Caracterización fenotípica y funcional de las células endoteliales Formadoras de Colonias derivados de la sangre del cordón umbilical

El objetivo general de este procedimiento es explicar cómo derivar células formadoras de colonias endoteliales o e CFC a partir de la sangre del cordón umbilical humano. Esto se logra primero colocando células mononucleares en la sangre del cordón umbilical y luego clonando y expandiendo las colonias de E CFC. El segundo paso consiste en caracterizar las células in vitro utilizando una novedosa técnica de ensayo de célula única para el potencial proliferativo clonal.

Finalmente, las células se caracterizan en un ensayo de formación de vasos in vivo a través de la producción e implantación de geles que contienen E CFCs en ratones nod skid. En última instancia, la formación in vivo de vasos sanguíneos de novo del huésped puede evaluarse mediante la tinción h y e de los implantes celulares que contienen ECFC. La principal ventaja de estas técnicas sobre los métodos existentes es que estos métodos permiten examinar el potencial proliferativo de las células endoteliales a nivel de una sola célula.

Las implicaciones de esta técnica podrían extenderse hacia la búsqueda de herramientas diagnósticas y terapéuticas para enfermedades como la enfermedad arterial salvaje o la EAP, ya que esta técnica permite examinar el potencial proliferativo y la capacidad génica de las células endoteliales de un paciente. Antes de comenzar el procedimiento, agregue un mililitro de colágeno de cola de rata, escriba uno en cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos de seis pocillos y luego incube la placa durante la noche el día del procedimiento, alícuota la sangre del cordón umbilical en unidades de 15 mililitros en tubos de centrífuga cónicos de 50 mililitros. A continuación, añada 20 mililitros de PBS a cada tubo y pipetee la mezcla hacia arriba y hacia abajo varias veces.

A continuación, extraiga 15 mililitros de PA fial en una pipeta, coloque la punta de la pipeta en el fondo del tubo de sangre diluida y coloque cuidadosamente la centrífuga alpac durante 30 minutos a 740 veces G a temperatura ambiente sin el ajuste del freno de desaceleración. Después de la separación celular, utilice una pipeta de transferencia para eliminar la capa nebulosa de células mononucleares de baja densidad ubicada en la interfaz entre el pico fial y el plasma diluido. Dispense las células recolectadas en un tubo cónico de 50 mililitros que contenga 10 mililitros de medio E GM dos y granule las celdas mononucleares durante 10 minutos a 515 veces G a temperatura ambiente con la configuración de freno de alta desaceleración, aspire con cuidado y deseche el sobrenadante.

Luego, después de lavar las células peletizadas con EGM dos veces resus, suspenda las células mononucleares en EGM dos a 1,25 veces 10 a la séptima célula por mililitro. Ahora pipetee cuatro mililitros de la suspensión de células mononucleares en cada pocillo de la placa recubierta de colágeno e incube las células hasta que se formen colonias el primer día. Después de la incubación, retire lentamente el medio gastado de los pocillos con una pipeta sin alterar las células poco adheridas.

Luego agregue con cuidado cuatro mililitros de E GM dos a los pocillos y devuelva la placa a la incubadora. Las colonias suelen aparecer entre los días cinco y 14, el día anterior al procedimiento. A 50 microlitros de colágeno de cola de rata.

Escriba uno en cada pocillo de una placa de 96 pocillos como antes e incube la placa durante la noche el día del procedimiento. Comience lavando las celdas que han pasado solo dos o tres veces dos veces con PBS. Después de aspirar el lavado final de PBS, coloque un cilindro de clonación estéril recubierto de gel alrededor de cada colonia, presionando cada cilindro firmemente contra la placa con pinzas estériles.

Agregue dos o tres gotas de triple E express caliente en cada cilindro de clonación e incube los cilindros durante tres a cinco minutos hasta que las células comiencen a desprenderse. Después de que las celdas hayan comenzado a desprenderse a aproximadamente 250 microlitros de EGM, dos medios en el centro del cilindro y pipeteen hacia arriba y hacia abajo para generar una suspensión de una sola celda. Ahora transfiera la suspensión de una sola celda de cada cilindro de clonación por separado a un tubo de microcentrífuga individual.

Infecte las células en una placa de seis pocillos con lentivirus que expresan EGFP y recoja las células que expresan EGFP mediante citometría fluorescente. A continuación, incubar las células positivas para EEG FP y EGM dos en las placas recubiertas de colágeno. Cuando los E CFC estén listos, recójalos utilizando el viaje E express como se acaba de demostrar y resus suspenda las celdas y eGM dos medios hasta una concentración final de aproximadamente 10 a la sexta celdas por mililitro.

Luego, usando un clasificador de flujo con un caudal bajo de 20 celdas por segundo, clasifique un solo ECFC positivo para EGP por pocillo en la placa de 96 pocillos recubierta de colágeno previamente preparada, ajuste el volumen final de cada pocillo con EGM de dos a aproximadamente 200 microlitros por pocillo. A continuación, utilice un microscopio de fluorescencia invertida para asegurarse de que cada pocillo contiene una sola célula. Incubar la placa durante un período de dos semanas con dos cambios de medio en el día 14 de cultivo.

Lave cada pocillo con 100 microlitros de PBS antes de fijar las celdas con 100 microlitros de aldehído paraformado al 4% durante 30 minutos. En el caso de los e CFC que no expresan EGFP, añada el reactivo cyt, un colorante nuclear fluorescente verde tras la fijación de para formaldehído, e incube a cuatro grados centígrados durante la noche. Utilice un microscopio de fluorescencia para cuantificar visiblemente el número de células endoteliales expandidas, como se demuestra aquí: los pocillos con un número de células endoteliales de dos a 50 se consideran grupos de células endoteliales.

Los pocillos con 51 a 2000 células son CFC de bajo potencial proliferativo y los pozos con 2001 o más se consideran CFC de alto potencial proliferativo. Después de separar las células con triple E express como antes, se obtiene un recuento de células viables del cultivo celular por hemo, citómetro y azul de triano. Transfiera 2,4 millones de células viables a un tubo cónico de 50 mililitros y luego granule las células por centrifugación mientras las células se centrifugan.

Mezcle bien los componentes de la matriz de gel y luego ajuste el pH a 7,4 con hidróxido de sodio mientras mantiene la solución en hielo. Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet en 360 microlitros de caliente e GM dos. Luego agregue 840 microlitros de la solución de matriz de gel a las células y mezcle la solución con cuidado hasta que las células estén completamente suspendidas en el gel. Transfiera esta suspensión de gel celular de un mililitro a un pocillo de una placa de cultivo de tejido de 12 pocillos e incube la placa hasta que el gel polimerice.

Luego, antes de incubar durante la noche, cubra suavemente el gel con dos mililitros de EGM dos tibios al día siguiente e inmediatamente antes de la implantación. Use tijeras de iris para diseccionar el gel en dos piezas iguales y devuelva las piezas de gel al mismo pozo de cultivo que contiene e GM dos medios. Después de confirmar la sedación con un pellizco en los dedos de los pies, afeitar la parte inferior del abdomen de un niño de cinco a seis semanas de edad, afeitar el abdomen anestesiado, deslizar el ratón y limpiar a fondo el sitio quirúrgico rotando las almohadillas con alcohol y betadine.

A continuación, utilice unas tijeras de iris afiladas y estériles para hacer una incisión de aproximadamente cinco milímetros en el cuadrante inferior del abdomen, exponiendo el espacio subcutáneo entre la piel y el músculo abdominal. Desafilado. Disecciona la capa dérmica del músculo abdominal en dos áreas diferentes del abdomen para crear bolsas de 15 a 20 milímetros de ancho, una que conduce a la parte superior del cuadrante abdominal superior y otra a otra área del abdomen. Luego, levantando la capa dérmica, simplemente mima la incisión.

Inserte la mitad de la pieza de gel en un bolsillo abdominal y la otra mitad de la pieza de gel en la otra bolsa abdominal. Después de haber insertado los geles, cierre cada incisión con dos o tres puntos de sutura usando cinco suturas de polipropileno en una aguja de corte. Etiquetar las tarjetas de jaula y realizar el seguimiento postquirúrgico y la analgesia según los requisitos institucionales y del protocolo.

Después de sacrificar al animal en el día 14 de la implantación, frote el abdomen del ratón con almohadillas con alcohol y corte la piel mimada hasta la línea de incisión original. A continuación, extirpe los colgajos de piel mimados hasta la ubicación probable de los geles. Corta circunferencialmente alrededor de los geles para extraer cada implante y luego coloca los implantes extirpados en el fijador de zinc.

Utilizando esta técnica de derivación de ECFC, hemos observado el crecimiento de la formación de colonias primarias ya en el quinto día. Obsérvese la morfología de adoquines de estas culturas ECFC de hoy en día, como lo indican las puntas de flecha. Las colonias expandidas expresan antígenos endoteliales, pero no expresan antígenos hematopoyéticos.

Como se muestra en esta evaluación fenotípica in vitro representativa de células endoteliales y hematopoyéticas, el inmunofenotipado ha revelado que los e CFC expresan antígenos endoteliales como CD 31, CD 34, CD 1 44, CD 1 46, FL uno, flick uno, flip cuatro y NRP dos, pero no expresaron antígenos hematopoyéticos, CD 45 CD 14, CD 11 BC Kit CXCR cuatro o CD 1 33. Es importante destacar que, como se representa en este gráfico de barras, las colonias expandidas muestran una jerarquía completa de potencial proliferativo clonal a nivel de una sola célula que va desde grupos de dos a 50 células hasta colonias de más de 2001. Estas micrografías de colonias teñidas con cyt, un colorante nuclear fluorescente verde, se obtuvieron después de que los E CFC derivados de la sangre del cordón umbilical se cultivaran a nivel de una sola célula durante 14 días.

Además, los e CFC forman vasos sanguíneos humanizados que se perfunden con los glóbulos rojos del huésped cuando se implantan en ratones inmunodeficientes. En esta tinción h y e de implantes de gel ECFC derivados de la sangre del cordón umbilical que contienen CELLULARIZE, se pueden observar microvasos llenos de glóbulos rojos del huésped que se formaron en el gel de colágeno y fibronectina después de 14 días de la implantación. Aquí, la tinción antihumana de CD 31 en marrón confirma aún más el origen humano de estos vasos.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo derivar e CFC de la sangre del cordón umbilical humano y de cómo clonar, expandir y caracterizar la funcionalidad de las colonias de ECFC después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en endotelio vascular exploraran el potencial proliferativo clonal endotelial y la capacidad génica de las células endoteliales que se obtienen de múltiples fuentes.