Caracterización fenotípica y funcional de las células endoteliales Formadoras de Colonias derivados de la sangre del cordón umbilical

El objetivo general de este procedimiento es explicar cómo obtener células formadoras de colonias endoteliales o CFC-E a partir de sangre de cordón umbilical humano. Esto se logra primero sembrando células mononucleares provenientes de la sangre de cordón umbilical, y luego clonando y expandiendo las colonias derivadas de CFC-E. El segundo paso consiste en caracterizar las células in vitro utilizando una técnica novedosa de ensayo a nivel de célula individual para evaluar el potencial proliferativo clonal.

Finalmente, las células se caracterizan mediante un ensayo de formación de vasos in vivo, a través de la producción e implantación de geles que contienen E CFCs en ratones nod skid. En última instancia, la formación in vivo de vasos sanguíneos nuevos llenos de sangre del hospedador puede evaluarse mediante tinción de hematoxilina y eosina (h y e) de los implantes celulares que contienen ECFCs. La principal ventaja de estas técnicas frente a los métodos existentes es que permiten examinar el potencial proliferativo de las células endoteliales a nivel de célula individual.

Las implicaciones de esta técnica podrían extenderse hacia la búsqueda de herramientas diagnósticas y terapéuticas para enfermedades como la enfermedad arterial periférica o EAP, ya que este método nos permite examinar el potencial proliferativo y la capacidad génica de las células endoteliales de un paciente. Antes de comenzar el procedimiento, agregue un mililitro de colágeno de cola de rata, tipo uno, en cada pocillo de una placa de cultivo celular de seis pocillos y luego incube la placa durante la noche. En el día del procedimiento, alícuote la sangre de cordón en unidades de 15 mililitros en tubos cónicos de centrífuga de 50 mililitros. A continuación, agregue 20 mililitros de PBS a cada tubo y pipetee la mezcla hacia arriba y hacia abajo varias veces.

A continuación, aspire 15 mililitros de fial PA en una pipeta, coloque la punta de la pipeta en el fondo del tubo de sangre diluida e inserte cuidadosamente por debajo la capa de fial PA. Centrifugue los tubos durante 30 minutos a 740 ×g a temperatura ambiente sin activar el freno de desaceleración. Tras la separación celular, utilice una pipeta de transferencia para eliminar la capa turbia de células mononucleares de baja densidad localizada en la interfase entre el pico de fial y el plasma diluido. Deposite las células recolectadas en un tubo cónico de 50 mililitros que contenga 10 mililitros de medio E GM dos y centrifugue las células mononucleares durante 10 minutos a 515 ×g a temperatura ambiente con el freno de desaceleración en posición alta. Aspire y deseche cuidadosamente el sobrenadante.

Luego, después de lavar las células del pellet dos veces con EGM2, suspenda las células mononucleares en EGM2 a 1,25 × 10⁷ células por mililitro. Ahora, pipetee cuatro mililitros de la suspensión de células mononucleares en cada pocillo de la placa recubierta con colágeno e incube las células hasta que se formen colonias el primer día. Tras la incubación, retire lentamente el medio gastado de los pocillos con una pipeta sin perturbar las células débilmente adheridas.

Luego, agregue cuidadosamente cuatro mililitros de E GM dos a los pocillos y devuelva la placa al incubador. Las colonias suelen aparecer entre los días cinco y 14, el día anterior al procedimiento. A 50 microlitros de colágeno de cola de rata.

Coloque un tipo en cada pocillo de una placa de 96 pocillos como antes e incube la placa durante la noche en el día del procedimiento. Comience lavando las células que han sido pasadas solo dos a tres veces, dos veces con PBS. Después de aspirar el lavado final de PBS, coloque un cilindro de clonación recubierto con gel estéril alrededor de cada colonia, presionando firmemente cada cilindro contra la placa usando pinzas estériles.

Añada dos o tres gotas de medio Triple E caliente en cada cilindro de clonación e incube los cilindros durante tres a cinco minutos hasta que las células comiencen a desprenderse. Una vez que las células hayan comenzado a desprenderse, añada aproximadamente 250 microlitros de medio EGM dos en el centro del cilindro y pipetee hacia arriba y hacia abajo para obtener una suspensión de células individuales. A continuación, transfiera por separado la suspensión de células individuales de cada cilindro de clonación a un tubo individual de microcentrífuga.

Infecte las células en una placa de seis pocillos con lentivirus que expresan EGFP y recolecte las células que expresan EGFP mediante citometría de flujo. A continuación, incube las células positivas para EGFP y EGM dos en placas recubiertas con colágeno. Cuando las CFC endoteliales estén listas, recólectelas utilizando tripéxito como se acaba de demostrar y resuspenda las células en medio EGM dos hasta una concentración final de aproximadamente 10⁶ células por mililitro.

Luego, utilizando un clasificador de flujo con una tasa baja de 20 células por segundo, seleccione una única célula ECFC positiva para EGP por pocillo en una placa de 96 pocillos recubierta con colágeno y previamente preparada; ajuste el volumen final de cada pocillo con EGM-2 hasta aproximadamente 200 microlitros por pocillo. A continuación, utilice un microscopio invertido de fluorescencia para asegurarse de que cada pocillo contenga solo una célula. Incube la placa durante un período de dos semanas con dos cambios de medio el día 14 del cultivo.

Lave cada pocillo con 100 microlitros de PBS antes de fijar las células con 100 microlitros de paraformaldehído al 4 % durante 30 minutos. Para las CFC que no expresan EGFP, agregue el reactivo cit, un tinte nuclear fluorescente verde, tras la fijación con paraformaldehído e incube a cuatro grados Celsius durante la noche. Utilice un microscopio de fluorescencia para cuantificar visualmente el número de células endoteliales expandidas, tal como se demuestra aquí; los pocillos con un número de células endoteliales entre dos y 50 se consideran agrupaciones de células endoteliales.

Los pocillos con 51 a 2000 células son CFE con potencial proliferativo bajo y los pocillos con 2001 o más células se consideran CFE con alto potencial proliferativo. Después de separar las células con triple E como antes, obtener un recuento de células viables del cultivo celular mediante hemocitómetro y azul de tripan. Transferir 2,4 millones de células viables a un tubo cónico de 50 mililitros y luego pelotar las células por centrifugación mientras las células se sedimentan.

Mezcle completamente los componentes de la matriz de gel y luego ajuste el pH a 7,4 con hidróxido de sodio mientras mantiene la solución sobre hielo. Después de desechar el sobrenadante, re suspenda el precipitado en 360 microlitros de e GM dos tibio. A continuación, agregue 840 microlitros de la solución de matriz de gel a las células y mezcle cuidadosamente la solución hasta que las células queden completamente suspendidas en el gel. Transfiera esta suspensión celular de gel de un mililitro a un pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos e incube la placa hasta que el gel polimerice.

Luego, antes de incubar durante la noche, cubra suavemente el gel con dos mililitros del medio EGM-2 tibio al día siguiente y justo antes del implante. Utilice tijeras de iris para diseccionar el gel en dos piezas iguales y devuelva los fragmentos de gel al mismo pocillo de cultivo que contiene el medio EGM-2. Tras confirmar la sedación mediante el pellizco del dedo del pie, afeite el abdomen inferior de un ratón nod, skid anestesiado de cinco a seis semanas de edad y limpie minuciosamente el sitio quirúrgico mediante paños de alcohol y betadina alternados.

A continuación, utilice tijeras iris estériles y afiladas para realizar una incisión de aproximadamente cinco milímetros en el cuadrante inferior del abdomen, exponiendo el espacio subcutáneo entre la piel y el músculo abdominal. Diseque por separación mecánica la capa dérmica del músculo abdominal en dos áreas diferentes del abdomen para crear bolsas de 15 a 20 milímetros de ancho, una que se extienda superiormente hacia el cuadrante abdominal superior y otra hacia otra zona del abdomen. Luego, levante la capa dérmica justo adyacente a la incisión.

Inserte una mitad del gel en un bolsillo abdominal y la otra mitad del gel en el otro bolsillo abdominal. Una vez insertados los geles, cierre cada incisión con dos o tres puntos utilizando suturas de polipropileno 5-0 en una aguja cortante. Rotule las tarjetas de las jaulas y realice el monitoreo postoperatorio y la analgesia según los requisitos institucionales y del protocolo.

Después de sacrificar al animal en el día 14 de la implantación, limpie el abdomen del ratón con toallitas de alcohol y corte la piel siguiendo la línea de la incisión original. Luego, reseque los colgajos de piel alrededor de la ubicación probable de los geles. Realice cortes circunferenciales alrededor de los geles para extraer cada implante, y a continuación coloque los implantes resecados en el fijador de zinc.

Mediante esta técnica de obtención de ECFC, hemos observado el crecimiento de la formación de colonias primarias tan pronto como el día cinco. Observe la morfología empedrada de estos cultivos de ECFC del día cinco, indicada por las cabezas de flecha. Las colonias expandidas expresan antígenos endoteliales, pero no expresan antígenos hematopoyéticos.

Como se muestra en esta evaluación fenotípica representativa in vitro de células endoteliales y hematopoyéticas, el inmunofenotipado ha revelado que las CFC-E expresan antígenos endoteliales como CD31, CD34, CD144, CD146, FL1, flick1, flip4 y NRP2, pero no expresaron antígenos hematopoyéticos, CD45, CD14, CD11b, C-Kit, CXCR4 ni CD133. Importante, como se representa en este gráfico de barras, las colonias expandidas muestran una jerarquía completa de potencial proliferativo clonal a nivel de célula individual que va desde grupos de dos a 50 células hasta colonias de más de 2001 células. Estas micrografías de colonias teñidas con cit, un colorante nuclear verde fluorescente, se obtuvieron tras cultivar CFC-E derivadas de sangre de cordón a nivel de célula individual durante 14 días.

Además, las CFC forman vasos sanguíneos humanizados que se perfunden con glóbulos rojos del hospedador cuando se implantan en ratones inmunodeficientes. En esta tinción de hematoxilina y eosina de implantes de gel CELLULARIZE que contienen CFC derivadas de sangre de cordón, pueden observarse microvasos llenos de glóbulos rojos del hospedador que se formaron en el gel de colágeno y fibronectina tras 14 días de implantación. Aquí, la tinción marrón con anticuerpo anti-CD31 humano confirma aún más el origen humano de estos vasos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo derivar las CFC-E a partir de sangre de cordón umbilical humano y de cómo clonar, expandir y caracterizar la funcionalidad de las colonias de CFC-E tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores del endotelio vascular exploraran el potencial proliferativo clonal y la capacidad génica de las células endoteliales obtenidas de múltiples fuentes.