Imagen multimodal de implante de células madre en el sistema nervioso central de ratones

El objetivo general de este procedimiento es lograr un seguimiento estandarizado en el comportamiento in vivo de las células madre trasplantadas en el cerebro del ratón. Esto se logra marcando primero las células estromales derivadas de la médula ósea, que coexpresaron EGFP y luciferasa con partículas fluorescentes de óxido de hierro del tamaño de una micra. El segundo paso es inyectar adecuadamente las BMC marcadas con MPIO en el tejido cerebral del ratón.

A continuación, se realiza un seguimiento no invasivo de la supervivencia y localización de los injertos celulares mediante imágenes de bioluminiscencia y resonancia magnética. El paso final es validar los resultados de las imágenes in vivo mediante análisis histológico post mortem. Estos métodos pueden proporcionar información sobre el comportamiento de las células madre después del trasplante en el cerebro de ratón, pero también se pueden aplicar a otros sistemas, como organismos modelo y estudios de una enfermedad.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de manejo de los animales son difíciles de aprender porque las inyecciones intravenosas e intracerebrales son difíciles de realizar y contienen ciertos riesgos para la supervivencia de los animales. Para comenzar este procedimiento, agregue 75 veces 10 a las seis partículas de óxido de hierro del tamaño de una micra azul glacial a un cultivo celular en crecimiento subconfluente. Incubarlos durante otras 16 horas para permitir la absorción de partículas a través de la endocitosis, luego lavar las partículas restantes.

Permita que las células crezcan durante 24 horas adicionales para obtener la fluidez celular y la distribución homogénea del G-B-M-P-I-O. Después de eso, use microscopía de fluorescencia para validar visualmente la absorción de partículas calculando la proporción de células positivas para EGFP y células G-B-M-P-I-O con respecto a la cantidad total de células positivas para EGFP. A continuación, lave las células G-B-M-P-I-O, marcadas como BMSC luciferasa EGFP dos veces con 10 mililitros.

PBS trata las células con tripsina EDTA y las cosecha después. A continuación, lave las células y vuelva a suspenderlas a una concentración final de 133 veces 10 a la sexta célula por mililitro en PBS. Finalmente, mantenga las células en hielo hasta el trasplante.

En este procedimiento, anestesiar al ratón mediante inyección intraperitoneal de la mezcla de ketamina a 80 miligramos por kilogramo y xilacina a 16 miligramos por kilogramo. Espere cinco minutos para que el ratón se duerma, luego afeita su cabeza para permitir manipulaciones estériles. A continuación, coloque el ratón en un marco estereotáctico, desinfecte la piel con alcohol.

Después de eso, aplique ungüento en sus ojos para evitar la deshidratación. Haz una incisión en la línea media del cuero cabelludo para exponer el cráneo con el fin de apuntar al hipocampo. Perfora un agujero en el cráneo a dos milímetros posteriores y dos milímetros laterales con una fresa de fresa dental.

En este punto, agite brevemente la suspensión celular y luego aspire la suspensión celular en la jeringa. A continuación, baje la jeringa de aguja a una profundidad de 2,5 milímetros por debajo de la duramadre y permita el equilibrio de la presión durante un minuto. Después de un minuto, retraiga la aguja a una posición de dos milímetros por debajo de la duramadre.

A continuación, inyecte tres microlitros de suspensión celular utilizando una bomba de microinyección automatizada a una velocidad de 0,70 microlitros por minuto. Después de la inyección, espere cinco minutos más para evitar el reflujo de la suspensión celular inyectada. A continuación, retraiga lentamente la aguja.

Después, desinfecte los bordes de la piel y luego sutura la piel. Inyectar 300 microlitros de solución de cloruro de sodio al 0,9% por vía subcutánea para prevenir la deshidratación. Al final, coloque el mouse debajo de una lámpara de calentamiento para permitir la recuperación de la anestesia para realizar imágenes de bioluminiscencia.

Anestesiar al ratón con una mezcla de 3% de iso, flúor y oxígeno. A continuación, coloque el ratón en el generador de imágenes de fotones. Reduzca el nivel de anestesia ajustando el isde flúor al 1,5%A continuación, inyecte Lucifer por vía intravenosa a 150 miligramos por kilogramo de peso corporal.

Adquiera imágenes durante cinco minutos utilizando el software de visión fotográfica. Después de eso, realice el procesamiento de imágenes utilizando el software de visión M three y cuantifique la señal observada utilizando regiones fijas de interés. Para realizar imágenes por resonancia magnética, anestesiar al ratón con flúor ISO al 3% en una mezcla de oxígeno y óxido nítrico.

A continuación, coloque el ratón en el retenedor de un sistema de resonancia magnética horizontal de 9,4 Tesla. Reduzca el nivel de anestesia ajustando el isde flúor al 1%A continuación, aplique ungüento en los ojos del ratón para evitar la deshidratación. Después de eso, use una sonda rectal para controlar la temperatura corporal.

A continuación, coloque un sensor debajo de la barriga del ratón para controlar la frecuencia respiratoria. Mantenga la frecuencia respiratoria a 110 más o menos 10 veces por minuto, y mantenga la temperatura corporal constante dentro de un rango estrecho de 37 más o menos 0.5 grados Celsius. A continuación, coloque la bobina de RF de superficie en la parte superior de la cabeza del ratón.

Coloque el ratón en el centro del imán. A continuación, abra ParaVision 5.1 Establezca los parámetros de secuencia de acuerdo con el manuscrito adjunto. A continuación, adquiera un conjunto de 10 imágenes de eco de espín ponderadas T coronales para obtener información anatómica específica.

Imágenes de eco de gradiente ponderadas de dos estrellas NT para estudiar la migración de células madre con una resolución simple de 70 micrómetros cuadrados. En este paso, sacrifica el ratón y extrae el cerebro. Fije el tejido cerebral a temperatura ambiente en paraldehído al 4% en PBS durante dos horas.

Después de dos horas. Deshidrata el tejido cerebral colocándolo en diferentes gradientes de sacarosa a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, congele el tejido cerebral con nitrógeno líquido y almacene el tejido a menos 80 grados centígrados hasta que esté listo para seccionarlo.

Divida el tejido cerebral en secciones de 10 micrómetros de espesor con un criostato. Posteriormente, bajo un microscopio de fluorescencia, las secciones criogénicas sin teñir buscan fluorescencia azul de las partículas G-B-M-P-I-O y fluorescencia verde de las células que expresan EGFP. A continuación, examina las secciones criogénicas sin teñir para detectar la fluorescencia de fondo verde y rojo de las células inflamatorias.

El procedimiento de marcaje MPIO azul glacial descrito da como resultado un marcaje altamente eficiente de las células EGFP de luciferasa BMSC, que puede validarse fácilmente mediante microscopía de fluorescencia. A continuación, tras el injerto de células G-B-M-P-I-O, marcadas como BMSC, luciferasa EGFP en el SNC de ratones, la supervivencia del injerto celular se puede monitorear mediante imágenes de bioluminiscencia in vivo basadas en la actividad de la luciferasa. Además, la localización exacta de las células injertadas se puede monitorizar mediante imágenes de resonancia magnética in vivo basadas en el contenido de hierro del MPIO azul glacial.

Finalmente, el análisis histológico muestra la validación de los resultados obtenidos por imágenes de bioluminiscencia y resonancia magnética. La supervivencia estable fue confirmada por una expresión estable de EGFP en el tiempo después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la imagen molecular exploraran los eventos celulares y moleculares después del trasplante de células madre en diferentes modelos animales para enfermedades neurodegenerativas.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar imágenes moleculares, aplicando imágenes de bioluminiscencia y resonancia magnética, y validar adecuadamente los resultados in vivo mediante la evaluación histológica postmortem.