Name: Caracterización fenotípica y funcional de las células endoteliales Formadoras de Colonias derivados de la sangre del cordón umbilical (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 46 s
Description: Aprende a derivar células endoteliales formadoras de colonias (ECFC) de sangre de cordón umbilical humano. Este método permite caracterizar su potencial proliferativo clonal y capacidad de formación vascular in vivo.

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Dr. Yoder es consultor de Tecnologías de la EndGenitor, Inc. y miembro de la junta directiva de las Tecnologías de Rimedion, Inc.

<ol><li>Carmeliet, P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+and+clinical+applications+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis.</a> Nature. 473, 298-307 (2011).</li>
<li>Asahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+putative+progenitor+endothelial+cells+for+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis.</a> Science. 275, 964-967 (1997).</li>
<li>Urbich, C., Dimmeler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+progenitor+cells%3A+characterization+and+role+in+vascular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Endothelial progenitor cells: characterization and role in vascular biology.</a> Circ. Res. 95, 343-353 (2004).</li>
<li>Critser, P. J., Voytik-Harbin, S. L., Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+and+defining+cells+to+engineer+human+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Prolif%22%5BJournal%5D)">Isolating and defining cells to engineer human blood vessels.</a> Cell. Prolif. 44, 15-21 (2011).</li>
<li>Matthias, M., David, N., Josef, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+bench+to+bedside%3A+what+physicians+need+to+know+about+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">From bench to bedside: what physicians need to know about endothelial progenitor cells.</a> Am. J. Med. 124, 489-4897 (2011).</li>
<li>Ingram, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vessel+wall-derived+endothelial+cells+rapidly+proliferate+because+they+contain+a+complete+hierarchy+of+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Vessel wall-derived endothelial cells rapidly proliferate because they contain a complete hierarchy of endothelial progenitor cells.</a> Blood. 105, 2783-276 (2005).</li>
<li>Ingram, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+hierarchy+of+endothelial+progenitor+cells+using+human+peripheral+and+umbilical+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood.</a> Blood. 104, 2752-2760 (2004).</li>
<li>Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+endothelial+progenitor+cells+via+clonal+analysis+and+hematopoietic+stem%2Fprogenitor+cell+principals%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals.</a> Blood. 109, 1801-1809 (2007).</li>
<li>Reinisch, A., Strunk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Animal+Serum+Free+Expansion+of+Human+Umbilical+Cord+Derived+Mesenchymal+Stromal+Cells+%28MSCs%29+and+Endothelial+Colony+Forming+Progenitor+Cells+%28ECFCs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs.</a> J. Vis. Exp. (32), e1525(2009).</li>
<li>Au, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+in+vivo+potential+of+endothelial+progenitor+cells+from+human+umbilical+cord+blood+and+adult+peripheral+blood+to+form+functional+long-lasting+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Differential in vivo potential of endothelial progenitor cells from human umbilical cord blood and adult peripheral blood to form functional long-lasting vessels.</a> Blood. 111, 1302-135 (2008).</li>
<li>Critser, P. J., Kreger, S. T., Voytik-Harbin, S. L., Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+matrix+physical+properties+modulate+endothelial+colony+forming+cell-derived+vessels+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Collagen matrix physical properties modulate endothelial colony forming cell-derived vessels in vivo.</a> Microvasc. Res. 80, 23-30 (2010).</li>
<li>Melero-Martin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+robust+and+functional+vascular+networks+in+vivo+with+human+adult+and+cord+blood-derived+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Engineering robust and functional vascular networks in vivo with human adult and cord blood-derived progenitor cells.</a> Circ. Res. 103, 194-202 (2008).</li>
<li>Melero-Martin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+vasculogenic+potential+of+human+blood-derived+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells.</a> Blood. 109, 4761-4768 (2007).</li>
<li>Hofmann, N. A., Reinisch, A., Strunk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Large+Scale+Expansion+of+Adult+Human+Endothelial+Colony+Forming+Progenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells.</a> J. Vis. Exp. (32), e1524(2009).</li>
<li>Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+of+circulating+endothelial+cells+and+endothelial+outgrowth+from+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood.</a> J. Clin. Invest. 105, 71-77 (2000).</li>
<li>Witting, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Large+Volume+Lentiviral+Vector+Production+Using+Flow+Electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene.+Ther%22%5BJournal%5D)">Efficient Large Volume Lentiviral Vector Production Using Flow Electroporation.</a> Hum. Gene. Ther. , (2011).</li>
<li>Yoon, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+neovascularization+by+mixed+transplantation+of+early+endothelial+progenitor+cells+and+late+outgrowth+endothelial+cells%3A+the+role+of+angiogenic+cytokines+and+matrix+metalloproteinases%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Synergistic neovascularization by mixed transplantation of early endothelial progenitor cells and late outgrowth endothelial cells: the role of angiogenic cytokines and matrix metalloproteinases.</a> Circulation. , 112-1618 (2005).</li>
<li>Dubois, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+progenitor+cell+populations+on+left+ventricular+remodeling+and+myocardial+neovascularization+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Coll.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Differential effects of progenitor cell populations on left ventricular remodeling and myocardial neovascularization after myocardial infarction.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 55, 2232-2243 (2010).</li>
<li>Medina, R. J., O'Neill, C. L., Humphreys, M. W., Gardiner, T. A., Stitt, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outgrowth+endothelial+cells%3A+characterization+and+their+potential+for+reversing+ischemic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Outgrowth endothelial cells: characterization and their potential for reversing ischemic retinopathy.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 5906-5913 (2010).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Caracterización fenotípica y funcional de las supuestas células progenitoras endoteliales es importante identificar los ECFCs de buena fe que son capaces de clonación y la serie de re-siembra en la cultura y dar lugar a los vasos sanguíneos duraderos y funcionales implantables in vivo. La sangre de cordón umbilical humano se enriquece con ECFCs y la concentración de estos descensos que circulan células con el envejecimiento o la enfermedad 10. Estudios recientes sugieren que ECFC pueden dese...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Heparina sódica inyectable, USP </td><td> APP Pharmaceuticals </td><td> 504031 </td></tr><tr><td> Ficoll-Pague </td><td> Amersham Biosciences </td><td> 17-1440-03 </td></tr><tr><td> Mezcla cánula </td><td> Maersk Medical </td><td> 500.11.012 </td></tr><tr><td> EGM-2 </td><td> Lonza </td><td> CC-3162 </td></tr><tr><td> SFB se define </td><td> Hyclone </td><td> SH30070.03 </td></tr><tr><td> TrypLE expresa </td><td> Gibco </td><td> 12605 </td></tr><tr><td> Rata de colágeno tipo I </td><td> BD Biosciences </td><td> 354236 </td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD Biosciences </td><td> 356234 </td></tr><tr><td> Bloquear FcR </td><td> Miltenyi Biotech </td><td> 130-059-901 </td></tr><tr><td> hCD31, FITC conjugaciónTed </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555445 </td></tr><tr><td> hCD45, conjugado con FITC </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555482 </td></tr><tr><td> hCD14, conjugado con FITC </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555397 </td></tr><tr><td> hCD144, conjugado PE </td><td> eBioscience </td><td> 12-1449-80 </td></tr><tr><td> hCD146, conjugado PE </td><td> BD Pharmingen </td><td> 550315 </td></tr><tr><td> hCD105, conjugado PE </td><td> Invitrogen </td><td> MHCD10504 </td></tr><tr><td> Sra. IgG1, k del anticuerpo, conjugado con FITC </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555748 </td></tr><tr><td> D. IgG 1, anticuerpo k, conjugado PE </td><td> BD Pharmingen </td><td> 559320 </td></tr><tr><td> Sra. IgG2a, anticuerpo k, conjugado con FITC </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555573 </td></tr><tr><td> Anti-CD31 humano </td><td> Dako </td><td> clon de JC70 / A </td></tr><tr><td> Anti-mousCD31 e </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553370 </td></tr><tr><td> 0,22-micras vacío sistema de filtración </td><td> Millipore </td><td> SCGPU05RE </td></tr><tr><td> Ácido acético glacial, 17.4N </td><td> Pescador </td><td> A38-500 </td></tr><tr><td> Antibiótico-antimicótico </td><td> Invitrogen </td><td> 15240-062 </td></tr><tr><td> Suero fetal bovino (SFB) </td><td> Hyclone </td><td> SH30070.03 </td></tr><tr><td> IHC zinc Fijador </td><td> BD Biosciences </td><td> 550523 </td></tr><tr><td> Sytox verde reactivo </td><td> Invitrogen </td><td> S33025 </td></tr><tr><td> Cilindros de clonación y estériles </td><td> Fisher Scientific </td><td> 07-907-10 </td></tr></tbody></table>

caracterización fenotípica y funcional de las células endoteliales formadoras de colonias derivados de la sangre del cordón umbilical

Phenotypic and Functional Characterization of Endothelial Colony Forming Cells Derived from Human Umbilical Cord Blood

Puntos de vista de muchos años de la formación de nuevos vasos sanguíneos a través de la angiogénesis, vasculogénesis, y arteriogénesis se han revisado recientemente 1. La presencia de células progenitoras endoteliales circulantes (EPC) se identificaron por primera vez en adultos sangre periférica humana por Asahara et al. En 1997 2, trayendo una infusión de nuevas hipótesis y estrategias para la regeneración vascular y reparación. EPC son componentes poco comunes, pero normal de la sangre circulante de que el hogar de los sitios de formación de vasos sanguíneos o el remodelado vascular, y facilitar tanto la vasculogénesis postnatal, la angiogénesis, o en gran medida a través de arteriogénesis estimulación paracrina de la pared de los vasos existentes derivan las células 3. No hay un marcador específico para identificar un EPC ha sido identificado, y en la actualidad el estado del campo es comprender que numerosos tipos de células madre, incluyendo proangiogénico hematopoyéticas y las células progenitoras, las células circulantes angiogénicos, Tie2 + monocitos, cel progenitor mieloideLS, tumorales macrófagos asociados, y M2 macrófagos activados participar en la estimulación del proceso angiogénico en una variedad de sistemas de modelos animales preclínicos y en los sujetos humanos en numerosos estados de enfermedad 4, 5. Las células endoteliales formadoras de colonias (ECFCs) son raras que circulan células viables endoteliales caracterizados por robusto potencial clonal proliferativa, colonia secundaria y terciaria capacidad de formación sobre replating, y capacidad para formar intrínseca en los vasos in vivo sobre el trasplante a ratones inmunodeficientes 6-8. Mientras ECFCs se han aislado con éxito de la sangre periférica de adultos sanos, la sangre del cordón umbilical (CB) de recién nacidos sanos, y paredes de los vasos de numerosos vasos arteriales y venosos humanos 6-9, CB cuenta con la mayor frecuencia de ECFCs 7 que la pantalla el más robusto potencial proliferativo clonal y forma los vasos sanguíneos duraderos y funcionales in vivo 8, 10-13. Mientras que la derivación deECFC de la sangre periférica de adultos se han presentado 14, 15, aquí se describen las metodologías para la derivación, la clonación, la expansión, e in vitro, así como en la caracterización in vivo de ECFCs del CB umbilical humana.

Las células endoteliales formadoras de colonias (ECFCs) son las células endoteliales circulantes con un robusto potencial de proliferación clonal que deben mostrarse intrínseca<em&gt; En vivo</emBuque&gt; capacidad de formación. Caracterización fenotípica y funcional de las células endoteliales derivadas de la excrecencia CB son importantes para identificar y aislar<em&gt; Buena fe</em&gt; ECFCs de potencial aplicación clínica en la reparación de tejidos dañados.

Caracterización fenotípica y funcional de las células endoteliales Formadoras de Colonias derivados de la sangre del cordón umbilical

Las perspectivas consolidadas sobre la formación de nuevos vasos sanguíneos a través de la angiogénesis, la vasculogénesis y la arteriogénesis han sido revisadas recientemente1. La presencia de ...

El objetivo general de este procedimiento es explicar cómo obtener células formadoras de colonias endoteliales o CFC-E a partir de sangre de cordón umbilical humano. Esto se logra primero sembrando células mononucleares provenientes de la sangre de cordón umbilical, y luego clonando y expandiendo las colonias derivadas de CFC-E. El segundo paso consiste en caracterizar las células in vitro utilizando una técnica novedosa de ensayo a nivel de célula individual para evaluar el potencial proliferativo clonal.Finalmente, las células se caracterizan mediante un ensayo de formación de vasos in vivo, a través de la producción e implantación de geles que contienen E CFCs en ratones nod skid. En última instancia, la formación in vivo de vasos sanguíneos nuevos llenos de sangre del hospedador puede evaluarse mediante tinción de hematoxilina y eosina (h y e) de los implantes celulares que contienen ECFCs. La principal ventaja de estas técnicas frente a los métodos existentes es que permiten examinar el potencial proliferativo de las células endoteliales a nivel de célula individual.Las implicaciones de esta técnica podrían extenderse hacia la búsqueda de herramientas diagnósticas y terapéuticas para enfermedades como la enfermedad arterial periférica o EAP, ya que este método nos permite examinar el potencial proliferativo y la capacidad génica de las células endoteliales de un paciente. Antes de comenzar el procedimiento, agregue un mililitro de colágeno de cola de rata, tipo uno, en cada pocillo de una placa de cultivo celular de seis pocillos y luego incube la placa durante la noche. En el día del procedimiento, alícuote la sangre de cordón en unidades de 15 mililitros en tubos cónicos de centrífuga de 50 mililitros. A continuación, agregue 20 mililitros de PBS a cada tubo y pipetee la mezcla hacia arriba y hacia abajo varias veces.A continuación, aspire 15 mililitros de fial PA en una pipeta, coloque la punta de la pipeta en el fondo del tubo de sangre diluida e inserte cuidadosamente por debajo la capa de fial PA. Centrifugue los tubos durante 30 minutos a 740 ×g a temperatura ambiente sin activar el freno de desaceleración. Tras la separación celular, utilice una pipeta de transferencia para eliminar la capa turbia de células mononucleares de baja densidad localizada en la interfase entre el pico de fial y el plasma diluido. Deposite las células recolectadas en un tubo cónico de 50 mililitros que contenga 10 mililitros de medio E GM dos y centrifugue las células mononucleares durante 10 minutos a 515 ×g a temperatura ambiente con el freno de desaceleración en posición alta. Aspire y deseche cuidadosamente el sobrenadante.Luego, después de lavar las células del pellet dos veces con EGM2, suspenda las células mononucleares en EGM2 a 1,25 × 10⁷ células por mililitro. Ahora, pipetee cuatro mililitros de la suspensión de células mononucleares en cada pocillo de la placa recubierta con colágeno e incube las células hasta que se formen colonias el primer día. Tras la incubación, retire lentamente el medio gastado de los pocillos con una pipeta sin perturbar las células débilmente adheridas.Luego, agregue cuidadosamente cuatro mililitros de E GM dos a los pocillos y devuelva la placa al incubador. Las colonias suelen aparecer entre los días cinco y 14, el día anterior al procedimiento. A 50 microlitros de colágeno de cola de rata.Coloque un tipo en cada pocillo de una placa de 96 pocillos como antes e incube la placa durante la noche en el día del procedimiento. Comience lavando las células que han sido pasadas solo dos a tres veces, dos veces con PBS. Después de aspirar el lavado final de PBS, coloque un cilindro de clonación recubierto con gel estéril alrededor de cada colonia, presionando firmemente cada cilindro contra la placa usando pinzas estériles.Añada dos o tres gotas de medio Triple E caliente en cada cilindro de clonación e incube los cilindros durante tres a cinco minutos hasta que las células comiencen a desprenderse. Una vez que las células hayan comenzado a desprenderse, añada aproximadamente 250 microlitros de medio EGM dos en el centro del cilindro y pipetee hacia arriba y hacia abajo para obtener una suspensión de células individuales. A continuación, transfiera por separado la suspensión de células individuales de cada cilindro de clonación a un tubo individual de microcentrífuga.Infecte las células en una placa de seis pocillos con lentivirus que expresan EGFP y recolecte las células que expresan EGFP mediante citometría de flujo. A continuación, incube las células positivas para EGFP y EGM dos en placas recubiertas con colágeno. Cuando las CFC endoteliales estén listas, recólectelas utilizando tripéxito como se acaba de demostrar y resuspenda las células en medio EGM dos hasta una concentración final de aproximadamente 10⁶ células por mililitro.Luego, utilizando un clasificador de flujo con una tasa baja de 20 células por segundo, seleccione una única célula ECFC positiva para EGP por pocillo en una placa de 96 pocillos recubierta con colágeno y previamente preparada; ajuste el volumen final de cada pocillo con EGM-2 hasta aproximadamente 200 microlitros por pocillo. A continuación, utilice un microscopio invertido de fluorescencia para asegurarse de que cada pocillo contenga solo una célula. Incube la placa durante un período de dos semanas con dos cambios de medio el día 14 del cultivo.Lave cada pocillo con 100 microlitros de PBS antes de fijar las células con 100 microlitros de paraformaldehído al 4 % durante 30 minutos. Para las CFC que no expresan EGFP, agregue el reactivo cit, un tinte nuclear fluorescente verde, tras la fijación con paraformaldehído e incube a cuatro grados Celsius durante la noche. Utilice un microscopio de fluorescencia para cuantificar visualmente el número de células endoteliales expandidas, tal como se demuestra aquí; los pocillos con un número de células endoteliales entre dos y 50 se consideran agrupaciones de células endoteliales.Los pocillos con 51 a 2000 células son CFE con potencial proliferativo bajo y los pocillos con 2001 o más células se consideran CFE con alto potencial proliferativo. Después de separar las células con triple E como antes, obtener un recuento de células viables del cultivo celular mediante hemocitómetro y azul de tripan. Transferir 2,4 millones de células viables a un tubo cónico de 50 mililitros y luego pelotar las células por centrifugación mientras las células se sedimentan. Mezcle completamente los componentes de la matriz de gel y luego ajuste el pH a 7,4 con hidróxido de sodio mientras mantiene la solución sobre hielo. Después de desechar el sobrenadante, re suspenda el precipitado en 360 microlitros de e GM dos tibio. A continuación, agregue 840 microlitros de la solución de matriz de gel a las células y mezcle cuidadosamente la solución hasta que las células queden completamente suspendidas en el gel. Transfiera esta suspensión celular de gel de un mililitro a un pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos e incube la placa hasta que el gel polimerice.Luego, antes de incubar durante la noche, cubra suavemente el gel con dos mililitros del medio EGM-2 tibio al día siguiente y justo antes del implante. Utilice tijeras de iris para diseccionar el gel en dos piezas iguales y devuelva los fragmentos de gel al mismo pocillo de cultivo que contiene el medio EGM-2. Tras confirmar la sedación mediante el pellizco del dedo del pie, afeite el abdomen inferior de un ratón nod, skid anestesiado de cinco a seis semanas de edad y limpie minuciosamente el sitio quirúrgico mediante paños de alcohol y betadina alternados.A continuación, utilice tijeras iris estériles y afiladas para realizar una incisión de aproximadamente cinco milímetros en el cuadrante inferior del abdomen, exponiendo el espacio subcutáneo entre la piel y el músculo abdominal. Diseque por separación mecánica la capa dérmica del músculo abdominal en dos áreas diferentes del abdomen para crear bolsas de 15 a 20 milímetros de ancho, una que se extienda superiormente hacia el cuadrante abdominal superior y otra hacia otra zona del abdomen. Luego, levante la capa dérmica justo adyacente a la incisión.Inserte una mitad del gel en un bolsillo abdominal y la otra mitad del gel en el otro bolsillo abdominal. Una vez insertados los geles, cierre cada incisión con dos o tres puntos utilizando suturas de polipropileno 5-0 en una aguja cortante. Rotule las tarjetas de las jaulas y realice el monitoreo postoperatorio y la analgesia según los requisitos institucionales y del protocolo.Después de sacrificar al animal en el día 14 de la implantación, limpie el abdomen del ratón con toallitas de alcohol y corte la piel siguiendo la línea de la incisión original. Luego, reseque los colgajos de piel alrededor de la ubicación probable de los geles. Realice cortes circunferenciales alrededor de los geles para extraer cada implante, y a continuación coloque los implantes resecados en el fijador de zinc.Mediante esta técnica de obtención de ECFC, hemos observado el crecimiento de la formación de colonias primarias tan pronto como el día cinco. Observe la morfología empedrada de estos cultivos de ECFC del día cinco, indicada por las cabezas de flecha. Las colonias expandidas expresan antígenos endoteliales, pero no expresan antígenos hematopoyéticos.Como se muestra en esta evaluación fenotípica representativa in vitro de células endoteliales y hematopoyéticas, el inmunofenotipado ha revelado que las CFC-E expresan antígenos endoteliales como CD31, CD34, CD144, CD146, FL1, flick1, flip4 y NRP2, pero no expresaron antígenos hematopoyéticos, CD45, CD14, CD11b, C-Kit, CXCR4 ni CD133. Importante, como se representa en este gráfico de barras, las colonias expandidas muestran una jerarquía completa de potencial proliferativo clonal a nivel de célula individual que va desde grupos de dos a 50 células hasta colonias de más de 2001 células. Estas micrografías de colonias teñidas con cit, un colorante nuclear verde fluorescente, se obtuvieron tras cultivar CFC-E derivadas de sangre de cordón a nivel de célula individual durante 14 días.Además, las CFC forman vasos sanguíneos humanizados que se perfunden con glóbulos rojos del hospedador cuando se implantan en ratones inmunodeficientes. En esta tinción de hematoxilina y eosina de implantes de gel CELLULARIZE que contienen CFC derivadas de sangre de cordón, pueden observarse microvasos llenos de glóbulos rojos del hospedador que se formaron en el gel de colágeno y fibronectina tras 14 días de implantación. Aquí, la tinción marrón con anticuerpo anti-CD31 humano confirma aún más el origen humano de estos vasos.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo derivar las CFC-E a partir de sangre de cordón umbilical humano y de cómo clonar, expandir y caracterizar la funcionalidad de las colonias de CFC-E tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores del endotelio vascular exploraran el potencial proliferativo clonal y la capacidad génica de las células endoteliales obtenidas de múltiples fuentes.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Endoteliales que forman colonias células progenitoras (ECFCs) son una herramienta prometedora para estudiar la homeostasis vascular y la reparación.

El aislamiento y la expansión a gran escala de células humanas adultas Colonia progenitoras endoteliales formación

Este protocolo describe el aislamiento y la posterior expansión de células mesenquimales del estroma y las células endoteliales que forman colonias sin el uso de suero animal para generar pares con fines de trasplante autólogo experimental.

Aislamiento y suero animal expansión libre de cordón umbilical humano derivado de células mesenquimales del estroma (MSC) y endoteliales formadoras de colonias Células Progenitoras (ECFCs)

La formación de colonias de células (CFC) de ensayo es un ensayo in vitro en progenitores hematopoyéticos que forman colonias en un medio semi-sólido. Una combinación de la morfología de la colonia, la morfología celular y citometría de flujo se utilizan para evaluar la capacidad de los progenitores para proliferar y diferenciarse a lo largo de los diferentes linajes hematopoyéticos.

La formación de colonias de células (CFC) para el ensayo de células hematopoyéticas humanas

Este protocolo permite la generación y caracterización fiables de células endoteliales de crecimiento sanguíneo (BOECs) a partir de un pequeño volumen de sangre periférica adulta. Las BOEC se pueden utilizar como sustituto de las células endoteliales de pacientes con trastornos vasculares y como sustrato para la generación de células madre pluripotentes inducidas.

Generación y Cultura de Sangre Consecuencia endoteliales Las células de la sangre periférica humana

células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) se derivan de las células endoteliales especializadas (hemogenic) durante el desarrollo, sin embargo, se sabe poco sobre el proceso por el cual algunas células endoteliales especifican a convertirse en la formación de la sangre. Demostramos un método basado en citometría de flujo permite el aislamiento simultáneo de las células endoteliales y hemogenic HSPC de tejidos embrionarios murinos.

Aislamiento de las células murinas embrionarias Hemogenic endoteliales

El objetivo de este protocolo es aislar las células progenitoras endoteliales de cordón umbilical. Algunas de las aplicaciones incluyen el uso de estas células como un biomarcador para identificar pacientes con riesgo cardiovascular, tratamiento de enfermedades isquémicas, y construye creando ingeniería de tejido vascular y del corazón la válvula.

Aislamiento de células endoteliales progenitoras de la sangre de cordón Umbilical humano

Aquí, presentamos un protocolo para formar con precisión endotelio hemogénico a partir de células madre pluripotentes humanas en una condición libre de alimentador y xeno. Este método tendrá amplias aplicaciones en el modelado de enfermedades y cribado de compuestos terapéuticos.

Diferenciación de endotelio hemogénico de células madre pluripotentes humanas en una condición definida libre de alimentador y xeno

Aquí, presentamos un protocolo para la caracterización inmunophenotípica y la diferenciación inducida por citoquinas de la sangre de cordón umbilical derivada CD34+ células madre hematopoyéticas y células progenitoras a los cuatro linajes mieloides. Las aplicaciones de este protocolo incluyen investigaciones sobre el efecto de mutaciones de la enfermedad mieloide o moléculas pequeñas en la diferenciación mieloide de las células CD34+.

Diferenciación panmieloide de la sangre de cordón humano derivada CD34+ Células hematopoyéticas del tallo y progenitor

El sistema de ensayo de angiogénesis esferoide cocultura tridimensional está diseñado para imitar la angiogénesis fisiológica. Los esferoides de cocultivo están formados por dos precursores de células vasculares humanas, EFCC y MSC, e incrustados en gel de colágeno. El nuevo sistema es eficaz para evaluar moduladores angiogénicos y proporciona información más relevante al estudio in vivo.

Sistema de ensayo de angiogénesis tridimensional utilizando esferoides de cocultura formados por células formadoras de colonias endoteliales y células madre mesenquimales

Aquí se presenta un protocolo simple para la diferenciación dirigida de células endoteliales hemogénicas de células madre pluripotentes humanas en aproximadamente 1 semana.

Diferenciación dirigida de células endoteliales hemogénicas de células madre pluripotentes humanas

The endothelium is a dynamic integrated structure that plays an important role in many physiological functions such as angiogenesis, hemostasis, ...

Caracterización de células endoteliales de crecimiento sanguíneo (BOEC) de sangre periférica porcina

Aprende a derivar células endoteliales formadoras de colonias (ECFC) de sangre de cordón umbilical humano. Este método permite caracterizar su potencial proliferativo clonal y capacidad de formación vascular in vivo.

Caracterización fenotípica y funcional de las células endoteliales Formadoras de Colonias derivados de la sangre del cordón umbilical (Video) | JoVE Journal

Caracterización fenotípica y funcional de las células endoteliales Formadoras de Colonias derivados de la sangre del cordón umbilical

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