La purificación y la visualización de lipopolisacárido de bacterias Gram-negativas por Hot acuosa de fenol-Extracción

El objetivo general de este procedimiento es extraer LPS de bacterias Gram-negativas. Esto se logra cultivando primero un cultivo nocturno de bacterias de cinco mililitros en un medio apropiado y ajustando el cultivo a una densidad óptica de 600 nanómetros de 0,5. A continuación, la bacteria se granula por microcentrifugación y las células se resuspenden en un tampón tris que contiene SDS y etanol de haz o capto.

A continuación, los lisados celulares se hierven y se tratan con proteasa y nucleasa. Finalmente, se realizan dos extracciones secuenciales con fenol acuoso caliente y éter dil para eliminar y retener cuidadosamente la capa acuosa azul. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran la cantidad, así como la presencia o ausencia de LPS y cepas de bacterias, así como la modalidad de longitud de la cadena del antígeno O mediante separación por página SDS y análisis de sangre occidental con anticuerpos específicos de LPS o tinción directa de los polisacáridos en el gel.

La ventaja de esta técnica en comparación con el tratamiento con proteasas de Hitchcock y Brown es que esta técnica conduce a muestras de LPS puras que pueden resolverse mejor mediante SDS, page y western blot. Este método puede proporcionar información sobre la síntesis y regulación de lipopolisacáridos en VIR en prácticamente cualquier bacteria gramnegativa, incluidas E. coli y salmonella, así como biodefensa y patógenos emergentes como Ella y Acetobacter respectivamente para cultivar bacterias. Para la extracción de LPS, establezca un cultivo nocturno de bacterias gramnegativas en cinco mililitros de LB suplementado con antibióticos.

Si es necesario, cultive el cultivo durante la noche en una incubadora agitadora a 200 RPM y 37 grados Celsius. Use LB para diluir el cultivo del uno al 10 y luego mida la densidad óptica a 600 nanómetros en función del resultado. Prepare una suspensión de 1,5 mililitros de las bacterias con una densidad óptica final de 600 nanómetros de 0,5.

Granule las bacterias en una microcentrífuga a 10, 600 veces G durante 10 minutos. A continuación, retire y deseche el sobrenadante. Para extraer LPS, prepare las siguientes soluciones, un tampón XSDS, 4%betta me capto etanol o BME 4%SDS, y 20%glicerol en tris HCL 0.1 molar pH 6.8 con una pizca de azul de bromo fenol y 10 miligramos por mililitro de soluciones de ARN de ADN uno y proteinasa K en agua destilada estéril resuspender.

Las bacterias peletizadas en 200 microlitros de un tampón XSDS aseguran que el pellet se resuspenda completamente pipeteando la solución hacia arriba y hacia abajo. Hervir lentamente las bacterias suspendidas en un baño de agua durante 15 minutos. Luego deje que la solución se enfríe a temperatura ambiente durante 15 minutos.

Como paso opcional, agregue cinco microlitros de cada una de las soluciones de ADN y ARN e incube las muestras a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Añadir 10 microlitros de la solución de proteasa K e incubar las muestras a 59 grados centígrados durante tres horas. Al lado de cada muestra, agregue 200 microlitros de tris helado, fenol saturado.

Cierre las tapas herméticamente y agite cada tubo durante cinco a 10 segundos. Incubar las muestras a 65 grados centígrados durante 15 minutos. Vórtice, ocasionalmente enfríelos a temperatura ambiente.

Luego, debajo de una campana extractora, agregue un mililitro de éter etílico a temperatura ambiente a cada muestra y vórtice durante cinco a 10 segundos. Centrifugar las muestras a 20, 600 veces G durante 10 minutos y retirarlas con cuidado de la centrífuga. Extraiga la capa azul inferior de cada muestra, evitando la capa superior transparente.

Agregue 200 microlitros adicionales de tris helado, fenol saturado, y repita la extracción en cada tubo. Agregue 200 microlitros de dos tampones XSDS. Separe de cinco a 15 microlitros de cada muestra de LPS en geles de poliacrilamida de ocho a 15% SDS.

Aquí se muestra un gel de página de 12%SDS de muestras de LPS preparado a partir de diferentes cepas de bur cold area de losa, aisladas de muestras de esputo de pacientes con fibrosis quística. Los diferentes patrones de bandas reflejan los diferentes números de antígeno O, unidades repetidas unidas a los oligosacáridos centrales. Un número similar de unidades repetidas se puede ver en las muestras uno y seis.

No olvide que trabajar con éter de fenol datilo puede ser peligroso en precauciones como el uso de equipo de protección personal y protección, como una bata de laboratorio, guantes y gafas, y estos experimentos deben realizarse en una campana extractora mientras se intenta este procedimiento. Es importante realizar las extracciones rápidamente para no perder las muestras durante el procesamiento. Después de este procedimiento, se debe realizar inmunotransferencia occidental o métodos para visualizar el lipopolisacárido por STR de plata u otros métodos para visualizar la relación entre las cepas.