Name: La purificación y la visualización de lipopolisacárido de bacterias Gram-negativas por Hot acuosa de fenol-Extracción (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 31 s
Description: Aprende a purificar lipopolisacárido de bacterias Gram-negativas mediante extracción con fenol acuoso caliente. Este método permite analizar LPS por SDS-PAGE y Western blot para estudios de patogénesis bacteriana.

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Este trabajo fue apoyado por becas de los Institutos Nacionales de Salud y la Fundación de Fibrosis Quística.

1. Preparación de las bacterias para la extracción de LPS <ol><li> Empezar un cultivo de una noche en 5 ml de caldo Luria (LB), suplementado con antibióticos si es necesario. Cultive hasta el día (12-18 horas) en una incubadora de agitación a 37 ° C y 200 rpm. </li><li> Diluir la 1:10 de cultivo con LB y tener un 600 OD lectura en un espectrofotómetro. Sobre la base de los 600 OD lectura, hacer una suspensión de 1,5 ml a las bacterias a un OD 600 de 0,5. </li><li> Sedimentar las bacterias en una microcentrífuga a 10.600 x g durante 10 minutos. Retire y deseche el sobrenadante. El sedimento puede ser almacenado a -20 ° C, si LPS no va a ser extraído inmediatamente. </li></ol> 2. Extracción de LPS <ol><li> En primer lugar, preparar 2x tampón SDS. Hacer una solución de 50 ml (BME) 4% β-mercaptoetanol, 4% de SDS y 20% de glicerol en 0,1 M Tris-HCl, pH 6,8. Añadir una pizca de azul de bromofenol para la coloración de la solución. Haga una 1x SDS-tampón de stock de diluir 2X stac 1:1 en agua destilada estéril H 2 O. Esto se puede almacenar a temperatura ambiente. </li><li> Haga tres separadas 10 mg / ml de soluciones de DNasa I, RNasa y proteinasa K en agua destilada estéril H 2 O. </li><li> Resuspender las bacterias sedimentadas desde el paso 1.3 en 200 l de 1x SDS-tampón. Asegurarse de que el sedimento se resuspendió completamente pipeteando la solución arriba y hacia abajo lentamente. No vórtice. </li><li> Hervir las bacterias en suspensión en un baño de agua durante 15 minutos. Dejar que la solución se enfríe a temperatura ambiente durante 15 minutos. </li><li> Añadir 5 l de ambos DNasa I y RNasa soluciones preparadas en 2,2. Se incuban las muestras a 37 ° C durante 30 minutos. * Este paso es opcional, no hay diferencia mínima en la calidad de LPS entre las muestras de nucleasa tratados y no tratados. </li><li> Añadir 10 ml de la solución de proteinasa K preparado en 2,2. Se incuban las muestras a 59 ° C durante 3 horas. Este paso puede realizarse durante la noche, si hay limitaciones de tiempo. </li><li> Para cada muestra, anunciod 200 l de helado de Tris-fenol saturado (agua saturada con fenol puede utilizarse como un sustituto si Tris-fenol saturado no está disponible). Asegúrese de que las tapas de los tubos estén bien cerradas, y cada muestra de vórtice por aproximadamente 5 a 10 segundos. </li><li> Se incuban las muestras a 65 ° C durante 15 minutos, agitación ocasional. Después de incubar enfriar a temperatura ambiente, a continuación, añadir 1 ml de éter dietílico a temperatura ambiente a cada muestra y agitar durante 5 a 10 segundos. Asegúrese de realizar el éter mango en una campana extractora, ya que es volátil. </li><li> Centrifugar las muestras a 20.600 x g durante 10 minutos. Retire con cuidado las muestras de la centrífuga y extraer la capa azul abajo. Asegúrese de evitar la capa superior, claro. Dejando atrás una pequeña cantidad de la capa azul es preferible a la contaminación con la capa superior. </li><li> Vuelva a extraer las muestras repitiendo los pasos 2,7 a 2,9. Dos extracciones suelen ser suficientes. Si las muestras de aspecto turbio, más extracciones pueden ser Realizamosd. Añadir 200 l de SDS-2x tampón a cada una de las muestras extraídas antes de separar por SDS-PAGE. Las muestras se pueden ejecutar en 8% -15% de SDS-geles de poliacrilamida. De cinco a quince l de LPS preparados con este método suele ser suficiente para la visualización. </li></ol> 3. Los resultados representativos LPS muestras preparadas como anteriormente pueden ser visualizadas por tinción directa después de la separación en SDS-PAGE usando un estándar de tinción con plata protocolo o un kit de LPS tinción disponibles comercialmente. Alternativamente, el LPS separados en un gel de poliacrilamida puede ser transferido a una membrana de nitrocelulosa y se sometieron a inmunotransferencia usando LPS-específicos anti-sueros. Para este protocolo, se utilizó el Pro-Q Esmeralda 300 Kit de Gel Stain lipopolisacárido (Molecular Probes), y siguió las instrucciones del fabricante. Se muestra en la Figura 1 es un Pro-Q Esmeralda 300 manchado 12% de SDS-gel de poliacrilamida. Cada carril contiene 15 l de LPS preparados a partir de didiferentes cepas de Burkholderia dolosa aislado de muestras de esputo de los pacientes con fibrosis quística. LPS diferentes patrones de bandas reflectantes escalera, de diferentes números de O-antígeno unidades repetitivas unidos al núcleo oligosacárido, son evidentes con este método, por ejemplo, las muestras en el carril 1 y 6 tienen similares patrones de bandas entre sí (en caja en rojo). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3916/3916fig1.jpg" /> Figura 1. Pro-Q Esmeralda 300 LPS teñidos de Burkholderia dolosa aislamientos clínicos. LPS de siete B. cepas dolosa de un brote en pacientes con fibrosis quística fueron aislados como se describe en este protocolo. Quince l fueron separados en un 12% de SDS-gel de poliacrilamida, y se tiñeron con Pro-Q Esmeralda 300, según las instrucciones del fabricante. LPS central se indica una flecha, y LPS muestran similares patrones de bandas de repeticiones O-antígeno se empacan en cajas de color rojo. M = marcador de peso molecular.

<ol><li>Raetz, C. R., Whitfield, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide+endotoxins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide endotoxins.</a> Annu. Rev. Biochem. 71, 635-700 (2002).</li>
<li>Valvano, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Export+of+O-specific+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Export of O-specific lipopolysaccharide.</a> Front. Biosci. 8, 452-471 (2003).</li>
<li>Pier, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+lipopolysaccharide%3A+a+major+virulence+factor%2C+initiator+of+inflammation+and+target+for+effective+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide: a major virulence factor, initiator of inflammation and target for effective immunity.</a> Int. J. Med. Microbiol. 297, 277-295 (2007).</li>
<li>Freudenberg, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+lipopolysaccharide+susceptibility+in+the+innate+immune+response+to+Salmonella+typhimurium+infection%3A+LPS%2C+a+primary+target+for+recognition+of+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Role of lipopolysaccharide susceptibility in the innate immune response to Salmonella typhimurium infection: LPS, a primary target for recognition of Gram-negative bacteria.</a> Microbes Infect. 3, 1213-1222 (2001).</li>
<li>Jann, K., Jann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysaccharide+antigens+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Polysaccharide antigens of Escherichia coli.</a> Rev. Infect. Dis. 9, Suppl 5. S517-S526 (1987).</li>
<li>McCallum, K. L., Schoenhals, G., Laakso, D., Clarke, B., Whitfield, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-molecular-weight+fraction+of+smooth+lipopolysaccharide+in+Klebsiella+serotype+O1%3AK20+contains+a+unique+O-antigen+epitope+and+determines+resistance+to+nonspecific+serum+killing%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">A high-molecular-weight fraction of smooth lipopolysaccharide in Klebsiella serotype O1:K20 contains a unique O-antigen epitope and determines resistance to nonspecific serum killing.</a> Infect. Immun. 57, 3816-3822 (1989).</li>
<li>Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+isolates+from+patients+with+cystic+fibrosis%3A+a+class+of+serum-sensitive%2C+nontypable+strains+deficient+in+lipopolysaccharide+O+side+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa isolates from patients with cystic fibrosis: a class of serum-sensitive, nontypable strains deficient in lipopolysaccharide O side chains.</a> Infect. Immun. 42, 170-177 (1983).</li>
<li>Gupta, S. K., Masinick, S., Garrett, M., Hazlett, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+lipopolysaccharide+binds+galectin-3+and+other+human+corneal+epithelial+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide binds galectin-3 and other human corneal epithelial proteins.</a> Infect. Immun. 65, 2747-2753 (1997).</li>
<li>Hitchcock, P. J., Brown, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+heterogeneity+among+Salmonella+lipopolysaccharide+chemotypes+in+silver-stained+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Morphological heterogeneity among Salmonella lipopolysaccharide chemotypes in silver-stained polyacrylamide gels.</a> J. Bacteriol. 154, 269-277 (1983).</li>
<li>Westphal, O., Jann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+lipopolysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Carbohyr.+Chem%22%5BJournal%5D)">Bacterial lipopolysaccharides.</a> Methods Carbohyr. Chem. 5, 83(1965).</li>
<li>Lieberman, T. D. Parallel bacterial evolution within multiple patients ties novel genes to pathogenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLieberman%2C+TD+%22Nat+Genet%22">Nat Genet</a>. , Forthcoming (2011).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Hemos descrito un método de purificación de LPS de distancia de otros componentes celulares, incluyendo los ácidos nucleicos y proteínas. Este método proporciona alta calidad de LPS que pueden ser utilizados en un número de métodos de visualización diferentes, incluyendo tinción de carbohidratos de geles de SDS-PAGE, como se muestra en la Figura 1. Este método puede ser utilizado al serotipo LPS de una variedad de cepas, utilizando anticuerpos específicos anti-sueros, o para mostrar la relación entre los aislamientos de...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> DNasa I recombinante, libre de RNasa </td><td> Roche </td><td> 04716728001 </td></tr><tr><td> RNasa A </td><td> Roche </td><td> 10109169001 </td></tr><tr><td> Proteinasa K </td><td> Pescador </td><td> BP1700 </td></tr><tr><td> Tris-fenol saturado </td><td> Pescador </td><td> BP1750-100 </td></tr><tr><td> Éter dietílico </td><td> Thomas Scientific </td><td> C313K31 </td></tr><tr><td> Pro-Q Esmeralda 300 lipopolisacárido Kit de Gel Stain </td><td> Molecular Probes </td><td> P20495 </td></tr></tbody></table>

la purificación y la visualización de lipopolisacárido de bacterias gram-negativas por hot acuosa de fenol-extracción

Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

Lipopolisacárido (LPS) es un componente importante de bacterias Gram-negativas membranas externas de bacterias. Es una molécula tripartito compuesto de lípido A, que está incrustada en la membrana exterior, un núcleo de oligosacáridos y repetición de O-antígeno unidades que se extienden hacia fuera desde la superficie de la célula 1, 2. LPS es una molécula inmunodominante que es importante para la virulencia y patogénesis de muchas especies de bacterias, incluyendo Pseudomonas aeruginosa, especies de Salmonella, Escherichia coli y 3-5, y las diferencias en forma LPS composición antígeno O-la base para serotipado de las cepas. LPS está implicado en la unión a las células huésped en el inicio de la infección y proporciona protección contra la muerte mediada por complemento; cepas que carecen de LPS puede ser atenuada para la virulencia 6-8. Por estas razones, es importante visualizar LPS, particularmente a partir de aislados clínicos. LPS Visualización de los patrones de bandas y el reconocimiento por una específicantibodies pueden ser herramientas útiles para identificar linajes de tensión y para caracterizar distintos mutantes. En este informe, se describe un acuosa caliente-fenol método para el aislamiento y purificación de LPS de bacterias Gram-negativas células bacterianas. Este protocolo permite la extracción de LPS de distancia a partir de ácidos nucleicos y proteínas que pueden interferir con la visualización de LPS que se produce con más cortos, los métodos de extracción menos intensivas 9. LPS preparado de esta manera se pueden separar por dodecil sulfato sódico (SDS)-poliacrilamida electroforesis en gel (PAGE) y se tiñeron utilizando directamente carbohidrato / glicoproteína manchas o estándar métodos de tinción de plata. Muchos anti-sueros a LPS contienen anticuerpos que reaccionan de forma cruzada con las proteínas de membrana externa u otros objetivos antigénicos que pueden obstaculizar la reactividad observados después de inmunotransferencia Western de SDS-PAGE-separados lisados ​​celulares crudos. Tratamiento de la proteasa de lisados ​​celulares crudos por sí solos no siempre es una manera eficaz de eliminar estede fondo de usar este u otros métodos de visualización. Además, el tratamiento de la proteasa extensa en un intento de eliminar este fondo puede llevar a LPS de baja calidad que no está bien resueltas por cualquiera de los métodos antes mencionados. Por estas razones, creemos que el protocolo siguiente, adaptado de Westpahl y Jann 10, es ideal para la extracción de LPS.

Se describe una modificación acuosa caliente-fenol método de extracción para la purificación de lipopolisacárido (LPS) de bacterias Gram-negativas. Una vez extraído, el LPS puede ser seguidamente analizadas por SDS-PAGE y se visualizaron mediante tinción directa o inmunotransferencia Western.

La purificación y la visualización de lipopolisacárido de bacterias Gram-negativas por Hot acuosa de fenol-Extracción

El lipopolisacárido (LPS) es un componente principal de las membranas externas de las bacterias Gram negativas. Es una molécula tripartita que consta de lípido A, el cual es...

El objetivo general de este procedimiento es extraer LPS de bacterias Gram-negativas. Esto se logra primero cultivando un caldo de cinco mililitros de bacterias durante la noche en un medio adecuado y ajustando la densidad óptica del cultivo a 600 nanómetros a 0,5. A continuación, las bacterias se sedimentan mediante microcentrifugación y las células se resuspenden en un tampón tris que contiene SDS y beam o etanol capto.Luego, los lisados celulares se someten a ebullición y se tratan con proteasa y nucleasa. Finalmente, se realizan dos extracciones secuenciales con fenol acuoso caliente y éter dietílico, eliminando cuidadosamente y conservando la capa acuosa azul. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran la cantidad y la presencia o ausencia de LPS y cepas bacterianas, así como la modalidad de la longitud de la cadena del antígeno O, mediante separación por electroforesis SDS-PAGE y análisis western blot con anticuerpos específicos para LPS o tinción directa de los polisacáridos en el gel.La ventaja de esta técnica en comparación con el tratamiento con proteasa de Hitchcock y Brown es que este método produce muestras de LPS puras que pueden separarse mejor me

purification-visualization-lipopolysaccharide-from-gram-negative

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Fuente: Armbruster, K. M., Meredith, T. C. Enriquecimiento de lipoproteínas bacterianas y preparación de lipopéptidos N-terminales para la determinación estructural por espectrometría de masas. J. Vis. Exp. (2018)Este video demuestra el enriquecimiento de lipoproteínas bacterianas utilizando un detergente no iónico que se somete a separación de fases al calentarse. A través de cambios secuenciales de temperatura y pasos de centrifugación, las lipoproteínas se dividen selectivamente en la fase...

Enriquecimiento de lipoproteínas bacterianas mediante separación de fases con detergente no iónico

Fuente: Hu, Y., et al. Análisis de las interacciones entre endobióticos y microbiota intestinal humana utilizando sistemas de fermentación in vitro en baños. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demuestra el uso de la cromatografía de capa delgada (TLC) para evaluar la degradación de exopolisacáridos (EPS) por la microbiota fecal humana. Los fragmentos de EPS en los sobrenacionantes de fermentación se separan según su tamaño y polaridad usando TLC, y luego se visualizan como bandas de colores tras una...

Realización de cromatografía de capa delgada para evaluar la degradación de exopolisacáridos bacterianos

Este video muestra la separación de ácidos micólicos basada en cromatografía de capa fina. Esta técnica separa los diferentes ácidos micólicos (lípidos de cadena larga presentes en la pared celular de las micobacterias) en función de su polaridad.

Separación de variantes de ácido micólico basada en cromatografía de capa fina: un método para separar los lípidos de la pared celular micobacteriana en función de la polaridad

Aislamiento y caracterización del dominio lípido A del lipopolisacárido (LPS) de las bacterias gram-negativas proporciona información sobre los mecanismos de la superficie celular a base de resistencia a los antibióticos, la supervivencia bacteriana y la forma física, y cómo químicamente diversa lípido A las especies moleculares modulan diferencialmente acogida la respuesta inmune innata.

Aislamiento y Caracterización química del lípido A de bacterias gram-negativas

La pared celular bacteriana está compuesta de peptidoglicano, una red macromolecular de hebras de azúcar reticuladas por péptidos. La cromatografía líquida de ultra rendimiento proporciona alta resolución y rendimiento para nuevos descubrimientos de la composición de peptidoglicanos. Presentamos un procedimiento para el aislamiento de las paredes celulares (sacculi) y su posterior preparación para su análisis a través de UPLC.

Aislamiento Y Preparación De Paredes Celulares Bacterianas Para El Análisis Compositiva Por Cromatografía Líquida De Ultra Rendimiento

ácidos grasos de fosfolípidos proporcionan información sobre la estructura de las comunidades microbianas del suelo. Presentamos métodos para la extracción de muestras de suelo con una mezcla de fase única de cloroformo, el fraccionamiento de los lípidos extraídos usando columnas de extracción en fase sólida, y metanolisis para producir ésteres metílicos de ácidos grasos, que se analizan por cromatografía de gases capilar.

Extracción y análisis de ácidos grasos de fosfolípidos microbiana en suelos

El enriquecimiento de lipoproteínas bacterianas con una fase de tensioactivo no iónico, método de partición se describe para su uso directo en los ensayos de TLR u otras aplicaciones. Otras medidas se detallan para preparar N-terminal tríptico lipopéptidos caracterización estructural por espectrometría de masas.

Enriquecimiento de lipoproteínas bacterianas y preparación de lipopéptidos N-terminal para la determinación estructural por espectrometría de masas

Las bacterias gramnegativas producen dos membranas segregadas espacialmente. La membrana externa se divide a partir de la membrana interna por una periplasma y una capa de peptidogglicano. La capacidad de aislar las bicapas duales de estos microbios ha sido fundamental para entender su fisiología y patogénesis.

Separación del sobre celular para bacterias gramnegativas en fracciones de membrana interna y externa con ajustes técnicos para Acinetobacter baumannii

Este protocolo cubre un análisis detallado de la composición de peptidoglicanos utilizando espectrometría de masas de cromatografía líquida junto con extracción avanzada de características y software de análisis bioinformático.

Análisis semicuantitativo de peptidoglicano por cromatografía líquida, espectrometría de masas y bioinformática

Se presenta un protocolo para extraer el contenido total de lípidos de la pared celular de una amplia gama de micobacterias. Además, se muestran protocolos de extracción y análisis de los diferentes tipos de ácidos micólicos. También se proporciona un protocolo cromatográfico de capa delgada para monitorear estos compuestos micobacterianos.

Análisis de la composición lipídica de micobacterias por cromatografía de capa delgada

Los gangliósidos son glicoesfingolípidos portadores de ácido siálico que son particularmente abundantes en el cerebro. Su naturaleza anfipática requiere técnicas de extracción y purificación orgánicas / acuosas para garantizar una recuperación óptima y análisis precisos. Este artículo proporciona información general sobre la extracción de gangliósidos a escala analítica y preparativa, la purificación y el análisis de cromatografía de capa delgada.

Extracción, purificación y perfilado de gangliósidos

Aprende a purificar lipopolisacárido de bacterias Gram-negativas mediante extracción con fenol acuoso caliente. Este método permite analizar LPS por SDS-PAGE y Western blot para estudios de patogénesis bacteriana.

La purificación y la visualización de lipopolisacárido de bacterias Gram-negativas por Hot acuosa de fenol-Extracción

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