Name: El chip Isotachophoresis para separación de iones y purificación de ácidos nucleicos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Aprende la técnica de isotacoforesis (ITP) para separación de iones y purificación de ácidos nucleicos en microfluidos. Este método electroquinético permite preconcentrar analitos y extraer ADN/ARN con alta sensibilidad.

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Agradecemos la financiación de DARPA patrocinado por Micro Focus / nano fluidos Fundamentos (MF3) Centro bajo el contrato número N66001-10-1-4003, y la concesión de DARPA N660001-09-C-2082.

1. Física de la PTI ITP constituye un límite claro entre el movimiento de iones de carga similar. La técnica se puede realizar con las muestras aniónicos o catiónicos, pero nosotros adaptamos esta introducción a ITP aniónico y tenga en cuenta los mismos principios se aplican a ITP catiónico. Elegimos tampones LE y TE de tal manera que los iones LE tienen magnitud mayor movilidad electroforética efectiva. La movilidad electroforética μ eficaz, = U / E, es la constante de proporcionalidad entre campo eléctrico aplicado, E, y velocidad de desplazamiento de iones, U. 13 Establecemos una interfaz difusa entre el LE y TE y aplicar un campo eléctrico dirigido desde el alta la conductividad LE zona en la zona de baja conductividad TE. El sistema establece rápidamente un fuerte gradiente en el campo eléctrico en la interfase PTI, debido al perfil de conductividad no uniforme. De acuerdo con su nombre (del griego &quot;isos&quot; significa &quot;igual&quot;, &quot;takhos&quot; significa &quot;velocidad&quot;), TE LE iones y los viajes en la misma ve, uniformelocity, como resultado del campo eléctrico no uniforme y la conservación de la corriente (esto es la denominada &quot;condición PTI&quot;, ver Figura 1). La interfaz de ITP se auto-afilado: LE iones que difunden en la experiencia TE zona de un fuerte flujo restaurar y volver a la zona principal (y viceversa para los iones de TE en la zona de LE). Los iones de ejemplo enfocar a esta interfaz si su movilidad eficaz en la zona de TE es mayor que las de los co-TE iones, y si su movilidad eficaz en la zona LE es menor que la de los LE co-iones (ver Figura 1). La auto-afilado y centrándose propiedades de ITP contribuir a la solidez de esta técnica y que ITP relativamente insensible a las perturbaciones de la interfaz (por ejemplo, debido a la presión impulsada por el flujo o cambios en la geometría, como contracciones, expansiones, y vueltas). En el modo de pico de ITP (ver Figura 2a y Videos 1-2), las concentraciones de iones de la muestra sonen todo momento, significativamente menor que las concentraciones de TE LE y de iones y por lo tanto contribuye de manera insignificante a la conductividad local. La distribución de los iones de la muestra se determina por el interfaz de autoafilado entre las zonas de vecinos (aquí el TE y LE) y el valor de la movilidad muestra efectiva en relación con estas zonas. 14 iones de la muestra Múltiples centrarse dentro de la misma zona estrecha interfaz ITP como en gran parte superposición de picos. Las anchuras de interfaz y pico, así como el factor de preconcentración asociado, escala inversamente con la corriente aplicada (ver experimentos en la Figura 2b). 14 Para concentraciones de la muestra lo suficientemente altas iniciales y el tiempo de la acumulación de suficientes iones de la muestra alcanza un valor umbral de concentración. Por totalmente ionizados especies, este valor está determinado por la función reguladora Kohlrausch (KRF). 15 Para electrolitos débiles, se determina por las funciones Alberty y Jovin 16,17. En mesetamodo, como se ilustra en la Figura 3 y Video 3, iones de la muestra separar y purificar en zonas de concentración localmente uniforme y constante en un orden determinado por su movilidad efectiva. Iones muy diluidas todavía puede centrarse en el modo de pico entre las zonas de la meseta. En ITP, iones de la muestra puede ser introducido en una inyección finito entre el TE y LE (ver Figura 3) o alternativamente mezclados con el TE y / o LE (ver Figura 2). Nos referimos a la mezcla en la zona de TE como &quot;semi-infinita&quot; inyección, que puede ser utilizado para acumular iones analito continuamente. Acumulación continua de la muestra aumenta la sensibilidad en ambos picos y los ensayos de la meseta de modo. Sin embargo, las inyecciones finitos son más comunes en el modo de meseta. Esto es probablemente debido a altas concentraciones de analito iniciales en semi-infinita de la inyección puede aumentar sustancialmente la conductividad TE y tasas más bajas de enfoque. Además, la purificación completa no es posible en semi-infinita inyección (ya que no remains de una concentración finita en TE). 2. Dispositivo de limpieza y preparación Para los ensayos se presentan en este protocolo se utiliza isótropa húmedo grabado al agua fuerte (más o menos la sección transversal en forma de D) los chips de microfluidos de vidrio con un diseño a través del canal (ver Figura 1). La limpieza y el protocolo siguiente preparación está optimizado para los canales de sílice borosilicato y fundida, pero también se puede utilizar con vidrio / PDMS fichas. Lleve a cabo este procedimiento de limpieza antes de los experimentos para asegurarse de ejecutar para ejecutar la repetibilidad y la correcta aplicación de los recubrimientos de dinámicas necesarias para suprimir el flujo de electroosmótico (EOF). La omisión de este protocolo puede resultar en dispersión sólida de la interfaz de ITP. 14 <ol><li> Para descontaminar el canal, llenar el Norte, Este, Sur y embalses con 10-20 l de lejía al 10% y aplicar vacío en el depósito del oeste durante 2 min. Si se utiliza un estándar de Caliper chip de caddie, de vacío puede aplicarse de manera efectiva con sólo attaching el extremo ancho de una l 200 (sin filtrar) punta de la pipeta al depósito chip y conectar la línea de vacío a un tubo de 2 mm de diámetro interior. </li><li> Vaciar los depósitos y enjuagar el canal (como en el paso 1) con hidróxido de sodio 1 M durante 2 min. Esta suavidad graba las paredes del canal, dando una superficie de borosilicato limpio para ayudar a establecer las propiedades de superficie uniforme. </li><li> Vaciar los depósitos y limpia, con agua desionizada (DI), luego enjuague el canal con LE para ~ 2 min. Durante este período las propiedades superficiales y revestimientos dinámicos equilibre dentro del canal. </li></ol> 3. Fluoróforo centrándose en el modo de pico de ITP <ol><li> Preparar 1 ml LE consistente en 100 mM de HCl, 200 mM Tris, y 1% de PVP. </li><li> Preparar 1 ml de TE que consta de HEPES 100 mM y 200 mM Tris. Combine 90 l de TE con 10 l de 1 micra Alexa Fluor 488 (AF488). </li><li> Después de aclarar con LE, como se describe en la Parte 2, vacíe el depósito del oeste y limpiar un par de veces con DI en oder para diluir cualquier LE restante en el depósito. Rellene este depósito con 20 l de TE que contiene AF488. </li><li> Colocar el electrodo positivo en el depósito Este y el suelo (negativo) de electrodos en el depósito Oeste y aplicar 2 mA (corriente constante). El pico de la muestra migrará a una velocidad constante desde el depósito al depósito Oeste Medio (ver Figura 1) y la tensión entre estos depósitos aumentará a medida que la menor conductividad TE llena el canal. </li></ol> 4. Extracción y purificación de ácidos nucleicos a partir de cultivo de E. E. La capacidad de enfocar de forma selectiva las especies iónicas hace ITP una técnica ideal para la preparación de muestras biológicas. Nos purificar ácidos nucleicos a partir de lisado de células no tratadas mediante la selección de un anión final con una magnitud menor movilidad eficaz que el ácido nucleico diana, pero mayor que la co-iónicos inhibidores de la PCR (por ejemplo, detergentes aniónicos, proteínas, y disolventes orgánicos, aunque esté presente en hila concentración de GH). Catiónico inhibidores de la PCR (por ejemplo, metales alcalinos y proteínas catiónicas y detergentes) migran en la dirección opuesta y así también se dejó atrás. ITP extrae y se concentra ácidos nucleicos diana desde el depósito de la muestra, dejando al mismo tiempo más lentas PCR inhibidoras especies detrás (ver Figura 4). <ol><li> Obtener una muestra de la cultura o E. células de E. a una densidad superior a 10 8 UFC / ml. </li><li> Transferir 1 ml de cultivo celular en un tubo de microcentrífuga seguro de bloqueo y el precipitado por centrifugación a 4000 g durante 6 minutos. </li><li> Vuelva a suspender el precipitado en 80 l RNasa libre de agua y se añaden 10 l de agente de lisis que consta de tricina 10 mM, 10 mM de Bis-Tris, 2 mM EDTA, 0,1% de Triton-X, y 5 mg / ml de lisozima. Mezclar suavemente e incubar durante 5 minutos. a temperatura ambiente (protocolo de lisis adaptado de Bercovici et al. 11). </li><li> Añadir 10 l de hidróxido sódico 1 M para elevar el pH lisado a ~ 12,5. Suavemente activar la pipeta hacia arriba y hacia abajo hasta quela solución se aclare, en la que el punto de lisis se ha completado. </li><li> Combinar 10 l de lisado con 90 l de tricina 50 mM y 100 mM Bis-Tris. Esta solución puede utilizarse ahora como el TE. </li><li> Preparar 1 ml de LE que consta de 500 mM Bis-Tris, 250 mM de HCl, 1% de PVP, y 1X SYBR Green II. Llene el chip de microfluidos con LE, como se describe en la Parte 3. </li><li> Con el fin de extraer el ácido nucleico purificado por fuera del chip análisis después de ITP, reemplazar el contenido del depósito Este con un LE-PCR compatible que contiene 50 mM Tris-bis, 25 mM de HCl, y 0,1% de PVP. Aplicar 1000 V entre el Este y el Oeste de los pozos comenzar el experimento. La corriente entre estos depósitos se reducirá. </li><li> Al final del experimento la muestra se eluye en el depósito de OI. Coincidiendo con esta elución, el tiempo frente al actual de este sistema por lo general alcanza un valor de meseta (ya que la resistencia está ahora dominada por los iones TE distribuidas uniformemente dentro del canal). Mezclar con cuidado el depósitocontenidos por parte de pipeteo repetido y extraer un volumen de 5 l para el análisis por RT-PCR cuantitativa. </li></ol> 5. La separación de los aminoácidos catiónicos con el modo de meseta de ITP y el trazador no de enfoque (OFN) para la visualización ITP se puede utilizar para separar y concentrar los iones pequeños en mesetas adyacentes y detectable entre el TE y LE. Esto permite la detección e identificación basados ​​en las propiedades fisicoquímicas, tales como la conductividad local, absorbancia UV, detección de la temperatura, o el índice de refracción. Aquí nos demuestran un no-centrado trazador (NFT) de ensayo donde se agrega un fluorescente, co-iónico especie a la LE. Esta especie fluorescente no se centra, pero su concentración se adapta a un campo eléctrico local, y permite así la visualización de las zonas de meseta purificados (ver Figura 5). <ol><li> Preparar 1 ml LE consta de etanolamina 100 mM, 200 mM de tricina, y 1% de PVP, y 100 mM de la 6G fluoróforo rodamina catiónico. </li> &lt;li&gt; Preparación 1 ml de TE que consta de 20 mM Tris, 40 mM de tricina. Preparar la muestra mediante la mezcla de 90 l de TE con 10 l cada uno de arginina 50 mM y 50 mM de lisina. </li><li> Distribuir 20 l LE en el Oeste y los embalses del Norte y la muestra en el embalse de Oriente. Aplicar un vacío en el embalse del Sur durante 1 min. </li><li> Enjuague bien con el Oriente DI y reemplazar con TE (TE sin muestra). </li><li> Aplicar 500 V entre el este y el oeste de los embalses. </li></ol> 6. Los resultados representativos Se demuestra isotachopherograms de experimentos modo de pico en la Figura 2b y experimentos de extracción de ácidos nucleicos en la Figura 4. En los experimentos de modo pico con un reportero fluorescente (por ejemplo AF488, SYBR Green II), la intensidad de fluorescencia en general se pueden integrar y se compara con una curva de calibración para obtener información de la concentración cuantitativa. 12 Adicionalmente, en experimentos de ácidos nucleicos de extracción, la muestra se deja eluir en tél LE depósito y se extrae con una pipeta para el análisis cuantitativo por RT-PCR. 10,12 Mostramos isotachopherograms meseta modo para la separación de aminoácidos en la Figura 5. La intensidad de fluorescencia (en relación con la intensidad de TE LE o zona) se puede utilizar para la identificación de zona, mientras que las anchuras de zona permitir la cuantificación. <img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3890/3890fig1.jpg" /> Figura 1. Isotachophoresis (PTI) es una técnica electrocinético utilizado en aplicaciones de microfluidos para la detección sensible y separación de iones. ITP ofrece la separación, enfoque selectivo, y la capacidad de preconcentración. Además, es extremadamente robusta e insensible a las perturbaciones físicas debido a su naturaleza auto-afilado. Iones de la muestra selectiva se centran entre un electrolito principal (LE) y final (TE) y viajan a través del microcanal a una velocidad constante determinada por la velocidad de los iones principales en la zona de LE. Iones de la muestraconcentrarse si su movilidad electroforética efectiva se encuentra entre corchetes por la movilidad efectiva de los iones de LE y TE. El esquema representa un experimento modelo de ITP en donde la muestra se centra de forma continua entre el LE y zonas de TE. <img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/3890/3890fig2.jpg" /> Figura 2. Diluir la muestra se centran iones en modo &quot;pico&quot; de la PTI. a) Dos distinta diluido (c muestra &lt;&lt; c LE) se centran en el modo de pico de las especies en la interfase formada entre el LE y zonas de TE. Únicamente la LE y TE determinar el campo eléctrico, como las especies de la muestra no contribuyen significativamente a la actual. Los iones de ejemplo son mezclados con TE (en una inyección semi-infinita) y centrarse juntos en un pico de aproximadamente gaussiana en la interfase de ITP. Centrándose criterio (que se muestra como desigualdades) se aplica a las especies fuertemente ionizados. b) Los experimentos muestran Alexa Fluor 488 (AF488) se centró en el modo de alta para una amplia gama de corrientes aplicadas (véase también Video 1). Ejemplo de ancho pico es inversamente proporcional a la corriente (por dispersión insignificante advectivo debido al flujo electroosmótico). 14 La interfaz de autoafilado es resistente a la dispersión debido a la presión impulsada por flujo (ver Video 2). <img alt="Figura 3." src="/files/ftp_upload/3890/3890fig3.jpg" /> Figura 3. Iones de la muestra en un foco de concentración lo suficientemente alta en el modo &quot;meseta&quot; y gobiernan la conductividad local. Por lo general introducen iones de la muestra en una inyección finita entre el TE y LE. En esta modalidad, los iones de la muestra por separado y el orden de acuerdo a su movilidad electroforética efectiva (ver video 3). Para las especies fuertemente ionizados, el TE y concentraciones de meseta de la zona están determinadas por la función reguladora de Kohlrausch (KRF, un conjunto invariante inicialmente por la zona LE). Diluir los iones de seguir centrándose en el modo de pico entre la meseta entre paréntesis de sus zonas de movilidad efectiva. Centrándose criterion (se muestra como la desigualdad) se aplica a las especies fuertemente ionizados. <img alt="Figura 4." src="/files/ftp_upload/3890/3890fig4.jpg" /> Figura 4. Lisado preparación y extracción de ácidos nucleicos con PTI modo de pico. El ácido nucleico se extrae de E. E. cultivo celular utilizando lisozima asistido por lisis alcalina y se purificó mediante electroforesis selectivo centrado a través de ITP. TE mezclado con lisado (marrón) contiene ácido nucleico diana (verde), proteínas, y los potenciales químicos que inhiben la PCR. La selección apropiada de arrastre y que conduce iones permite selectiva de enfoque de ácido nucleico diana, dejando detrás de inhibidores de la PCR. Total de ácidos nucleicos pico de ITP a menudo adquiere una forma no ideal, como se muestra aquí en la imagen insertada. Como una demostración de este ensayo, se extrajeron ácido nucleico total de bacterias gram-negativas, Escherichia coli (lisadas con una solución de hidróxido de sodio solo), NA purificada de lisado con PTI, recogidosel. se extrae material genético, y se realizó QRT-PCR para verificar la purificación exitosa de ARNr 16S (rojo) y del ADNr (verde) 16S de cultivo bacteriano Ciclos negativos del umbral de control para ARNr 16S (azul) y 16S rDNA (amarillo) fueron cada uno por encima de 30 ciclos. Se realizó QRT-PCR utilizando SYBR Green Power ARN a C T 1-Step Kit de Applied Biosystems con 150 nM adelante (5&#39;-CGGATTGGAGTCTGCAACTCG) y atrás primers (5&#39;-CACAAAGTGGTAAG CGCCCTC), en los ciclos térmicos condiciones recomendadas. <img alt="Figura 5." src="/files/ftp_upload/3890/3890fig5.jpg" /> Figura 5. No centrándose trazador (NFT) de ensayo para la separación y la detección de aminoácidos no marcados. a) Esquema del ensayo NFT. Una inyección finito de iones de la muestra se introduce en el canal de Oriente. Mezclamos la LE con un fluoróforo marcador catiónico con menor movilidad eficaz que los iones de TE (trazador μ &lt;μ TE). El fluoróforose dice que actúa como un &quot;marcador underspeeding&quot;. A medida que el fluoróforo electromigrates de la LE en zonas ahora ocupadas por mesetas muestra y TE, experimenta un campo eléctrico más elevado y, por tanto su concentración aumenta. Este cambio en la concentración crea pasos en el isotachopherogram. b) Separación de dos aminoácidos, arginina y lisina, utilizando el ensayo de NFT con Rodamina 6G como el trazador underspeeding fluorescente. El pico ligero entre el TE y arginina es común en ITP, no se entiende bien, y aquí no interfiere con la detección o cuantificación de las mesetas. Película de consulta 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3890/3890movie1.mpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la película suplementario</a> . Película de consulta 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3890/3890movie2.mpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la película suplementario</a> . Película de consulta 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3890/3890movie3.mpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la película suplementario</a> .

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</ol>

No tenemos nada que revelar.

Los métodos que aquí se presenta PTI permitir la detección rápida, sensible y robusto y la manipulación de moléculas iónicas. El principal desafío en el uso de la PTI es la elección adecuada de los buffers LE y TE. En PTI aniónico, típicamente cloruro de elegir como el anión principal, ya que es un ácido fuerte con movilidad absoluta muy alta y por lo tanto tiene propiedades muy predecibles. Por lo tanto, la elección de buffer en aniónico PTI se reduce típicamente a la elección de un adecuado TE y contraión. Para los experimentos se centran selectiva, la elección de TE es fundamental para la exclusión de la contaminación de los iones. En aplicaciones en las que los contaminantes no están presentes, menor movilidad TE eficaz conduce a una mayor velocidad de enfoque. Se recomienda utilizar la siguiente, relativamente bien educados iones aniónicos TE: MES, MOPS, HEPES, tricine. Elección del contraión afecta tanto el pH del sistema y la movilidad TE eficaz. Contraiones comunes son tris (pKa 8,1) y bis-tris (pKa 6,4). Para los ensayos que requieren un pH menor o mayor, se recomienda piridina (pK 5,25) yetanolamina (pKa 9,5), respectivamente. En las Tablas 1 y 2, para la PTI aniónicos y catiónicos, respectivamente, se resumen algunos ejemplos de amortiguamiento útiles. Tomamos como el HCl aniónicos de iones de sodio LE y como el ión catiónico LE, y asumirá el 100 mM de la fuerza iónica del tampón LE. El lector observará que la fuerza iónica tampón en nuestros protocolos (y en las Tablas 1-2) es siempre mayor que o igual a 10 mM. Aunque en teoría la física de PTI se aplica a la fuerza iónica menor que 10 mM, contaminantes naturales (por ejemplo ácido carbónico de la reacción entre el agua y el dióxido de carbono atmosférico) cerca del nivel de 1 mM a menudo limitan el uso práctico de bajos tampones de fuerza iónica. Observamos que mecanismo de transducción de señales no se limita a los ensayos presentados en este protocolo. Como se mencionó brevemente en la parte 5, en el modo de meseta purificada zonas pueden ser detectados a través de cambios en la conductividad local, absorbencia UVBance, la temperatura, o el índice de refracción. En nuestro propio grupo, hemos desarrollado un método que utiliza anfolitos fluorescentes portadoras para la detección sensible e identificación de analitos desconocidos. 5 En los experimentos de modo de pico, sondas específicas se puede utilizar para etiquetar analitos centrados. En un ejemplo, podemos utilizar balizas moleculares-sondas de oligonucleótidos que presentan fluorescencia a la hibridación de la secuencia de destino - para detectar el ADN de destino o de moléculas de ARN con una alta especificidad 11,18. Mientras que ITP es relativamente robusto a la dispersión causada por la presión impulsada por el flujo y EOF, EOF excesiva puede conducir al estancamiento de la interfaz de ITP, donde la velocidad media EOF se hace igual a la velocidad de ITP. 14 EOF fuerte Tal ocurre especialmente en condiciones de pH alto y baja fuerza iónica. Por esta razón, se recomienda el uso de tampones con pH de 8 o inferior y con la fuerza iónica del orden de 100 mm en caso conveniente. En nuestra experiencia, es el PVPmás eficaz para la supresión de revestimiento EOF en chips de borosilicato. Sin embargo, debido a sus propiedades de tamizado, PVP puede no ser apropiado para algunas aplicaciones, tales como el enfoque de ADN genómico. En los experimentos, se observa que la adición de PVP puede reducir enormemente la movilidad del ADN genómico total (hasta el punto en que no se centra). En estos casos un revestimiento de silanol tal como Sigmacote en conjunción con un agente tensioactivo (por ejemplo, Triton X-100) también pueden ser eficaces en la reducción de EOF. 10 <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> TE anión (pKa -1) </td></tr><tr><td> Contraión de almacenamiento en búfer (pKa +1) </td><td> MES (6,10) </td><td> MOPS (7,20) </td><td> HEPES (7,50) </td><td> tricina (8.15) </td></tr><tr><td> etanolamina (9.50) </td><td> 21,41 </td><td> 20,40 </td><td> 17,38 </td><td> 22,85 </td></tr><tr><td> tris (8,08) </td><td> 21,00 </td><td> 19,23 &lt;/ Td&gt; <td> 15,84 </td><td> 17,56 </td></tr><tr><td> bis-tris (6,40) </td><td> 18,22 </td><td> 10,41 </td><td> 7,30 </td><td> 5,23 </td></tr><tr><td> piridina (5,18) </td><td> 1,01 </td><td> 3,72 </td><td> 2,42 </td><td> 1,48 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Magnitud de la movilidad efectiva (× 10 -9 m 2 / V / s) de la zona ajustada analito puro en ITP aniónico donde la LE es de 100 mM de HCl y 200 mM de tampón contraión. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> TE catión (pKa +1) </td></tr><tr><td> Contraión de almacenamiento en búfer (pKa -1) </td><td> etanolamina (9.50) </td><td> tris (8,08) </td><td> bis-tris (6,40) </td><td> piridina (5,18) </td></tr><tr><td> MES (6,10) </td><td> 35,57 </td><td> 21,96 </td><td> 16,39 </td><td> 10,45 </td></tr><tr><td> MOPS (7,20) </td><td> 35,47 </td><td> 20,92 </td><td> 9,76 </td><td> 3,93 </td></tr><tr><td> HEPES (7,50) </td><td> 35,35 </td><td> 19,97 </td><td> 7,77 </td><td> 2,88 </td></tr><tr><td> Tricina (8.15) </td><td> 34,77 </td><td> 16,72 </td><td> 4,50 </td><td> 1,44 </td></tr></tbody></table> Tabla 2. La magnitud de movilidad efectiva (× 10 -9 m 2 / V / s) de la zona ajustada analito puro en ITP catiónico donde la LE es de 100 mM de sodio y 200 mM de tampón contraión.

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> REACTIVOS </td></tr><tr><td> Nombre </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Agua destilada </td><td> GIBCO </td><td> 10977 </td><td> RNasa / DNasa libre </td></tr><tr><td> Clorox Ultra </td><td> Clorox </td><td> 02489CT </td><td></td></tr><tr><td> de hidróxido sódico (NaOH) </td><td> Mallinckrodt </td><td> 7708 </td><td></td></tr><tr><td> ácido clorhídrico (HCl) </td><td> Merck Chemicals </td><td> HX0603-4 </td><td></td></tr><tr><td> Trizma base (tris) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T6066 </td><td></td></tr><tr><td> polivinilpirrolidona (PVP) </td><td> Polysciences Inc. </td><td> 06067 </td><td> 1.000.000 MW </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H-4034 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 de ácido carboxílico </td><td> Invitrogen </td><td> A20000 </td><td></td></tr><tr><td> tricina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T-9784 </td><td></td></tr><tr><td> bis-tris </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B4429 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> GIBCO </td><td> AM9260G </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> X100 </td><td></td></tr><tr><td> lisozima </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L6876 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR Green II </td><td> Invitrogen </td><td> S7564 </td><td></td></tr><tr><td> etanolamina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 411000 </td><td></td></tr><tr><td> Rodamina 6G </td><td> Acros Organics (Geel, Bélgica) </td><td> CAS 989-38-8 </td><td></td></tr><tr><td> L-aminoácidos </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> LAA21 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR Green Power ARN a C T 1-Step Kit </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4389986 </td><td></td></tr><tr> &lt;td&gt; cebadores de PCR </td><td> Integrado de Tecnologías de ADN </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> EQUIPO </td></tr><tr><td> Nombre </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Borosilicato chip de microfluidos </td><td> Caliper Life Sciences Inc. </td><td> NS12A </td><td> Se suministra con o sin plástico caddy </td></tr><tr><td> Bomba de vacío </td><td> Gast </td><td> DOA-P104-AA </td><td></td></tr><tr><td> SourceMeter </td><td> Keithley </td><td> 2410 </td><td> Constantes los modos de intensidad y tensión constante de operación </td></tr><tr><td> Microscopio de epifluorescencia invertido </td><td> Olimpo </td><td> IX70 </td><td> Utilice lámparas de mercurio (Olympus) o LED (Thorlabs) para la iluminación </td></tr><tr><td> Cubo de filtro </td><td> Omega </td><td> XF115-2 </td><td> La excitación / emisión: azul / verde </td></tr><tr><td> SeguroA bloquear los tubos de microcentrífuga </td><td> Eppendorf </td><td> 022363204 </td><td> 1,5 ml de capacidad </td></tr><tr><td> Centrifugar </td><td> Eppendorf </td><td> 5417C </td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 3. Reactivos específicos y equipos.

el chip isotachophoresis para separación de iones y purificación de ácidos nucleicos

On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids

Las técnicas electrocinéticas son un elemento básico de las aplicaciones a microescala, debido a su capacidad única para llevar a cabo una variedad de procesos de fluidos y la electroforesis en sistemas simples y compactas que no tienen partes móviles. Isotachophoresis (PTI) es una técnica simple y robusto electrocinético muy que puede alcanzar 1,2 millones de veces preconcentración y eficiente separación y extracción basado en la movilidad iónica. 3 Por ejemplo, hemos demostrado la aplicación de ITP a la separación y la detección sensible de etiqueta moléculas iónicas (por ejemplo, toxinas, ADN, rRNA, miRNA) con poca o ninguna muestra de la preparación y 4-8 a la extracción y purificación de ácidos nucleicos a partir de matrices complejas, incluyendo el cultivo de células, la orina y la sangre. 9-12 ITP logra centrado y separación utilizando un campo eléctrico aplicado y tampones dos dentro de un sistema de canales fluidos. Para los analitos aniónicos, el principal electrolito (LE) de amortiguación se elige sUCH que sus aniones tienen una mayor movilidad electroforética efectiva de los aniones del electrolito final (TE) tampón (movilidad efectiva describe la velocidad de desplazamiento observable de un ion y tiene en cuenta el estado de ionización del ion, tal como se describe en detalle por Persat et al . 13). Después de establecer una interfaz entre el TE y LE, un campo eléctrico se aplica de tal manera que los iones LE alejarse de la región ocupada por los iones de TE. Iones de la muestra de raza intermedia movilidad efectiva por delante de los iones de TE, pero no puede superar a los iones de LE, y por eso se concentran en la interfaz LE-TE (en adelante denominado el &quot;puerto ITP&quot;). Además, el TE y regiones LE forma de conductividad baja y alta, respectivamente, que establecen un fuerte gradiente de campo eléctrico en la interfaz de ITP. Este gradiente de campo preconcentrados especies de la muestra ya que se centran. La elección adecuada de TE y LE resultados en concentración y purificación de las especies objetivo de otras organizaciones no centradas en las especies y, eventualmente, la separación de und segregación de las especies de la muestra. Estamos aquí, revisar el ITP principios físicos subyacentes y discutir dos modos estándar de operación: &quot;pico&quot; y los modos de «meseta». En el modo de pico, relativamente diluida iones de la muestra se centran juntos dentro de superposición de picos estrechos en la interfaz de ITP. En el modo de meseta, iones de la muestra más abundantes alcanzar una concentración en estado estacionario y se segregan en adyacentes como zonas de meseta, ordenados por su movilidad efectiva. Modos de pico y la meseta se derivan de la física subyacente mismos, sino que representan diferentes regímenes diferenciados por la concentración del analito inicial y / o la cantidad de tiempo asignado para la acumulación de la muestra. En primer lugar, describir en detalle un pico modelo experimento modo y, a continuación demuestran un ensayo modo de pico para la extracción de ácidos nucleicos a partir de E. E. cultivo celular. Llegamos a la conclusión mediante la presentación de un ensayo de modo de meseta, donde se utiliza un trazador no se centran (OFN) las especies de visualizar la separación y porformar cuantificación de los aminoácidos.

Isotachophoresis (ITP) es una separación sólida electrocinético y técnica de preconcentración con aplicaciones que van desde la detección de la toxina a la preparación de la muestra. Se revisan los principios físicos de la PTI y la metodología de aplicación de esta técnica a dos ejemplos de aplicaciones específicas: la separación y detección de moléculas pequeñas y purificación de ácidos nucleicos a partir de lisado de cultivo celular.

El chip Isotachophoresis para separación de iones y purificación de ácidos nucleicos

Las técnicas electrocinéticas son fundamentales en las aplicaciones a microescala debido a su capacidad única para realizar una variedad de procesos fluídicos y electroforéticos...

El objetivo general de este video es presentar una técnica electrocinética denominada isotaféresis, abreviada como ITP, y sus aplicaciones microfluídicas para la detección y separación sensibles de iones. En primer lugar, se discuten los principios físicos subyacentes a la ITP, además de los dos modos estándar de operación, conocidos como modo pico y modo plateau. A continuación, se demuestra la ITP en chip mediante tres experimentos, comenzando con un protocolo sencillo para la preconcentración de muestras, en el cual se detectan fluoróforos al enfocarlos en un pico definido. En segundo lugar, se muestra un ensayo de ITP utilizado para la preparación de muestras en chip, en el que se extraen selectivamente ADN y ARN de lisado celular bacteriano.Finalmente, se utiliza un ensayo de detección sin marcador para purificar y cuantificar aminoácidos mediante la ITP en modo de meseta. En última instancia, la purificación de aminoácidos, la preconcentración de analitos y la extracción selectiva de ácidos nucleicos pueden lograrse mediante la ITP. Hoy les presentaremos la física subyacente y la metodología de una versátil técnica electrocinética denominada Isot Apheresis.Nuestro grupo ha sido pionero en métodos de TPI para la detección sin marcado, la preparación de muestras y ensayos de hibridación rápida. Compartiremos con ustedes tres ensayos representativos que demuestran la capacidad de la TPI para preconcentrar analitos, extraer ácidos lisóticos y purificar y detectar aminoácidos. Estos ensayos resaltan la versatilidad de la TPI y muestran los pasos sencillos necesarios para garantizar experimentos repetibles.En el laboratorio, los iones de la muestra se enfocan selectivamente en la interfaz entre un electrolito líder y uno de cola, abreviados respectivamente como LE y TE. Los iones de la muestra viajan a través del microcanal a una velocidad constante determinada por la velocidad de los iones líderes.Los iones de la muestra se enfocan si su movilidad electroforética efectiva está comprendida entre la movilidad de los iones de LE y TE, donde la movilidad se define como la relación entre la velocidad de arrastre del ion y el campo eléctrico local. Los iones de la muestra mezclados en el TE se desplazan más rápido que los iones de TE circundantes y, por lo tanto, se acumulan en la interfase LETE. Además, la interfase de ITP se autoafila: los iones LE, que podrían difundirse hacia la zona de TE, experimentan un fuerte flujo de restablecimiento y regresan a la zona líder. Lo mismo ocurre con los iones TE en la zona LE.Las propiedades de autoafilado y enfoque automático de I two P contribuyen a la robustez de esta técnica y la hacen insensible a perturbaciones en la interfaz, como el flujo impulsado por presión. En el modo de pico, las concentraciones de iones de muestra son significativamente más bajas que las de los iones LE y TE. Por lo tanto, los iones de muestra contribuyen de manera despreciable a la conductividad local bajo estas condiciones.Varios analitos se enfocan dentro de la región de la interfaz de ITP, principalmente con picos superpuestos. Eventualmente, los iones de la muestra pueden alcanzar una concentración suficientemente alta como para separarse y enfocarse en modo de meseta. En el modo de meseta, los iones de la muestra se separan y purifican en zonas de concentración localmente uniforme y constante, en un orden determinado por su movilidad electroforética.Los iones en modo plateau determinan la conductividad local. Los iones muy diluidos aún pueden enfocarse en modo pico entre zonas plateau. Para los ensayos presentados en este protocolo, se utiliza un chip microfluídico de vidrio grabado isotrópicamente con una geometría de canal en cruz.Sin embargo, la CIT también puede realizarse en canales o capilares rectos simples sin intersecciones ni uniones. El siguiente procedimiento de limpieza debe realizarse antes de los experimentos para garantizar la repetibilidad entre corridas y la aplicación exitosa de recubrimientos dinámicos utilizados para suprimir el flujo electroosmótico. Para descontaminar el canal, llene los depósitos norte, este y sur con 10 a 20 microlitros de solución de lejía al 10 %.Si se utiliza un porta-chips estándar con calibrador, fije el extremo ancho de una punta de pipeta de 200 microlitros al reservorio oeste del chip y conecte la línea de vacío a un tubo con un diámetro interno de dos milímetros. Aplique vacío durante dos minutos, luego vacíe los reservorios y límpielos cuidadosamente llenándolos con agua desionizada y vaciándolos nuevamente mediante la línea de vacío. Realice varias veces el lavado con agua desionizada.Repita este proceso con hidróxido de sodio un molar. Las superficies del canal se volverán ligeramente grabadas, obteniendo una superficie limpia de borosilicato que ayudará a establecer propiedades superficiales uniformes. Limpie los depósitos con agua desionizada y luego enjuague los canales con le.Durante este período, las propiedades superficiales y los recubrimientos dinámicos alcanzarán el equilibrio dentro de los canales. Para comenzar el experimento, prepare un mililitro de electrolito líder y un mililitro de electrolito de cola. Luego combine 90 microlitros de TE con 10 microlitros de un micromolar.Alexa Fluor 488. Después de enjuagar con LE, vacíe el depósito oeste y enjuague el depósito varias veces con agua desionizada para diluir fuertemente cualquier LE restante en el depósito. Finalmente, llene este depósito con 20 microlitros de TE que contenga el colorante.Coloque el electrodo positivo en el depósito este y el electrodo de tierra o negativo en el depósito oeste, y aplique dos microamperios de corriente constante. El pico de la muestra migrará a una velocidad constante y el voltaje entre los depósitos aumentará a medida que se llene con el tampón TE de menor conductividad. Los ácidos nucleicos del lisado celular no tratado pueden purificarse mediante ITP seleccionando un anión rezagado con una magnitud de movilidad electroforética menor que la del ácido nucleico diana, pero mayor que la de los inhibidores iónicos de la PCR.Los inhibidores de la PCR migran en dirección opuesta y por lo tanto también quedan atrás. Para comenzar la resuspensión, suspenda el pellet de células de E. coli que contiene 10 a la octava unidades formadoras de colonias en 80 microlitros de agua libre de RNAsas y agregue 10 microlitros de agente de lisis, mezcle suavemente e incube durante cinco minutos a temperatura ambiente. Tras la incubación, agregue 10 microlitros de hidróxido de sodio 1 M para elevar el pH del lisado a aproximadamente 12,5. Agite suavemente la pipeta hacia arriba y hacia abajo hasta que la solución se vuelva clara, momento en el cual la lisis estará completa.A continuación, agregue 10 microlitros de lisado a 90 microlitros de Racine 50 milimolar y bis triss 100 milimolar. Esta solución ya puede utilizarse como el te; también prepare un mililitro de LE que contenga el colorante cyber green según se describe en el protocolo escrito, y use el LE para llenar el chip microfluídico como se demostró anteriormente. Después del lavado, reemplace el contenido del depósito este con un compatible con PCR.Enjuague el depósito oeste con agua desionizada y llénelo con 20 microlitros de te. Aplique 1000 voltios entre los depósitos este y oeste para comenzar el experimento. La corriente entre estos depósitos disminuirá al final del experimento.La muestra eluye hacia el reservorio de LA coincidiendo con esta solución. La corriente frente al tiempo para el sistema generalmente alcanza un valor de meseta. Mezcle suavemente el contenido del reservorio accionando la pipeta hacia arriba y hacia abajo varias veces.Luego extraiga el volumen de cinco microlitros para su análisis mediante PCR cuantitativa. La R-T-P-C-R-I-T-P también puede utilizarse para separar y concentrar iones pequeños en mesetas adyacentes y detectables entre el TE y el LE, lo que permite la detección basada en las propiedades fisicoquímicas demostradas. A continuación se muestra un ensayo con un trazador no concentrador en el que se añade una especie iónica fluorescente al LE.La especie fluorescente no se enfoca, pero su concentración se adapta a un campo eléctrico local y permite así la visualización de zonas de meseta purificadas. Comience preparando un mililitro de electrolito líder que contenga el catiónico Fluor cuatro rod Domine seis G y un mililitro de electrolito de cola. Luego combine 90 microlitros de TE con 10 microlitros, cada uno de arginina 50 milimolar y lisina 50 milimolar, para cargar la muestra mediante inyección finita.Dispense 20 microlitros de Ellie en los reservorios oeste y norte; dispense la muestra de aminoácido en el reservorio este. A continuación, aplique vacío en el reservorio sur durante un minuto. Después de enjuagar el reservorio este con agua DI, reemplace el contenido con te.Como paso final, aplique 500 voltios entre los depósitos este y oeste en experimentos en modo pico con el marcador fluorescente Alexa Fluor 4 88. La intensidad de fluorescencia total puede integrarse y compararse con una curva de calibración para obtener concentraciones cuantitativas. La información mostrada aquí corresponde a experimentos realizados con una variedad de corrientes aplicadas que revelan esa muestra.El ancho del pico es inversamente proporcional a la corriente. Este es un ejemplo de extracción de ácidos nucleicos a partir de lisado celular completo mediante ITP en modo de pico. El pico total de ácidos nucleicos en ITP a menudo presenta una forma no ideal.En experimentos de extracción de ácidos nucleicos, se permite que la muestra eluya en el depósito LE y se extrae con una pipeta para su análisis mediante resultados de R-T-P-C-R cuantitativo de transcripción inversa. La PCR verificó la purificación exitosa de ARN ribosomal 16 s y ADN ribosomal 16 s a partir de cultivos bacterianos; los ciclos umbral del control negativo para ARN ribosomal 16 s y ADN ribosomal 16 s fueron cada uno superiores a 30 ciclos, tal como se esperaba. Se realizó el modo de meseta de ITP para dos aminoácidos, arginina y lisina, utilizando el ensayo NFT con RUMINE seis G como trazador fluorescente subyacente.Aquí, la intensidad de fluorescencia relativa a la zona LE o TE puede utilizarse para la identificación de zonas, mientras que los anchos de zona permiten la cuantificación. Después de ver este video, debería tener una comprensión física clara de la ITP y de la metodología detrás de tres ensayos distintos basados en ITP. En particular, hemos mostrado cómo utilizar la ITP para purificar aminoácidos, preconcentrar analitos y extraer selectivamente ácidos nucleicos.No olvide que trabajar con alto voltaje podría ser extremadamente peligroso. Siempre debe tomar precauciones, como utilizar equipo que limite la corriente y mantener una distancia suficiente de los electrodos.

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