El uso de tejidos no fijadas, congeladas para estudiar la distribución de mucina Natural

Muestras de tejido congeladas no fijadas embebidas en un medio de temperatura óptima de corte (OCT) se puede utilizar para estudiar la distribución natural y glicosilación de moco secretado. En este enfoque de procesado de tejido es mínima y la presentación natural de glicolípidos, mucinas y glycan epítopos-se conserva. Las secciones de tejido pueden ser analizadas por inmunohistoquímica usando detección de fluorescencia o cromogénico.

El objetivo general del siguiente experimento es preservar la distribución natural de la glicosilación de la mucosidad secretada en las muestras de tejido. Esto se logra primero incrustando los tejidos en una temperatura de corte óptima, media u OCT para minimizar el procesamiento de tejidos, y luego para permitir la detección de estructuras de glicanos, mucina y moco. Las secciones se incuban con lectinas, anticuerpos y tinciones histoquímicas.

La unión a la lectina puede ser desafiada aún más por la inhibición competitiva o la escisión enzimática de los epítopos de glicanos para confirmar la especificidad de la unión a la lectina. En última instancia, la conservación de muestras de moco y tejido congelado puede compararse con la conservación de la mucosidad en muestras incluidas en parafina mediante el análisis químico místico. Las principales ventajas de utilizar esta técnica sobre los métodos existentes, como la inclusión de tejido en paren y la fijación con solución de ruido de coche, son que este método no requiere el uso de fijadores especializados y permite la utilización de tejidos congelados que ya pueden estar existentes en el laboratorio.

Para comenzar, deje que el tejido congelado se caliente a menos 20 grados centígrados colocándolo en una cámara de criomicrótomo. Mientras tanto, cree un baño de congelación agregando dos metilbutano a una caja de espuma de poliestireno poco profunda y luego agregue hielo seco a la caja. A continuación, agregue suficiente OCT para cubrir el fondo de un molde de congelación despegable y luego coloque el pañuelo en el molde.

Asegúrese de que el tejido descanse en el fondo del molde en la orientación deseada. Cubra el pañuelo con más OCT y luego coloque el molde en el baño de congelación. El compuesto OCT se volverá blanco a medida que el tejido se congele Una vez congelado, retire el molde del bloque congelado y colóquelo en una bolsa para congelador marcada.

Guarde los bloques congelados a menos 80 grados centígrados hasta que los use antes de seccionar el tejido. Coloque los bloques congelados de interés en la cámara de criomicrótomo durante unos 30 minutos para permitir que alcancen los 20 grados centígrados bajo cero. Cuando los bloques de calor, corte una sección de tres a cinco micrómetros de espesor y luego coloque un portaobjetos de vidrio cargado positivamente en la parte superior de la sección.

El pañuelo se adherirá al portaobjetos después de secar los pañuelos al aire durante 30 a 60 minutos. Fije los portaobjetos con fórmula tamponada al 10% durante 30 minutos a temperatura ambiente, y luego lave los portaobjetos tres veces en PB PBS con 10 inmersiones rápidas en 250 mililitros de tampón para teñir los tejidos con aum. Primero enjuague los portaobjetos con agua y luego incube en ácido acético al 3% durante tres minutos.

Luego incube los tejidos con la solución azul AUM Después de 30 minutos, lave los portaobjetos con agua corriente del grifo durante 10 minutos y luego enjuague con agua desionizada. Teña los núcleos con rojo nuclear rápido durante cinco minutos y luego lava los portaobjetos tres veces con agua desionizada. Ahora deshidrate y limpie los portaobjetos incubando durante un minuto en etanol al 95%, seguido de tres cambios rápidos en etanol al 100%, y luego tres cambios en la resolución de cítricos durante dos minutos cada uno.

Por último, monte un cubreobjetos en el portaobjetos con un medio de resonancia como cyto seal 60 para teñir los tejidos con desplazamiento de ácido peryódico. Primero, enjuague los portaobjetos con agua y luego incube con ácido 1% periódico recién preparado durante cinco minutos. Ahora, lave los portaobjetos tres veces en di agua.

Sumerja los portaobjetos una vez en agua Milli Q y luego tiña los tejidos con reactivo de shiff. Después de 15 minutos, lave los portaobjetos en agua corriente, del grifo durante otros 10 minutos y luego sumérjalos una vez en el agua. Contratiña los núcleos con sgiometin durante 30 segundos y luego lava los portaobjetos tres veces con agua desionizada.

Finalmente, incuba los portaobjetos durante 30 segundos. En el reactivo azulado con agua del grifo de Scot, lávese tres veces más en agua desionizada y luego después de deshidratar los tejidos como se acaba de mostrar para la tinción de azul de calcio. Monte los portaobjetos con un cubreobjetos para la detección de fluorescencia de epítopos de glicanos mediante lectinas.

Primero, bloquee la diapositiva con BSA en PBS durante 10 a 30 minutos. A continuación, bloquee la biotina endógena incubando el portaobjetos durante 15 minutos con avadon, seguido de un lavado con PBS y, a continuación, una incubación de 15 minutos con biotina al 0,01% después de otro lavado con PBS. Coloque el portaobjetos en una caja de tinción sobre cada sección de tejido y cubra suavemente la mezcla de lectinas con perfume.

Ahora incuba el portaobjetos en la oscuridad después de una hora. Retire suavemente el perfume y lave el portaobjetos tres veces con PBS. A continuación, coloque capas el portaobjetos con estreptococos ávidos en SCI conjugado cinco y recíprolo en la oscuridad una vez más después de 30 minutos, lave los portaobjetos tres veces con PBS y luego contratiña los núcleos con dappy.

Finalmente, monte el portaobjetos con un cubreobjetos utilizando un medio acuoso como un medio de montaje vectorial para el control de la enzima sasa. Comience agregando agua al fondo de una caja de propinas vacía para formar una cámara húmeda. Coloque las correderas de control negativo boca arriba en la bandeja superior de la caja de puntas.

Aplique una capa de 150 a 200 microlitros de una solución de US en las secciones de tejido y luego cubra cada portaobjetos con un cubreobjetos, evitando la formación de burbujas de aire. Cierre la tapa de la caja e incube la caja a 37 grados centígrados después de dos horas y media. Lave los portaobjetos tres veces en PBS a temperatura ambiente para eliminar los ácidos libres.

A continuación, incubar los portaobjetos con SNA durante una hora a temperatura ambiente para la inhibición competitiva. Control de 200 microlitros de la mezcla de lectina a dos viales de einor. A continuación, añada 200 milimolares del inhibidor de la jacquelina Meli bios a uno de los viales, y añada el hidrolizado de quitina inhibidor de SWGA en una dilución de uno a 10 en el otro vial.

A continuación, incubar los portaobjetos con el inhibidor que contiene mezclas durante una hora a temperatura ambiente. En este primer tejido de la figura, secciones de especímenes de comino de ratón o colon de pollo congelados en OCT o incrustados en parafina se tiñeron con shiff de ácido peryódico en rosa o azul de calcio en azul. Una comparación entre las muestras de tejido incrustadas en parafina con los tejidos congelados incrustados en medios crioprotectores OCT reveló diferencias sorprendentes en la conservación y la calidad de la tinción de las glicoproteínas de mucina en los tejidos congelados.

Además de la mucina en las células caliciformes, la mucosidad secretada también era visible, como lo indican las flechas en los tejidos incrustados en parafina. La tinción de moco se limitó a las células caliciformes. En esta figura se puede observar la pérdida sustancial de mucina y tejidos incubados en los cítricos.

Las secciones seriadas de muestras de íleon de pollo congeladas se fijaron en formina tamponada al 10% y se mantuvieron hidratadas, deshidratadas en etanol por incubación secuencial en etanol al 70%90% y 100% de etanol durante 20 minutos cada una, o deshidratadas en etanol y luego aclaradas con cítricos, todo durante una hora. La deshidratación con etanol solo y la deshidratación con etanol más la eliminación de cítricos mejoraron la morfología de los tejidos. La deshidratación adicional con etanol por sí sola no tuvo un efecto significativo sobre la tinción azul.

Por el contrario, la incubación de los cítricos redujo y confinó la tinción azul a las células caliciformes en un patrón similar al observado para los tejidos incluidos en parafina vistos en la figura anterior. Los recuadros indican las áreas de mayor aumento en las secciones de tejido de tinción con azul de allium. En esta siguiente serie de imágenes, se muestran en tejidos congelados muestras de íleon de pollo congeladas en OCT o incrustadas en parafina y luego sondeadas con Jacqueline en azul, SWG en verde y SNA en rojo.

La unión de Jacqueline a los glicanos olink reveló estructuras que parecían estar rezumando de las células caliciformes hacia el lumen, como lo indican las flechas en la sección de tejido congelado OCT. Por el contrario, la unión de Jacqueline a los tejidos incluidos en parafina se limitó a las células caliciformes y al borde del cepillo de vellosidades indicado por estas flechas. La tinción con SWGA de beta uno cuatro GL se colocaliza parcialmente con la unión de la lectina Jacqueline tanto en tejidos congelados como en tejidos incluidos en parafina, como indican las flechas.

Por el contrario, la lectina SNA en rojo e indicada por las puntas de flecha se une intracelularmente a los ácidos siálicos alfa dos seis unidos y no se colocaliza con Jacqueline, que es azul y se indica con las flechas punteadas en esta figura. Los epítopos de ácido cortante se escindieron de muestras de íleon de pollo al digerir la sección de tejido con un US o se dejaron escindidos mediante incubación y tampón de acetato de sodio, como se ve aquí. El tratamiento con US abolió la tinción con SNA biotinilado que se observa en el tejido no tratado, lo que confirma la especificidad de la unión del SNA a los ácidos siálicos.

La especificidad de la lectina también puede confirmarse mediante la adición de un inhibidor competitivo como mely bios para la tinción con Jacqueline o hidrolizado de quitina para la tinción con SWGA. Las muestras de íleon de pollo, una vez más, se incubaron con una mezcla de Jacqueline y SWGA. Esta vez también en presencia de inhibidores específicos de lectina, mely bios o hidrolizado de quitina La tinción de Jacqueline fue inhibida por mely bios, pero no por hidrolizado de quitina. Por el contrario, la tinción de SWGA fue inhibida por el hidrolizado de quitina, pero no por Mely Bios.

Esta última serie de imágenes demuestra que las muestras de tejido congelado, que se obtienen de forma rutinaria en la clínica y en los laboratorios de investigación, pueden incorporarse aún más en la OCT y utilizarse para estudiar los glicanos de la mucina, las glicoproteínas, los glicolípidos y los glicanos. Estas biopsias de cáncer colorrectal de tejidos de carcinoma vellosítico y carcinoma mucoso se congelaron en nitrógeno líquido incrustado en OCT y se tiñeron con éxito para los diversos epítopos de mucina y glicanos indicados. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo incrustar tejidos en OCT y cómo analizar la mucosidad y la glicosilación de tejidos utilizando métodos inmunoquímicos.