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Sexual Development and Ascospore Discharge in Fusarium graminearum

Desarrollo Sexual y descarga en las ascosporas Fusarium graminearum

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08:20 min

March 29, 2012

DOI: 10.3791/3895-v

Brad Cavinder¹, Usha Sikhakolli², Kayla M. Fellows³, Frances Trail^2,4

¹Genetics Program,Michigan State University, ²Department of Plant Biology,Michigan State University, ³Human Biology Program,Michigan State University, ⁴Department of Plant Pathology,Michigan State University

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Summary

Cruces sexuales y el aislamiento de la progenie recombinante son importantes herramientas de investigación para el hongo filamentoso,

Transcript

El objetivo general de este procedimiento es aprender a generar y manipular el desarrollo de la parátesis y solicitar la descarga de APO en el cultivo. Esto se logra primero induciendo y cultivando activamente la cultura para iniciar el desarrollo sexual. El segundo paso es analizar la descarga de esporas activas, luego se genera la parestesia recombinante.

El paso final es evaluar la progenie en busca de fenotipos que indiquen si se produjo o no una recombinación. En última instancia, los resultados se pueden utilizar para detectar mutantes en el desarrollo sexual o para generar múltiples mutaciones dentro de una cepa. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos son difíciles de describir y, aunque son simples, deben realizarse con precisión para obtener una descarga óptima de esporas y una producción constante de parátesis.

Comience por inocular en el centro la barrena de zanahoria en una placa de Petri de seis centímetros con una cepa fértil de gramina. Arum incuba las placas inoculadas bajo un comercial de estándar brillante. Utilice iluminación fluorescente a temperatura ambiente.

Deje que los hongos crezcan durante tres a cinco días hasta que el micelio haya alcanzado el borde exterior del plato. En el capó. Raspe suavemente la superficie del cultivo con el palillo estéril para eliminar los micelios aéreos.

A continuación, aplique un mililitro de surfactante a la barrena y frote la superficie con el extremo doblado o bulboso de una varilla de vidrio estéril. Sin aplicar perfil. Vuelva a colocar los platos debajo de las luces.

Después de 24 horas, la superficie de las placas debe tener una apariencia brillante. Si los micelios vuelven a aparecer, raspar, salir a la superficie, volver a aplicar la solución tween 60 y bañarlos con luz durante 24 horas más. Ahora observe el desarrollo de la parátesis durante una semana.

Las parátesis jóvenes son visibles como granos negros en la superficie de la barrena. En comparación con la parátesis madura. Casi no debe haber micelios superficiales.

Para el día siete, las esporas maduras se acumulan en la tapa del plato, y para el día nueve, las esporas son tan densas que son visibles sin aumento. Para cosechar la etapa intermedia, la parátesis raspa suavemente la superficie de la barrena con un bisturí y transfiere la parátesis a un tubo criogénico. A continuación, el tubo se puede congelar rápidamente para la extracción de ARN seis días después de aplicar el surfactante.

Corta un círculo de un centímetro de diámetro de la barrena con una barrena de madera, un bóer o un bisturí. Corta el círculo por la mitad y monta las mitades en un portaobjetos de microscopio de vidrio, orienta las piezas de modo que la superficie que contiene los cuerpos fructíferos sea perpendicular a la superficie del portaobjetos, y las esporas se disparan a lo largo del portaobjetos. En este momento, si se desea un inhibidor de esporas acrobático, aplíquelo en la parte posterior del bloque de barrena.

Esta técnica se puede utilizar para detectar productos químicos en busca de inhibidores de descarga y para detectar mutantes genéticos en busca de pérdida de la capacidad de disparar esporas, hemos hecho ambas cosas con éxito. Ahora, incube el portaobjetos durante la noche en una simple cámara humidificada iluminada a temperatura ambiente. A medida que los cuerpos fructíferos erupcionan, las esporas se acumulan en el tobogán y serán visibles allí por la mañana.

Las esporas acumuladas ahora se pueden lavar del portaobjetos, recoger en un plato limpio y cuantificar. Comience por establecer un cruce genético entre dos cepas de arum de gramina inocularlas en lados opuestos de una placa de Petri con barrena de zanahoria. Como se describió anteriormente, cultive los hongos hasta que los hilos hayan llenado la superficie.

Raspe las partes aéreas y aplique la solución T between 60. En este escenario, marque la placa donde se unen los guiones. Regrese los cultivos a la luz e incubelos durante unos siete días cuando la parátesis se haya desarrollado y Siri comience a formarse a partir de la parátesis a lo largo de la intersección entre los cultivos.

Esta técnica se puede utilizar para combinar múltiples mutaciones en una cepa. También vale la pena señalar que se pueden seleccionar tanto el punto más como el punto menos, lo que lo convierte en un marcador seleccionable muy útil. Bajo el microscopio de disección, puede ver la parátesis a lo largo de la intersección de las dos culturas.

A continuación, busca el ojo para dorar. Ahora sumerja un alfiler de insecto esterilizado en agua estéril y toque el alfiler con un seroso formado en el borde entre los cultivos. Los SRI deben adherirse a la humedad del alfiler.

A continuación, enjuague la punta del pin con 200 microlitros de agua estéril contenida en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Enciende el alfiler, humedécelo de nuevo y elige otro sru. Elige entre tres y cinco Siri y transfiérelos todos a su propio tubo.

Ahora brevemente vórtice. Cada tubo contiene Siri suspendido para cada tubo. Extienda 60 microlitros de suspensión de esporas en una placa de Petri de nueve milímetros.

Con el medio MMTS, incube las placas a temperatura ambiente con o sin luces, y almacene la suspensión de esporas restante a cuatro grados centígrados durante un máximo de una semana. Después de tres a cinco días, aparecen colonias muy pequeñas en el plato. Un fenotipo se puede marcar bajo un microscopio.

Las colonias de punto negativo tendrán un espacio más escaso que las colonias de punto positivo. Deseche aquellas placas con solo uno de los fenotipos. Los Siri de la parestesia recombinante tienen ambos fenotipos de colonia en aproximadamente la misma proporción.

Guarde estos platos. A veces, otros fenotipos resultan debido a la segregación de otros factores, como las colonias, que son intermedias entre el tejido positivo y el tejido negativo para fines de almacenamiento, transfieren las colonias de las placas recombinantes a una placa de barrena de zanahoria o V ocho para continuar el estudio examinando otros fenotipos de placa de las colonias en el sinfín del muelle Chap X y en placas con PDA que contienen clorato. Las parátesis se convirtieron en un césped de terciopelo negro sin micelios ni esporas.

24 horas después de la aplicación de Tween, la superficie de la barrena tenía un ligero brillo. Si el micelio hubiera reaparecido, es posible que la placa no se haya raspado lo suficiente como para inducir el desarrollo de la parátesis. Se instalaron varios bloques de barrena con cuerpos fructíferos de una cepa de tipo silvestre para disparar sus esporas en portaobjetos de vidrio para observar.

Se preparó el encendido de una iluminación adecuada. Las parátesis que eran demasiado jóvenes o demasiado viejas a menudo no disparaban. Cuando era demasiado viejo, aparecieron numerosos guiones sobre la superficie de la cultura, dándole un tono blanquecino.

Cuando eran demasiado jóvenes, los cuerpos fructíferos no se disparaban y el experimento se repitió. 24 horas más tarde, cuando se recolectaron 10 Siri de un cruzamiento, al menos seis eran típicamente recombinantes según la puntuación de una mezcla de fenotipos de punto negativo y tejido positivo. Muy de vez en cuando, una mutación impedía que una cepa se apareara.

Si uno de los padres tenía un fenotipo de crecimiento aparente, entonces más de dos fenotipos estaban presentes entre las colonias en MMTS. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe comenzar con una cultura que se haya mantenido bien y que no se haya transferido secuencialmente a lo largo del tiempo. Comience siempre con un cultivo que se haya cultivado a partir de un stock estable de congelación.

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