Name: Caracterización fenotípica y funcional de las células endoteliales Formadoras de Colonias derivados de la sangre del cordón umbilical (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 46 s
Description: Aprende a derivar células endoteliales formadoras de colonias (ECFC) de sangre de cordón umbilical humano. Este método permite caracterizar su potencial proliferativo clonal y capacidad de formación vascular in vivo.

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Dr. Yoder es consultor de Tecnologías de la EndGenitor, Inc. y miembro de la junta directiva de las Tecnologías de Rimedion, Inc.

<ol><li>Carmeliet, P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+and+clinical+applications+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis.</a> Nature. 473, 298-307 (2011).</li>
<li>Asahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+putative+progenitor+endothelial+cells+for+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis.</a> Science. 275, 964-967 (1997).</li>
<li>Urbich, C., Dimmeler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+progenitor+cells%3A+characterization+and+role+in+vascular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Endothelial progenitor cells: characterization and role in vascular biology.</a> Circ. Res. 95, 343-353 (2004).</li>
<li>Critser, P. J., Voytik-Harbin, S. L., Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+and+defining+cells+to+engineer+human+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Prolif%22%5BJournal%5D)">Isolating and defining cells to engineer human blood vessels.</a> Cell. Prolif. 44, 15-21 (2011).</li>
<li>Matthias, M., David, N., Josef, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+bench+to+bedside%3A+what+physicians+need+to+know+about+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">From bench to bedside: what physicians need to know about endothelial progenitor cells.</a> Am. J. Med. 124, 489-4897 (2011).</li>
<li>Ingram, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vessel+wall-derived+endothelial+cells+rapidly+proliferate+because+they+contain+a+complete+hierarchy+of+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Vessel wall-derived endothelial cells rapidly proliferate because they contain a complete hierarchy of endothelial progenitor cells.</a> Blood. 105, 2783-276 (2005).</li>
<li>Ingram, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+hierarchy+of+endothelial+progenitor+cells+using+human+peripheral+and+umbilical+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood.</a> Blood. 104, 2752-2760 (2004).</li>
<li>Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+endothelial+progenitor+cells+via+clonal+analysis+and+hematopoietic+stem%2Fprogenitor+cell+principals%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals.</a> Blood. 109, 1801-1809 (2007).</li>
<li>Reinisch, A., Strunk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Animal+Serum+Free+Expansion+of+Human+Umbilical+Cord+Derived+Mesenchymal+Stromal+Cells+%28MSCs%29+and+Endothelial+Colony+Forming+Progenitor+Cells+%28ECFCs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs.</a> J. Vis. Exp. (32), e1525(2009).</li>
<li>Au, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+in+vivo+potential+of+endothelial+progenitor+cells+from+human+umbilical+cord+blood+and+adult+peripheral+blood+to+form+functional+long-lasting+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Differential in vivo potential of endothelial progenitor cells from human umbilical cord blood and adult peripheral blood to form functional long-lasting vessels.</a> Blood. 111, 1302-135 (2008).</li>
<li>Critser, P. J., Kreger, S. T., Voytik-Harbin, S. L., Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+matrix+physical+properties+modulate+endothelial+colony+forming+cell-derived+vessels+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Collagen matrix physical properties modulate endothelial colony forming cell-derived vessels in vivo.</a> Microvasc. Res. 80, 23-30 (2010).</li>
<li>Melero-Martin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+robust+and+functional+vascular+networks+in+vivo+with+human+adult+and+cord+blood-derived+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Engineering robust and functional vascular networks in vivo with human adult and cord blood-derived progenitor cells.</a> Circ. Res. 103, 194-202 (2008).</li>
<li>Melero-Martin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+vasculogenic+potential+of+human+blood-derived+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells.</a> Blood. 109, 4761-4768 (2007).</li>
<li>Hofmann, N. A., Reinisch, A., Strunk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Large+Scale+Expansion+of+Adult+Human+Endothelial+Colony+Forming+Progenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells.</a> J. Vis. Exp. (32), e1524(2009).</li>
<li>Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+of+circulating+endothelial+cells+and+endothelial+outgrowth+from+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood.</a> J. Clin. Invest. 105, 71-77 (2000).</li>
<li>Witting, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Large+Volume+Lentiviral+Vector+Production+Using+Flow+Electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene.+Ther%22%5BJournal%5D)">Efficient Large Volume Lentiviral Vector Production Using Flow Electroporation.</a> Hum. Gene. Ther. , (2011).</li>
<li>Yoon, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+neovascularization+by+mixed+transplantation+of+early+endothelial+progenitor+cells+and+late+outgrowth+endothelial+cells%3A+the+role+of+angiogenic+cytokines+and+matrix+metalloproteinases%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Synergistic neovascularization by mixed transplantation of early endothelial progenitor cells and late outgrowth endothelial cells: the role of angiogenic cytokines and matrix metalloproteinases.</a> Circulation. , 112-1618 (2005).</li>
<li>Dubois, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+progenitor+cell+populations+on+left+ventricular+remodeling+and+myocardial+neovascularization+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Coll.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Differential effects of progenitor cell populations on left ventricular remodeling and myocardial neovascularization after myocardial infarction.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 55, 2232-2243 (2010).</li>
<li>Medina, R. J., O'Neill, C. L., Humphreys, M. W., Gardiner, T. A., Stitt, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outgrowth+endothelial+cells%3A+characterization+and+their+potential+for+reversing+ischemic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Outgrowth endothelial cells: characterization and their potential for reversing ischemic retinopathy.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 5906-5913 (2010).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Caracterización fenotípica y funcional de las supuestas células progenitoras endoteliales es importante identificar los ECFCs de buena fe que son capaces de clonación y la serie de re-siembra en la cultura y dar lugar a los vasos sanguíneos duraderos y funcionales implantables in vivo. La sangre de cordón umbilical humano se enriquece con ECFCs y la concentración de estos descensos que circulan células con el envejecimiento o la enfermedad 10. Estudios recientes sugieren que ECFC pueden dese...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Heparina sódica inyectable, USP </td><td> APP Pharmaceuticals </td><td> 504031 </td></tr><tr><td> Ficoll-Pague </td><td> Amersham Biosciences </td><td> 17-1440-03 </td></tr><tr><td> Mezcla cánula </td><td> Maersk Medical </td><td> 500.11.012 </td></tr><tr><td> EGM-2 </td><td> Lonza </td><td> CC-3162 </td></tr><tr><td> SFB se define </td><td> Hyclone </td><td> SH30070.03 </td></tr><tr><td> TrypLE expresa </td><td> Gibco </td><td> 12605 </td></tr><tr><td> Rata de colágeno tipo I </td><td> BD Biosciences </td><td> 354236 </td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD Biosciences </td><td> 356234 </td></tr><tr><td> Bloquear FcR </td><td> Miltenyi Biotech </td><td> 130-059-901 </td></tr><tr><td> hCD31, FITC conjugaciónTed </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555445 </td></tr><tr><td> hCD45, conjugado con FITC </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555482 </td></tr><tr><td> hCD14, conjugado con FITC </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555397 </td></tr><tr><td> hCD144, conjugado PE </td><td> eBioscience </td><td> 12-1449-80 </td></tr><tr><td> hCD146, conjugado PE </td><td> BD Pharmingen </td><td> 550315 </td></tr><tr><td> hCD105, conjugado PE </td><td> Invitrogen </td><td> MHCD10504 </td></tr><tr><td> Sra. IgG1, k del anticuerpo, conjugado con FITC </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555748 </td></tr><tr><td> D. IgG 1, anticuerpo k, conjugado PE </td><td> BD Pharmingen </td><td> 559320 </td></tr><tr><td> Sra. IgG2a, anticuerpo k, conjugado con FITC </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555573 </td></tr><tr><td> Anti-CD31 humano </td><td> Dako </td><td> clon de JC70 / A </td></tr><tr><td> Anti-mousCD31 e </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553370 </td></tr><tr><td> 0,22-micras vacío sistema de filtración </td><td> Millipore </td><td> SCGPU05RE </td></tr><tr><td> Ácido acético glacial, 17.4N </td><td> Pescador </td><td> A38-500 </td></tr><tr><td> Antibiótico-antimicótico </td><td> Invitrogen </td><td> 15240-062 </td></tr><tr><td> Suero fetal bovino (SFB) </td><td> Hyclone </td><td> SH30070.03 </td></tr><tr><td> IHC zinc Fijador </td><td> BD Biosciences </td><td> 550523 </td></tr><tr><td> Sytox verde reactivo </td><td> Invitrogen </td><td> S33025 </td></tr><tr><td> Cilindros de clonación y estériles </td><td> Fisher Scientific </td><td> 07-907-10 </td></tr></tbody></table>

caracterización fenotípica y funcional de las células endoteliales formadoras de colonias derivados de la sangre del cordón umbilical

Phenotypic and Functional Characterization of Endothelial Colony Forming Cells Derived from Human Umbilical Cord Blood

Puntos de vista de muchos años de la formación de nuevos vasos sanguíneos a través de la angiogénesis, vasculogénesis, y arteriogénesis se han revisado recientemente 1. La presencia de células progenitoras endoteliales circulantes (EPC) se identificaron por primera vez en adultos sangre periférica humana por Asahara et al. En 1997 2, trayendo una infusión de nuevas hipótesis y estrategias para la regeneración vascular y reparación. EPC son componentes poco comunes, pero normal de la sangre circulante de que el hogar de los sitios de formación de vasos sanguíneos o el remodelado vascular, y facilitar tanto la vasculogénesis postnatal, la angiogénesis, o en gran medida a través de arteriogénesis estimulación paracrina de la pared de los vasos existentes derivan las células 3. No hay un marcador específico para identificar un EPC ha sido identificado, y en la actualidad el estado del campo es comprender que numerosos tipos de células madre, incluyendo proangiogénico hematopoyéticas y las células progenitoras, las células circulantes angiogénicos, Tie2 + monocitos, cel progenitor mieloideLS, tumorales macrófagos asociados, y M2 macrófagos activados participar en la estimulación del proceso angiogénico en una variedad de sistemas de modelos animales preclínicos y en los sujetos humanos en numerosos estados de enfermedad 4, 5. Las células endoteliales formadoras de colonias (ECFCs) son raras que circulan células viables endoteliales caracterizados por robusto potencial clonal proliferativa, colonia secundaria y terciaria capacidad de formación sobre replating, y capacidad para formar intrínseca en los vasos in vivo sobre el trasplante a ratones inmunodeficientes 6-8. Mientras ECFCs se han aislado con éxito de la sangre periférica de adultos sanos, la sangre del cordón umbilical (CB) de recién nacidos sanos, y paredes de los vasos de numerosos vasos arteriales y venosos humanos 6-9, CB cuenta con la mayor frecuencia de ECFCs 7 que la pantalla el más robusto potencial proliferativo clonal y forma los vasos sanguíneos duraderos y funcionales in vivo 8, 10-13. Mientras que la derivación deECFC de la sangre periférica de adultos se han presentado 14, 15, aquí se describen las metodologías para la derivación, la clonación, la expansión, e in vitro, así como en la caracterización in vivo de ECFCs del CB umbilical humana.

Las células endoteliales formadoras de colonias (ECFCs) son las células endoteliales circulantes con un robusto potencial de proliferación clonal que deben mostrarse intrínseca<em&gt; En vivo</emBuque&gt; capacidad de formación. Caracterización fenotípica y funcional de las células endoteliales derivadas de la excrecencia CB son importantes para identificar y aislar<em&gt; Buena fe</em&gt; ECFCs de potencial aplicación clínica en la reparación de tejidos dañados.

Caracterización fenotípica y funcional de las células endoteliales Formadoras de Colonias derivados de la sangre del cordón umbilical

Las perspectivas consolidadas sobre la formación de nuevos vasos sanguíneos a través de la angiogénesis, la vasculogénesis y la arteriogénesis han sido revisadas recientemente1. La presencia de ...

El objetivo general de este procedimiento es explicar cómo obtener células formadoras de colonias endoteliales o CFC-E a partir de sangre de cordón umbilical humano. Esto se logra primero sembrando células mononucleares provenientes de la sangre de cordón umbilical, y luego clonando y expandiendo las colonias derivadas de CFC-E. El segundo paso consiste en caracterizar las células in vitro utilizando una técnica novedosa de ensayo a nivel de célula individual para evaluar el potencial proliferativo clonal.Finalmente, las células se caracterizan mediante un ensayo de formación de vasos in vivo, a través de la producción e implantación de geles que contienen E CFCs en ratones nod skid. En última instancia, la formación in vivo de vasos sanguíneos nuevos llenos de sangre del hospedador puede evaluarse mediante tinción de hematoxilina y eosina (h y e) de los implantes celulares que contienen ECFCs. La principal ventaja de estas técnicas frente a los métodos existentes es que permiten examinar el potencial proliferativo de las células endoteliales a nivel de célula individual.Las implicaciones de esta técnica podrían extenderse hacia la búsqueda de herramientas diagnósticas y terapéutic

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Investigación

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Biology

Biología

Endoteliales que forman colonias células progenitoras (ECFCs) son una herramienta prometedora para estudiar la homeostasis vascular y la reparación.

El aislamiento y la expansión a gran escala de células humanas adultas Colonia progenitoras endoteliales formación

Este protocolo describe el aislamiento y la posterior expansión de células mesenquimales del estroma y las células endoteliales que forman colonias sin el uso de suero animal para generar pares con fines de trasplante autólogo experimental.

Aislamiento y suero animal expansión libre de cordón umbilical humano derivado de células mesenquimales del estroma (MSC) y endoteliales formadoras de colonias Células Progenitoras (ECFCs)

La formación de colonias de células (CFC) de ensayo es un ensayo in vitro en progenitores hematopoyéticos que forman colonias en un medio semi-sólido. Una combinación de la morfología de la colonia, la morfología celular y citometría de flujo se utilizan para evaluar la capacidad de los progenitores para proliferar y diferenciarse a lo largo de los diferentes linajes hematopoyéticos.

La formación de colonias de células (CFC) para el ensayo de células hematopoyéticas humanas

Este protocolo permite la generación y caracterización fiables de células endoteliales de crecimiento sanguíneo (BOECs) a partir de un pequeño volumen de sangre periférica adulta. Las BOEC se pueden utilizar como sustituto de las células endoteliales de pacientes con trastornos vasculares y como sustrato para la generación de células madre pluripotentes inducidas.

Generación y Cultura de Sangre Consecuencia endoteliales Las células de la sangre periférica humana

células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) se derivan de las células endoteliales especializadas (hemogenic) durante el desarrollo, sin embargo, se sabe poco sobre el proceso por el cual algunas células endoteliales especifican a convertirse en la formación de la sangre. Demostramos un método basado en citometría de flujo permite el aislamiento simultáneo de las células endoteliales y hemogenic HSPC de tejidos embrionarios murinos.

Aislamiento de las células murinas embrionarias Hemogenic endoteliales

El objetivo de este protocolo es aislar las células progenitoras endoteliales de cordón umbilical. Algunas de las aplicaciones incluyen el uso de estas células como un biomarcador para identificar pacientes con riesgo cardiovascular, tratamiento de enfermedades isquémicas, y construye creando ingeniería de tejido vascular y del corazón la válvula.

Aislamiento de células endoteliales progenitoras de la sangre de cordón Umbilical humano

Aquí, presentamos un protocolo para formar con precisión endotelio hemogénico a partir de células madre pluripotentes humanas en una condición libre de alimentador y xeno. Este método tendrá amplias aplicaciones en el modelado de enfermedades y cribado de compuestos terapéuticos.

Diferenciación de endotelio hemogénico de células madre pluripotentes humanas en una condición definida libre de alimentador y xeno

Aquí, presentamos un protocolo para la caracterización inmunophenotípica y la diferenciación inducida por citoquinas de la sangre de cordón umbilical derivada CD34+ células madre hematopoyéticas y células progenitoras a los cuatro linajes mieloides. Las aplicaciones de este protocolo incluyen investigaciones sobre el efecto de mutaciones de la enfermedad mieloide o moléculas pequeñas en la diferenciación mieloide de las células CD34+.

Diferenciación panmieloide de la sangre de cordón humano derivada CD34+ Células hematopoyéticas del tallo y progenitor

El sistema de ensayo de angiogénesis esferoide cocultura tridimensional está diseñado para imitar la angiogénesis fisiológica. Los esferoides de cocultivo están formados por dos precursores de células vasculares humanas, EFCC y MSC, e incrustados en gel de colágeno. El nuevo sistema es eficaz para evaluar moduladores angiogénicos y proporciona información más relevante al estudio in vivo.

Sistema de ensayo de angiogénesis tridimensional utilizando esferoides de cocultura formados por células formadoras de colonias endoteliales y células madre mesenquimales

Aquí se presenta un protocolo simple para la diferenciación dirigida de células endoteliales hemogénicas de células madre pluripotentes humanas en aproximadamente 1 semana.

Diferenciación dirigida de células endoteliales hemogénicas de células madre pluripotentes humanas

The endothelium is a dynamic integrated structure that plays an important role in many physiological functions such as angiogenesis, hemostasis, ...

Caracterización de células endoteliales de crecimiento sanguíneo (BOEC) de sangre periférica porcina

Aprende a derivar células endoteliales formadoras de colonias (ECFC) de sangre de cordón umbilical humano. Este método permite caracterizar su potencial proliferativo clonal y capacidad de formación vascular in vivo.

Caracterización fenotípica y funcional de las células endoteliales Formadoras de Colonias derivados de la sangre del cordón umbilical (Video) | JoVE Journal

Caracterización fenotípica y funcional de las células endoteliales Formadoras de Colonias derivados de la sangre del cordón umbilical

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