; proteína de la membrana eucariota.

Expresión y purificación de la proteína transmembrana de la fibrosis quística regulador de la conductancia en la Saccharomyces cerevisiae

El regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) es un canal de cloruro que, al presentar mutaciones, puede dar lugar a la fibrosis quística en...

El objetivo general de este procedimiento es expresar cantidades en miligramos de la proteína CFTR en Charmy Visier. Esto se logra primero seleccionando colonias TRANSFORMANTES para ensayos de crecimiento y expresión en cultivos celulares de 50 mililitros. A continuación, se identifican las colonias que contienen células lisadas y que expresan CFTR.Luego, las colonias con mayor expresión de CFTR se cultivan en un biorreactor de 15 litros. Finalmente, se cosechan las células y se preparan microsomas que contienen CFTR. En última instancia, los resultados muestran la expresión y extracción de CFTR fusionado con GFP mediante fluorescencia en gel e imagen de fluorescencia.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes para la expresión de CFTR es que utiliza un huésped eucariota sencillo, económico, rápido y fácil de cultivar. Posee una etiqueta de proteína verde fluorescente que permite un monitoreo rápido de los niveles de expresión. Y finalmente, los pasos de biología molecular se minimizan en este procedimiento. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la fibrosis quística, como las propiedades biofísicas de la proteína CFTR. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia para la fibrosis quística porque podrían permitir nuevas pruebas de fármacos basadas en la proteína purificada. Podrían surgir nuevas categorías de medicamentos a partir de fármacos que interactúan directamente con la proteína.El defecto primario en la fibrosis quística debería ser más específico y potencialmente tener menos efectos pleiotrópicos. Además, la purificación de grandes cantidades de la proteína es importante para obtener una estructura de alta resolución de la CFTR. El diseño de fármacos basado en la estructura de la proteína debería mejorar los fármacos existentes y potencialmente conducir al descubrimiento de nuevos fármacos.La publicación de este artículo y el video adjunto está vinculada a la liberación de ADN o células transformadas a través de la Fundación para la Fibrosis Quística. Si desea obtener estos materiales, comuníquese con Elizabeth Joof en la Fundación para la Fibrosis Quística. Deberá completar un acuerdo de transferencia de materiales.Este método puede proporcionar información sobre el uso de una etiqueta GFP para la expresión de proteínas de membrana, tal como fue introducido por David Drew y sus colaboradores en el Imperial College London. Las personas nuevas en este método pueden tener dificultades con la transformación. Los rendimientos pueden ser bajos y el momento de recolección de las células es crítico para obtener buenos niveles de expresión.Tuvimos por primera vez la idea de este método durante una visita de David Drew y sus colegas a nuestro laboratorio. Ellos estaban realizando estudios estructurales sobre proteínas de membrana que habían expresado y purificado de levadura utilizando este sistema. La demostración visual de este método es fundamental, ya que la transformación celular, el crecimiento celular tras la inducción y el aislamiento de microsomas son pasos difíciles, y una publicación está vinculada a la liberación de un reactivo.El video también ayudará a estandarizar el protocolo para que diferentes laboratorios puedan comparar sus resultados. Esta demostración será realizada por Tracy Remington y Natasha Kant, quienes son estudiantes de posgrado en nuestro laboratorio. Liam o Ryan, el otro coautor del artículo, se encuentra actualmente en Nueva Zelanda y no pudo participar en la demostración. Después de transformar la cepa s visi FGY 2 1 7 con un plásmido de levadura que codifica el gen C-F-T-R-G-F-P ocho hiss, seleccione de cinco a diez colonias bien separadas de una placa de transformación.Transferir cada colonia a un tubo estéril de Falcon de 50 mililitros separado que contenga nueve mililitros de medio base de nitrógeno para levaduras o medio YNB y un mililitro de glucosa. Medio. Incubar los cultivos durante la noche durante 16 horas a 250 RPM y 30 grados Celsius en un incubador con agitación orbital para preparar stocks de glicerol para cada una de las colonias seleccionadas. Añadir asépticamente 0,8 mililitros de los cultivos nocturnos a 0,2 mililitros de glicerol estéril en viales con tapa roscada etiquetados.Vortex brevemente y almacene a menos 80 grados Celsius. Diluya los cultivos restantes a un volumen final de 50 mililitros en YMB con 250 microlitros de medio de glucosa. Incube los cultivos en matraces Erlenmeyer de 250 mililitros con placas deflectoras, rotulados, hasta un OD 600 de 0,7 a 0,8 a 250 RPM y 30 grados Celsius en un incubador con agitación orbital. Induzca los cultivos añadiendo cinco mililitros de medio de galactosa a cada matraz. Reduzca la temperatura del incubador a 25 grados Celsius y continúe el crecimiento durante la noche durante 16 horas.Transfiera los cultivos a tubos Falcon de 50 mililitros. Recoga las células mediante centrifugación a 3.500 ×g a cuatro grados Celsius durante 10 minutos en una centrífuga de mesa mientras la centrífuga está en funcionamiento. Prepare tubos microfuga de 2 mililitros con tapa roscada que contengan aproximadamente 300 microlitros de perlas de vidrio lavadas con ácido y colóquelos en hielo.Deseche los sobrenadantes y reuspenda cada botón en 800 microlitros de tampón de resuspensión de células frío con inhibidores de proteasas o CRB. Transfiera las suspensiones a los tubos microrefus y manténgalos en hielo. Retrasar la carga de las células en un mini agitador de perlas y funcionar durante tres minutos.Coloque los tubos en una microcentrífuga de banco y centrifugue a 3.500 × g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Transfiera los sobrenadantes que contienen las membranas a tubos limpios para microcentrífuga y colóquelos en hielo. Recopile las membranas crudas centrifugando a velocidad máxima durante dos horas a cuatro grados Celsius en una microcentrífuga de banco.Deseche el sobrenadante y resuspenda cada pellet en 50 microlitros de hielo. Llame al tampón CFTR en tubos microscópicos limpios. Mezcle 15 microlitros de cada suspensión con 15 microlitros de colorante de carga dos veces mediante pipeteo.No hierva las muestras, ya que esto provocará que la CFTR y otras proteínas de membrana formen agregados insolubles en SDS y también desnaturalice la etiqueta GFP. Cargue las muestras, así como un marcador proteico preteñido, en un gel gradiente de glicina de cuatro al 20 % y corra a 150 voltios durante 40 minutos. Después de realizar la fluorescencia en gel para identificar las células con mayor expresión y verificar la expresión mediante tinción de Kumasi, siembre por estría la línea celular con mayor expresión a partir de su stock de glicerol en una placa YNBA fresca e incube a 30 grados Celsius durante dos o tres días.Almacene la placa hasta dos semanas a cuatro grados Celsius para preparar pre-cultivos para el fermentador. Utilice un asa estéril para raspar un área cuadrada de un centímetro de células de la placa A-Y-N-B-A y añádala a 45 mililitros de medio YMB y cinco mililitros de medio de glucosa para obtener una DO 600 de aproximadamente 0,1. Incube los cultivos a 250 RPM y 30 grados Celsius en un incubador con agitación orbital hasta que la DO 600 alcance uno.Divida el cultivo entre dos matraces Erlenmeyer de dos litros con placas deflectoras, cada uno conteniendo 450 mililitros de medio YMB y 25 mililitros de glucosa. Incube el medio durante la noche a 250 RPM a 30 grados Celsius en un incubador con agitación orbital hasta que la DO 600 alcance 1,2. Para preparar el biorreactor, prepare 11,2 litros de YNB y agregue 8,28 gramos adicionales de YNB y 0,95 gramos de suplemento de eliminación para compensar la adición de glicerol durante la inducción.A continuación, agregue asépticamente los 11,2 litros de YNB y 75 mililitros de medio de glucosa a un biorreactor estéril de 20 litros y ajuste la temperatura de operación a 30 grados Celsius. Luego, agregue asépticamente los pre-cultivos al biorreactor. Establezca la velocidad de agitación en aproximadamente 800 RPM y ajuste el flujo de aire comprimido a aproximadamente 15 decímetros cúbicos por minuto.Cuando el cultivo alcance una DO a 600 de 1.2, induzca agregando asépticamente 1,5 litros de medio de galactosa y 1,2 litros de glicerol. Reduzca la temperatura a 25 grados Celsius y permita que el cultivo crezca durante 16 horas utilizando una bomba peristáltica. Transfiera el cultivo a tubos de centrifuga de un litro enfriados sobre hielo.Recoger las células por centrifugación durante 30 minutos a 3.500 ×g a cuatro grados Celsius. Suspender nuevamente las células en 150 mililitros de tampón de suspensión frío con hielo micro zona MRB o MRB con inhibidores de proteasas y un milimolar de DTT. A partir de este momento, realizar todo el procedimiento a cuatro grados Celsius. Utilizar un disruptor celular para lisar las células.Luego, transfiera los lisados a tubos tipo falcón de 50 mililitros y sedimente los restos celulares mediante centrifugación a 3.500 × g y cuatro grados Celsius durante 15 minutos. Para eliminar las mitocondrias, transfiera el sobrenadante a tubos de centrifugación enfriados y centrifugue a 14.000 × g a cuatro grados Celsius durante 30 minutos. A continuación, para recolectar los microsomas, transfiera el SUP natin a tubos de ultracentrifugación previamente enfriados y centrifugue a 200.000 × g a cuatro grados Celsius durante 90 minutos.Vierta con cuidado y deseche el sobrenadante, y agregue dos mililitros de tampón CFTR frío con inhibidores de proteasas y DTT de un milimolar a cada tubo. Utilizando un pincel, re suspenda suavemente los precipitados. Luego complete cada tubo con tampón CFTL y mezcle mediante vórtex. Centrifugue la suspensión a 100.000 ×g a cuatro grados Celsius durante 60 minutos.Deseche el agente supino y utilice un pincel para repetir el proceso de suspensión de Resus en dos mililitros de tampón CFTR frío con inhibidores de proteasas y un milimolar de DTT. Recupere las microsomas resuspendidas, luego ajuste el volumen final a 50 mililitros con tampón CFTR y mezcle bien. Reserve una alícuota de un mililitro para SDS-PAGE y almacene las microsomas a menos 80 grados Celsius hasta que sean necesarias para extraer CFTR de las microsomas.Consulte el protocolo escrito. La transformación de levaduras con el plásmido que contiene CFTR no es 100 % eficiente. Una pantalla representativa a pequeña escala de la expresión de CFTR en colonias seleccionadas a partir de un experimento de transformación producirá aproximadamente una de cada cuatro colonias que expresan la proteína mostrada.Aquí se muestran los resultados de un análisis de cinco colonias seleccionadas de una placa. Una colonia muestra un alto nivel de expresión de la proteína de fusión C-F-T-R-G-F-P. Los niveles de fluorescencia de C-F-T-R-G-F-P variarán considerablemente entre experimentos, siendo la colonia cuatro la que muestra al menos 10 veces más fluorescencia que la banda fluorescente intrínseca a aproximadamente 70 kilodalton.Incluso con un alto nivel de expresión de C-F-T-R-G-F-P como se muestra a la izquierda, es poco probable que la banda de C-F-T-R-G-F-P sea discernible en el extracto celular mediante tinción con kumasi, tal como se observa a la derecha. Esta figura muestra la presencia de C-F-T-R-G-F-P dentro de los microsomas. Los resultados de este experimento son importantes no solo para evaluar la eficiencia de la inducción de la expresión, sino también para verificar que los microsomas se hayan preparado cuidadosamente y que la proteólisis se haya minimizado.Como se muestra aquí. El crecimiento de las células más allá de las 16 horas provocará una disminución de la expresión de CFTR. Esto probablemente se deba al recambio de la proteína, tal vez por la sobreexpresión del sistema de control de calidad de proteínas de la levadura.Por lo tanto, es recomendable monitorear los niveles de expresión de CFTR después de la inducción, utilizando fluorescencia en gel e imágenes fluorescentes. Al intentar este procedimiento, es importante monitorear el crecimiento celular mediante mediciones de OD 600. Pruebe todo primero a pequeña escala antes de ampliarlo y verifique la expresión proteica en función del tiempo. Tras la inducción, el momento óptimo para recolectar las células puede variar de un laboratorio a otro.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo expresar cantidades en miligramos de la proteína CFTR en la levadura Scro Visier. Tras seguir este procedimiento, la proteína CFTR puede purificarse a partir de los microsomas de levadura para su posterior caracterización bioquímica y biofísica. Tras su desarrollo por David Drew y sus colaboradores, esta técnica allanó el camino para una mejor expresión de proteínas de membrana eucariotas.Esperamos que este trabajo tenga un impacto en la investigación de la fibrosis quística al permitir que laboratorios de todo el mundo produzcan CFTR utilizando un sistema de expresión económico y sencillo. Este trabajo no habría sido posible sin el apoyo de la Fundación de Fibrosis Quística y, por supuesto, sin nuestros colegas del Consorcio de Estructura Tridimensional de CFTR. No olvide que trabajar con cualquier organismo recombinante está estrictamente regulado, y que los procedimientos de manejo y eliminación deben ser aprobados por la autoridad reguladora correspondiente antes de comenzar cualquier trabajo.

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Investigación

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Biología

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Expresión y purificación de la proteína transmembrana de la fibrosis quística regulador de la conductancia en la Saccharomyces cerevisiae (Video) | JoVE Journal

Expresión y purificación de la proteína transmembrana de la fibrosis quística regulador de la conductancia en la Saccharomyces cerevisiae

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