Name: Imagen multimodal de implante de células madre en el sistema nervioso central de ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Aprende a realizar imagen multimodal de injertos de células madre en el cerebro de ratones mediante bioluminiscencia y resonancia magnética in vivo, validada con análisis histológico post mortem.

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<p class="jove_content"&gt; El trabajo de los autores fue apoyado por una beca de investigación ID-BOF 2006, de la Universidad de Amberes (concedida a PPO y AVDL), por la beca de investigación y G.0136.11 G.0130.11 (concedida a AVDL, ZB y PPO) y 1.5.021.09. N.00 (concedida a PPO) del Fondo para la Investigación Científica de Flandes (FWO-Vlaanderen, Bélgica), por la obstrucción del intestino delgado beca de investigación de TVN-60838: BRAINSTIM del Instituto Flamenco de Ciencia y Tecnología (otorgado a ZB y AVDL), en parte por una beca de investigación de Matusalén, el gobierno flamenco (concedida a ZB), en parte por la CE-FP6-NoE Dimi (LSHB-CT-2005 a 512.146), EC-FP6-NoE EMIL (LSHC-CT-2004-503.569) , y por el Banco Interamericano polacos de la Universidad de atracción IUAP-NIMI-P6/38 (concedida a AVDL). Nathalie De Vocht, tiene un doctorado-beca del FWO-Vlaanderen. Pedro Ponsaerts es un compañero post-doctoral de la FWO-Vlaanderen.</p

1. Preparación de la célula <ol><li> Los experimentos se debe iniciar con ex vivo de células madre cultivadas de poblaciones genéticamente modificadas para expresar las proteínas reportero luciferasa y eGFP. Aquí se utiliza luciferasa / eGFP expresando murinos derivados de médula ósea células del estroma (BMSC-Luc/eGFP) como se ha descrito por Bergwerf et al. 2, 5. </li><li> Dos días antes de marcado de la célula, las células de la placa BMSC-Luc/eGFP a una densidad de 8 x 10 5 células por matraz de cultivo T75 en 15 ml de medio de expansión completa (CEM), suplementado con 1 mg / ml Puromycine. </li><li> Permiten a las células a crecer durante 48 horas a 37 ° C y 5% de CO 2. </li><li> Añadir 5 x 10 6 azul glacial micras de tamaño de partículas de óxido de hierro (GB MPIO) por medio de cultivo ml para el cultivo celular cada vez más (total: 75 x 10 6 partículas por 15 ml de medio de cultivo en un frasco de cultivo T75). </li><li> Incubar durante 16 horas para permitir la captación de partículas a través de la endocitosis. </li><li> Eliminar las partículas que quedany permitir que las células crecen para un período adicional de 24 h para obtener la distribución de células confluencia y homogénea de la MPIO GB. </li><li> Validar la captación de partículas visualmente utilizando microscopía de fluorescencia, contando la relación de eGFP + y células MPIO GB + para la cantidad total de eGFP + en las células. </li><li> Lavar GB MPIO células marcadas BMSC-Luc/eGFP dos veces con 10 ml de PBS y las células después de la cosecha de tripsina-EDTA tratamiento (5 ml por matraz de cultivo T75 durante 5 minutos). </li><li> Lavar las células cosechadas y resuspender en concentración final de 133 x 10 6 células / ml en PBS. </li><li> Mantener las células en hielo hasta el trasplante. </li></ol> 2. Implante celular en el SNC de ratones <ol><li> Anestesiar ratones con una inyección intraperitoneal de una ketamina (80 mg / kg) + xilazina (16 mg / kg) mezcla. </li><li> Espere 5 minutos para permitir que los ratones para conciliar el sueño. </li><li> Afeitarse la cabeza del ratón para permitir manipulaciones estériles. </li><li> Coloque el ratón en un marco estereotáctico. </li><li> Desinfectar ella piel y la humedad de los ojos de los ratones para prevenir la deshidratación. </li><li> Haga una incisión del cuero cabelludo línea media para exponer el cráneo, y perfore un agujero en el cráneo con un taladro dental de rebabas en las coordenadas dadas: 2 mm por detrás y 2 mm lateral a Bregma. </li><li> La suspensión de células vórtice brevemente y aspirar la suspensión de células en la jeringa. </li><li> Colocar la aguja de la jeringa a una profundidad de 2,5 mm bajo la duramadre y permitir el equilibrio de presión durante 1 minuto. </li><li> Inyectar una suspensión de células 3 l (4 x 10 5 células) a una profundidad de 2 mm por debajo de la duramadre y a una velocidad de 0,70 l / min utilizando un sistema automatizado de micro-inyección de la bomba. </li><li> Esperar 5 minutos adicionales para evitar el reflujo de la suspensión celular inyectada. </li><li> Poco a poco retraer la aguja y desinfectar las fronteras de la piel antes de suturar la piel. </li><li> Inyectar 300 l solución NaCl al 0,9% por vía subcutánea con el fin de evitar la deshidratación, y colocar el ratón bajo una lámpara de calentamiento para recuperarse de la anestesia. Administrar post-operatorio analgésico en conformidad con las normas institucionales. </li></ol> 3. En bioluminiscencia in vivo <ol><li> Anestesiar los ratones por una mezcla de 3% de isoflurano y oxígeno. </li><li> Coloque los ratones en el reproductor de imágenes de fotones y reducir el nivel de la anestesia con isoflurano al 1,5% y el oxígeno. </li><li> Inyectar 150 mg de D-luciferina por kg de peso corporal por vía intravenosa. </li><li> Adquirir la imagen durante 5 minutos utilizando el software de visión de fotos. </li><li> Lleve a cabo el procesamiento de imágenes utilizando el software M3vision. Cuantificar la señal observada con las regiones de interés fijas. </li></ol> 4. En vivo de imágenes de resonancia magnética <ol><li> Anestesiar los ratones con 3% de isoflurano en una mezcla de O 2: N 2 O (3:7). </li><li> Coloque los ratones en la inmovilización de un sistema horizontal 9.4T MR y reducir el nivel de anestesia a 1% de isoflurano en una mezcla de O 2: N 2 O (3:7). </li><li> Humedezca los ojos de los ratones para evitar la deshidrataciónción, conecte una sonda rectal para controlar la temperatura corporal y controlar la tasa de respiración mediante la colocación de un sensor debajo del vientre del ratón. </li><li> Mantener la tasa de respiración a 110 ± 10 respiraciones por minuto y mantener la temperatura corporal constante dentro de un estrecho rango de 37 ± 0,5 ° C. </li><li> Colocar la bobina de RF en la superficie superior de la cabeza del ratón y la posición del ratón en el centro del imán. </li><li> Adquirir un conjunto de 10 coronales potenciadas en T2 eco del espín (SE) en las imágenes para obtener información específica anatómica y T2 * imágenes de eco de gradiente (GE) con el fin de estudiar la migración de células madre con una resolución en el plano de 70 m 2. Establezca los parámetros de la secuencia de la siguiente manera: tiempo de repetición (TR): 500 ms, tiempo de eco (TE): 8 ms (secuencia GE) y el tiempo de repetición (TR): 4200 ms, tiempo de eco (TE): 12,16 m (SE secuencia); campo de visión (FOV): 18x18 mm 2, la matriz: 256x256, un grosor de corte mm y una separación de corte mm (5,1 Paravision de software). </li><li> Lleve a cabo el procesamiento de datosutilizando el software Amira 4.0. </li></ol> 5. Post Mortem Histología <ol><li> Anestesiar los ratones muy profundamente por la inhalación de un oxígeno isofluorano (4%), (0,5 l / min) y nitrógeno (1 l / min) mezcla durante 2 minutos. El sacrificio de los ratones por dislocación cervical. </li><li> Retire el cerebro del ratón en el cráneo y fijar el tejido cerebral en paraformaldehído al 4% en PBS durante 2 horas. </li><li> Deshidratar el tejido cerebral mediante la colocación del cerebro posteriormente en diferentes gradientes de sacarosa: 2 horas en 5% de sacarosa en PBS, 2 h en 10% de sacarosa en PBS, durante toda la noche en 20% de sacarosa en PBS. </li><li> Congelar el tejido cerebral utilizando nitrógeno líquido y almacenar el tejido a -80 ° C hasta que el corte. </li><li> Sección del tejido cerebral en 10 secciones m de espesor con un criostato. </li><li> Pantalla sin mancha cryosections de fluorescencia azul de las partículas GB MPIO y la fluorescencia verde de las células que expresan eGFP utilizando un microscopio de fluorescencia. </li><li> Pantalla sin mancha de cryosectionsverde / rojo de fondo de fluorescencia de las células inflamatorias. </li><li> Realizar tinciones inmunohistoquímicas y de inmunofluorescencia más para identificar las poblaciones endógenas de células (por ejemplo, la microglia, astrocitos, células T, ...) que interactúan con los injertos celulares. </li></ol> 6. Los resultados representativos Estamos aquí presentada visualmente una secuencia optimizada de eventos para el éxito de imagen multimodal de las poblaciones de luciferasa / eGFP célula que expresa (STEM) en el sistema nervioso central de ratones. Al principio, los que se describen GB MPIO los resultados del procedimiento de etiquetado en los alimentos de alta eficiencia de las células BMSC-Luc/eGFP, que fácilmente pueden ser validados mediante microscopía de fluorescencia (Figura 2A). A continuación, sobre el injerto de GB MPIO etiquetados BMSC-Luc/eGFP en el SNC de ratones, la supervivencia del injerto celular puede ser controlado por in vivo BLI basado en la actividad de luciferasa (Figura 2B). Además, la localización exacta de las células injertadas pueden ser controlados por in vivo </em&gt; RM basado en el contenido de hierro de la MPIO GB (Figura 2C). Finalmente, el análisis histológico permite la validación de los resultados obtenidos por BLI y RMN. Estable la supervivencia fue confirmada por un eGFP expresión estable en el tiempo (Figura 2). Para esto, colocalización de eGFP-expresión de las células con azul fluorescente MPIO permite la determinación exacta de la localización y la supervivencia de las células injertadas. Además, este doble etiquetado fluorescente de las células madre reduce la posibilidad de observar resultados positivos falsos basados ​​en fluorescencia de fondo creado por las células inflamatorias 5. <img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3906/3906fig1.jpg" /> Figura 1. Visión general de la secuencia de manejo <ol class="lroman"><li> Etiquetado de la célula: BMSC-Luc/eGFP están etiquetados con 5 x 10 6 partículas GB MPIO por medio de cultivo ml. Después de 16 horas de incubación y un período de descanso de la siguiente 24 horas, las células se cosechan parala implantación intracerebral. </li><li> Implantación de las células: GB MPIO etiquetados BMSC-Luc/eGFP se injertan en el cerebro de ratones en las siguientes coordenadas: bregma -2 mm, 2 mm de la derecha de la línea media y 2 mm en la duramadre. </li><li> En vivo BLI: Después de la administración intravenosa de 150 mg D-luciferin/kg peso corporal, la luz generada fue adquirida durante 5 minutos usando el reproductor de imágenes de fotones. </li><li> En vivo RM: Un conjunto de 10 coronales potenciadas en T2 eco del espín (SE), las imágenes y T2 * imágenes eco de gradiente (GE) con una resolución en el plano de 70 m 2 fueron adquiridas. Parámetros de la secuencia fueron los siguientes: tiempo de repetición (TR): 500 ms, tiempo de eco (TE): 8 ms (secuencia GE) y el tiempo de repetición (TR): 4200 ms, tiempo de eco (TE): 12,16 m (secuencia SE); campo de visión (FOV): 18x18 mm 2, la matriz: 256x256, un grosor de corte mm y 1 mm de separación corte. </li><li> La histología post-mortem: criosección 10μm de espesor fueron seleccionados para expresar eGFP y azul marcado con fluorescencia u BMSCcantar un microscopio de fluorescencia. </li></ol><img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/3906/3906fig2.jpg" /> Figura 2. Multimodal de imágenes de los injertos de células madre <ol class="ualpha"><li> Microscopio de inmunofluorescencia directa de azul glacial (GB) MPIO etiquetados BMSC-Luc/eGFP. </li><li> En vivo BLI de los ratones inyectados con 4x10 5 GB MPIO células marcadas BMSC-Luc/eGFP en la semana 1 y 2 semanas después de la implantación. El análisis estadístico de las señales detectadas de BLI en la semana 1 y 2 semanas después de la implantación. Los datos se expresan como el número promedio de fotones por segundo por estereorradián por centímetro cuadrado (ph / s / sr / cm 2) a partir de un período de tiempo de 5 minutos + / - error estándar calculado a partir de una región de interés fijo en ratones que muestran una clara señal de BLI en el sitio de inyección. </li><li> Coronal de dos dimensiones de la resonancia magnética GB MPIO etiquetados BMSC-Luc/eGFP (a la izquierda del panel: (i) en T2 la imagen eco de espín y (ii) T2 * imagen de eco de gradiente) y sin etiqueta BMSC L-UC / eGFP (panel de la derecha: (iii) la imagen ponderada en T2 eco de espín y (vi) T2 * imagen de eco de gradiente) injertos en el cerebro del ratón. </li><li> El análisis histológico de los implantes GB MPIO etiquetados BMSC-Luc/eGFP en la semana 2 post-implantación. (I) el análisis de inmunofluorescencia directa para la localización de eGFP de expresar y GB MPIO etiquetados injertos BMSC-Luc/eGFP. (Ii) los detalles a gran aumento de (i). (Iii) la tinción de inmunofluorescencia para el antígeno de GFAP, lo que indica el desarrollo de tejido cicatrizal los astrocitos en los alrededores de la etiqueta BMSC-Luc/eGFP GB MPIO. (Vi) la tinción de inmunofluorescencia para el antígeno de Iba-1, lo que indica la invasión y los alrededores de GB MPIO BMSC-Luc/eGFP etiquetados por la microglia. </li></ol>

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<li>Krishnan, M., Park, J. M., Cao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+epigenetic+modulation+on+reporter+gene+expression%3A+implications+for+stem+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Effects of epigenetic modulation on reporter gene expression: implications for stem cell imaging.</a> FASEB J. 20, 106-108 (2006).</li>
<li>Svensson, R. U., Barnes, J. M., Rokhlin, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapeutic+agents+up-regulate+the+cytomegalovirus+promoter%3A+implications+for+bioluminescence+imaging+of+tumor+response+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Chemotherapeutic agents up-regulate the cytomegalovirus promoter: implications for bioluminescence imaging of tumor response to therapy.</a> Cancer Res. 67, 10445-10454 (2007).</li>
</ol>

Los autores declaran no tener conflicto de intereses.

En este reporte se describe un protocolo optimizado para la combinación de tres técnicas de imagen complementarias (BLI, la resonancia magnética y la histología) para la caracterización detallada de los implantes celulares en el sistema nervioso central de ratones inmunes competentes. Una combinación de etiquetado del gen de las células, sobre la base de la modificación genética con los genes reporteros de luciferasa de luciérnaga y eGFP, y un etiquetado directo de células con GB MPIO, conduce a una evaluación precisa d...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> IMDM </td><td> Lonza </td><td> BE12-722F </td><td> Componente de la CEM, el medio de cultivo celular </td></tr><tr><td> Suero bovino fetal </td><td> Gibco </td><td> 10270-106 </td><td> Componente de la CEM, el medio de cultivo celular </td></tr><tr><td> El suero de caballo </td><td> Gibco </td><td> 1605-122 </td><td> Componente de la CEM, el medio de cultivo celular </td></tr><tr><td> La penicilina-estreptomicina </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td><td> Componente de la CEM, el medio de cultivo celular </td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Gibco </td><td> 15290-018 </td><td> Componente de la CEM, el medio de cultivo celular </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco </td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td> Puromycine </td><td> Invivogen </td><td> ANT-PR-1 </td><td></td></tr><tr><td> tripsina </td&gt; <td> Gibco </td><td> 25300 </td><td></td></tr><tr><td> GB MPIO </td><td> Bangs Laboratorios </td><td> ME04F/7833 </td><td></td></tr><tr><td> D-luciferina </td><td> Promega </td><td> E1601 </td><td></td></tr><tr><td> La ketamina (Ketalar) </td><td> Pfizer </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Xilazina (Rompun) </td><td> Bayer Health Care </td><td></td><td></td></tr><tr><td> El isoflurano </td><td> Isoflo </td><td> 05260-05 </td><td></td></tr><tr><td> 0,9% de NaCl solución </td><td> Baxter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> paraformaldehído </td><td> Merck </td><td> 1.04005.1000 </td><td></td></tr><tr><td> sacarosa </td><td> Applichem </td><td> A1125 </td><td></td></tr><tr><td> Micro-bomba de inyección </td><td> KD científica </td><td> KDS100 </td><td></td></tr><tr><td> Photon imágenes </td><td> Biospace Lab </td><td></td><td></td></tr><tr&gt; <td> 9.4T MR escáner </td><td> Bruker BioSpin </td><td> Biospec 94/20 USR </td><td></td></tr><tr><td> BX51 </td><td> Olimpo </td><td> BX51 </td><td></td></tr><tr><td> Mycrom HM criostato </td><td> Prosan </td><td> HM525 </td><td></td></tr><tr><td> jeringa </td><td> Hamilton </td><td> 7635-01 </td><td></td></tr><tr><td> Aguja de calibre 30 </td><td> Hamilton </td><td> 7762-03 </td><td></td></tr><tr><td> Foto Visión de software </td><td> Biospace Lab </td><td></td><td></td></tr><tr><td> M3vision de software </td><td> Biospace Lab </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Paravision 5.1 del software </td><td> Bruker BioSpin </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Amira software 4.0 </td><td> Visage imágenes </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imagen multimodal de implante de células madre en el sistema nervioso central de ratones

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

Durante la década pasada, el trasplante de células madre ha ganado un creciente interés como modalidad terapéutica primaria o secundaria para una variedad de enfermedades, tanto en estudios preclínicos y clínicos. Sin embargo, hasta la fecha los resultados con respecto a los resultados funcionales y / o regeneración de los tejidos después de un trasplante de células madre son muy diversas. Por lo general, un beneficio clínico que se observa, sin conocimiento profundo de los mecanismo (s) 1. Por lo tanto, los múltiples esfuerzos han llevado al desarrollo de las diferentes modalidades de imágenes moleculares para controlar el injerto de células madre con el fin último de evaluar con precisión la supervivencia, el destino y la fisiología de las células madre injertadas y / o su entorno micro. Los cambios observados en uno o más parámetros determinados por imagen molecular podría estar relacionado con el efecto clínico observado. En este contexto, nuestros estudios se centran en el uso combinado de imágenes de bioluminiscencia (BLI), imágenes por resonancia magnética (RM) e histológicos analysis para evaluar el injerto de células madre. BLI se utiliza comúnmente para no invasiva realizar el seguimiento de celda y vigilar la supervivencia celular en el tiempo después del trasplante 2-7, basado en una reacción bioquímica en donde las células que expresan el gen de luciferasa-reportero son capaces de emitir luz siguiente interacción con su sustrato (por ejemplo, D- luciferina) 8, 9. RM por otro lado es una técnica no invasiva que es aplicable clínicamente 10 y se puede utilizar para localizar con precisión los injertos celulares con una resolución muy alta 11-15, aunque su sensibilidad depende en gran medida el contraste generado después de marcado de la célula con un agente de contraste para MRI . Por último, post mortem análisis histológico es el método de elección para validar los resultados de investigación obtenidos con técnicas no invasivas con mayor resolución y sensibilidad. Por otra parte punto final el análisis histológico nos permite realizar un análisis detallado fenotípica de las células injertadas y / o el tejido circundante, baSED en el uso de proteínas fluorescentes reportero y / o etiquetado directo de células con anticuerpos específicos. En resumen, aquí visualmente demostrar la complementariedad de BLI, la resonancia magnética y la histología de desentrañar las células madre y diferente / o asociados con el medio ambiente las siguientes características injerto de células madre en el SNC de ratones. A modo de ejemplo, la médula ósea derivados de las células del estroma, la ingeniería genética para expresar la mayor proteína verde fluorescente luciferasa (eGFP) y Firefly (fluctuaciones), y marcado con color azul fluorescente micras de tamaño de partículas de óxido de hierro (MPIOs), serán injertados en el sistema nervioso central de ratones inmunocompetentes y los resultados serán monitoreados por BLI, la resonancia magnética y la histología (Figura 1).

En este artículo se describe una secuencia optimizada de eventos para obtener imágenes multimodal de los injertos celulares en el cerebro de los roedores por medio de: (i) en la bioluminiscencia in vivo y la resonancia magnética, y (ii) el análisis post mortem histológico. La combinación de estas modalidades de imágenes en un solo animal permite la evaluación del injerto celular con alta resolución, sensibilidad y especificidad.

Imagen multimodal de implante de células madre en el sistema nervioso central de ratones

Durante la última década, el trasplante de células madre ha despertado un interés creciente como modalidad terapéutica primaria o secundaria para una variedad de enfermedades, ...

El objetivo general de este procedimiento es lograr un seguimiento estandarizado del comportamiento in vivo de células madre trasplantadas en el cerebro de ratón. Esto se consigue primero marcando las células estromales derivadas de la médula ósea, que expresan simultáneamente EGFP y luciferasa, con partículas fluorescentes de óxido de hierro de tamaño micrométrico. El segundo paso consiste en inyectar adecuadamente las CMO marcadas con MPIO en el tejido cerebral del ratón.A continuación, la supervivencia y la localización de los injertos celulares se siguen de forma no invasiva mediante imágenes de bioluminiscencia e imágenes por resonancia magnética. El paso final consiste en validar los resultados de las imágenes in vivo mediante análisis histológico post mortem. Este método puede proporcionar información sobre el comportamiento de las células madre tras el trasplante en el cerebro de ratón, pero también puede aplicarse a otros sistemas, como organismos modelo y estudios de enfermedades.La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de manipulación del animal son difíciles de aprender porque las inyecciones intravenosas e intracerebrales son complicadas de realizar y conllevan ciertos riesgos para la supervivencia del animal. Para comenzar este procedimiento, agregue 75 veces 10 a la seis partículas de óxido de hierro de tamaño micrométrico azul glaciar a un cultivo celular subconfluente en crecimiento. Incúbelas durante otras 16 horas para permitir la absorción de partículas mediante endocitosis, luego lave las partículas restantes.Deje crecer las células durante 24 horas adicionales para obtener una confluencia celular y una distribución homogénea del G-B-M-P-I-O. A continuación, utilice microscopía de fluorescencia para validar visualmente la absorción de partículas calculando la proporción de células positivas para EGFP y G-B-M-P-I-O respecto al número total de células positivas para EGFP. A continuación, lave dos veces las células marcadas con G-B-M-P-I-O, BMSC luciferasa EGFP, con 10 mililitros.Trate las células con tripsina EDTA y recójalas posteriormente. Luego lave las células y resuspenda en una concentración final de 133 veces 10 a la sexta células por mililitro en PBS. Finalmente, mantenga las células en hielo hasta el trasplante.En este procedimiento, anestesie al ratón mediante inyección intraperitoneal de una mezcla de ketamina a 80 miligramos por kilogramo y xilacina a 16 miligramos por kilogramo. Espere cinco minutos a que el ratón se duerma, luego afeite su cabeza para permitir manipulaciones estériles. A continuación, coloque al ratón en un marco estereotáxico y desinfecte la piel con alcohol.A continuación, aplique una pomada en sus ojos para prevenir la deshidratación. Realice una incisión media en el cuero cabelludo para exponer el cráneo con el fin de localizar el hipocampo. Perfore un orificio en el cráneo a dos milímetros posteriores y dos milímetros laterales utilizando una fresa dental.En este momento, agite brevemente la suspensión celular mediante vortex y luego aspire la suspensión celular en la jeringa. Posteriormente, introduzca la jeringa con aguja a una profundidad de 2,5 milímetros por debajo de la duramadre y permita la equilibración de presión durante un minuto. Tras un minuto, retire la aguja hasta una posición de dos milímetros por debajo de la duramadre.Luego, inyecte tres microlitros de la suspensión celular utilizando una bomba de microinyección automatizada a una velocidad de 0,70 microlitros por minuto. Después de la inyección, espere cinco minutos adicionales para prevenir el retroflujo de la suspensión celular inyectada. A continuación, retire lentamente la aguja.A continuación, desinfecte los bordes de la piel y luego suture la piel. Inyecte 300 microlitros de solución de cloruro de sodio al 0,9 % por vía subcutánea para prevenir la deshidratación. Al final, coloque al ratón bajo una lámpara de calor para permitir la recuperación de la anestesia y realizar la imagen bioluminiscente.Anestesie el ratón con una mezcla de 3%iso, fluoruro y oxígeno. A continuación, coloque el ratón en el imagenador de fotones. Reduzca el nivel de anestesia ajustando el fluoruro de isoflurano al 1,5%. A continuación, inyecte d-luciferina por vía intravenosa a 150 miligramos por kilogramo de peso corporal.Adquiera la imagen durante cinco minutos utilizando el software de fotovisión. Después, realice el procesamiento de la imagen utilizando el software M three vision y cuantifique la señal observada utilizando regiones de interés fijas. Para realizar la imagen por resonancia magnética, anestesie el ratón con 3 % de ISO fluorado en una mezcla de oxígeno y óxido nítrico.Luego, coloque el ratón en el sujetador de un sistema de RM horizontal de 9,4 Tesla. Reduzca el nivel de anestesia ajustando el isoflurano al 1%. A continuación, aplique una pomada en los ojos del ratón para prevenir la deshidratación. Después, utilice una sonda rectal para monitorear la temperatura corporal.Luego, coloque un sensor debajo del abdomen del ratón para monitorear la frecuencia respiratoria. Mantenga la frecuencia respiratoria en 110 más o menos 10 veces por minuto y mantenga la temperatura corporal constante dentro de un rango estrecho de 37 más o menos 0,5 grados Celsius. A continuación, coloque la bobina RF de superficie encima de la cabeza del ratón.Coloque el ratón en el centro del imán. A continuación, abra ParaVision 5.1 y configure los parámetros de secuencia según el manuscrito adjunto. Luego, adquiera un conjunto de 10 imágenes coronales de eco de espín ponderadas en T2 para obtener información anatómica específica.Imágenes ponderadas en gradiente eco con dos estrellas NT para estudiar la migración de células madre con una resolución en el plano de 70 micrómetros cuadrados. En este paso, sacrifique el ratón y extraiga el cerebro. Fije el tejido cerebral a temperatura ambiente en paraformaldehído al 4% en PBS durante dos horas.Después de dos horas, deshidrate el tejido cerebral colocándolo en diferentes gradientes de sacarosa a cuatro grados Celsius. Al día siguiente, congele el tejido cerebral utilizando nitrógeno líquido y almacene el tejido a menos 80 grados Celsius hasta el momento del corte, cuando esté listo.Corte el tejido cerebral en secciones de 10 micrómetros de grosor utilizando un criostato. Posteriormente, examine bajo un microscopio de fluorescencia las secciones criostáticas sin teñir para detectar la fluorescencia azul de las partículas G-B-M-P-I-O y la fluorescencia verde de las células que expresan EGFP. Luego, examine las secciones criostáticas sin teñir para detectar la fluorescencia de fondo verde roja proveniente de las células inflamatorias.El procedimiento descrito de marcado con MPIO azul glaciar da como resultado un marcado altamente eficiente de las células BMSC, luciferasa EGFP, lo cual puede validarse fácilmente mediante microscopía de fluorescencia. A continuación, tras el injerto de BMSC marcadas con G-B-M-P-I-O, células luciferasa EGFP en el SNC de ratones, la supervivencia del injerto celular puede monitorizarse mediante imágenes de bioluminiscencia in vivo basadas en la actividad de la luciferasa. Adicionalmente, la localización exacta de las células injertadas puede monitorizarse mediante imágenes de resonancia magnética in vivo basadas en el contenido de hierro del MPIO azul glaciar.Finalmente, el análisis histológico muestra la validación de los resultados obtenidos mediante imágenes de bioluminiscencia y resonancia magnética. La supervivencia estable se confirmó por una expresión estable de EGFP en el tiempo tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la imagen molecular exploraran eventos celulares y moleculares tras el trasplante de células madre en diferentes modelos animales de enfermedades neurodegenerativas.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar imágenes moleculares, aplicando bioluminiscencia e imágenes por resonancia magnética, y validar adecuadamente los resultados in vivo mediante evaluación histológica post mortem.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Fuente: Daynac, M., et. al. Clasificación celular de células madre neurales y progenitoras de la zona subventricular de ratón adulto e imágenes en vivo de su dinámica del ciclo celular. J. Vis. Exp. (2015)Este video muestra imágenes de lapso de tiempo de células madre neurales (NSC) de un cerebro de ratón transgénico utilizando un microscopio de escaneo láser confocal. Las NSC emiten fluorescencia roja durante la fase G1 y no son fluorescentes en otras fases del ciclo celular. Se coloca un...

Imágenes de lapso de tiempo de la división de células madre neurales de ratón mediante microscopía confocal

Las imágenes intravitales de dos fotones se pueden utilizar para investigar las interacciones entre diferentes tipos de células en la médula espinal en su entorno de tejido nativo en un animal quimérico de médula ósea con una lesión traumática por aplastamiento de la médula espinal en la columna dorsal.

Imaging intravital de axonales Interacciones con macrófagos y microglia en un ratón Dorsal Crush Columna Lesión

Aquí describimos un procedimiento basado en el uso de partículas lentivirales para la modificación genética a largo plazo de células madre neurales y/o sus células ependimarias adyacentes en el nicho neurogénico ventricular-subventricular adulto que permite el análisis por separado de los efectos autónomos y no autónomos, dependientes del nicho, sobre las células madre neurales.

Estable y eficiente modificación genética de células en el ratón adulto V-SVZ para el análisis de neural de células madre Autónoma y los efectos no autónomos

La implantación de injertos óseos autólogos y alogénicos constituyen aceptó enfoques para tratar la importante pérdida de masa ósea craneofacial. Sin embargo, el efecto de la composición de injerto en la interacción entre la neovascularización, la diferenciación celular y la formación de hueso no está claro. Se presenta un protocolo de imagen multimodal destinado a dilucidar la interdependencia angiogénesis osteogénesis en la proximidad del injerto.

Tomografía Computarizada e Imagen Óptico de Acoplamiento-Osteogénesis angiogénesis para evaluar la integración de craneales hueso autoinjertos y aloinjertos

Este protocolo demuestra metodologías para un modelo de ratón de lesión cerebral traumática de cráneo abierto y trasplante de células pluripotentes derivadas de células madre inducidas por el ser humano cultivadas en el sitio de la lesión. Las pruebas conductuales y histológicas de los resultados de estos procedimientos también se describen brevemente.

Modelo de impacto cortical controlado de lesión cerebral de ratón con trasplante terapéutico de células neuronales derivadas de células madre pluripotentes inducidas por el hombre

Se ha notificado un método para la entrega de células madre neurales, adaptable para inyectar soluciones o suspensiones, a través de la arteria carótida común (ratón) o la arteria carótida externa (rata) después de un accidente cerebrovascular isquémico. Las células inyectadas se distribuyen ampliamente por todo el parénquima cerebral y se pueden detectar hasta 30 d después del parto.

Entrega intra-arterial de células madre neuronales a la rata y el cerebro del ratón: aplicación a la isquemia cerebral

Este protocolo describe una técnica crónica de implantación de ventanas craneales que se puede utilizar para imágenes longitudinales de estructuras neuro-glio-vasculares, interacciones y función en condiciones saludables y enfermas. Sirve como una alternativa complementaria al enfoque de imagen transcraneal que, aunque a menudo se prefiere, posee algunas limitaciones críticas.

Mapeo cerebral preciso para realizar imágenes in vivo repetitivas de dinámica neuroinmunitaria en ratones

Aquí se presenta un protocolo para la implantación de una ventana craneal crónica para la obtención de imágenes longitudinales de células cerebrales en ratones despiertos y con la cabeza restringida.

Implantación de una ventana craneal para imágenes repetidas in vivo en ratones despiertos

Describimos el trasplante intraparenquimatoso de células progenitoras neurales humanas transducidas con un vector informador dual que expresa la proteína fluorescente verde luciferasa (GFP) en el cerebro del ratón. Después del trasplante, la señal de luciferasa se mide repetidamente utilizando bioluminiscencia in vivo y células injertadas que expresan GFP identificadas en secciones cerebrales mediante microscopía de fluorescencia.

Trasplante intracerebral y seguimiento de bioluminiscencia in vivo de células progenitoras neurales humanas en el cerebro de ratón

Aquí, describimos un protocolo que combina la inyección de virus adenoasociados con la implantación de ventana craneal para obtener imágenes simultáneas de la dinámica microglial y la actividad neuronal en ratones despiertos.

Imágenes simultáneas de la dinámica microglial y la actividad neuronal en ratones despiertos

La traslación de los hallazgos de la microscopía intravital se ve desafiada por su poca profundidad de penetración en el tejido. Aquí describimos un modelo de ratón de cámara de ventana dorsal que permite el registro conjunto de la microscopía intravital y las modalidades de imagen clínicamente aplicables (p. ej., TC, RM) para la correlación espacial directa, lo que podría agilizar la traducción clínica de los hallazgos de la microscopía intravital.

Un modelo de ratón tumoral con cámara de ventana de pliegue cutáneo dorsal para la microscopía intravital combinada y la resonancia magnética en la investigación traslacional del cáncer

Aprende a realizar imagen multimodal de injertos de células madre en el cerebro de ratones mediante bioluminiscencia y resonancia magnética in vivo, validada con análisis histológico post mortem.

Imagen multimodal de implante de células madre en el sistema nervioso central de ratones

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