El uso de tejidos no fijadas, congeladas para estudiar la distribución de mucina Natural

El objetivo general del siguiente experimento consiste en preservar la distribución natural de la glicosilación del moco secretado en muestras de tejido. Esto se logra primero incrustando los tejidos en medio de temperatura óptima para corte u OCT para minimizar el procesamiento del tejido, y luego permitir la detección de estructuras de glicanos, mucinas y moco. Las secciones se incuban con lectinas, anticuerpos y coloraciones histoquímicas.

La unión de lectinas puede evaluarse además mediante inhibición competitiva o escisión enzimática de epítopos de glicanos para confirmar la especificidad de la unión de lectinas. En última instancia, la conservación del moco y de muestras de tejido congelado puede compararse con la conservación del moco en muestras incluidas en parafina mediante análisis químico místico. Las principales ventajas de utilizar esta técnica frente a métodos existentes, como la inclusión del tejido en pares y la fijación con solución de car ruido, son que este método no requiere el uso de fijadores especializados y permite la utilización de tejidos congelados que ya podrían existir en el laboratorio.

Para comenzar, permita que el tejido congelado rápidamente se caliente hasta menos 20 grados Celsius colocándolo en una cámara de microtomo criogénico. Mientras tanto, prepare un baño de congelación añadiendo dos butano metílico a una caja de espuma de poliestireno poco profunda y luego agregue hielo seco a la caja. A continuación, añada solo la cantidad suficiente de OCT para cubrir el fondo de un molde de congelación desprendible, y luego coloque el tejido en el molde.

Asegúrese de que el tejido descanse sobre el fondo del molde en la orientación deseada. Cubra el tejido con más OCT y luego coloque el molde en el baño de congelación. El compuesto OCT se volverá blanco a medida que el tejido se congele. Una vez congelado, retire cuidadosamente el molde del bloque congelado y coloque el bloque en una bolsa de congelación marcada.

Almacene los bloques congelados a menos 80 grados Celsius hasta su uso, antes de seccionar el tejido. Coloque los bloques congelados de interés en la cámara del microtomo criogénico durante aproximadamente 30 minutos para permitir que alcancen menos 20 grados Celsius. Cuando los bloques alcancen la temperatura adecuada, corte una sección de tres a cinco micrómetros de grosor y luego coloque un portaobjetos de vidrio cargado positivamente encima de la sección.

El tejido se adherirá al portaobjetos tras secar al aire los tejidos durante 30 a 60 minutos. Fije los portaobjetos con solución amortiguadora al 10 % durante 30 minutos a temperatura ambiente, y luego lave los portaobjetos tres veces en PB PBS mediante 10 inmersiones rápidas en 250 mililitros de tampón para teñir los tejidos con aum. Primero en azul, enjuague los portaobjetos con agua y luego incube en ácido acético al 3 % durante tres minutos.

Luego, incubar los tejidos con la solución azul AUM. Después de 30 minutos, lavar las laminillas con agua corriente del grifo durante 10 minutos y luego enjuagar con agua desionizada. Contratñir los núcleos con rojo nuclear rápido durante cinco minutos y después lavar las laminillas tres veces con agua desionizada. A continuación, deshidratar y aclarar las laminillas incubando durante un minuto en etanol al 95 %, seguido de tres cambios rápidos en etanol al 100 % y luego tres cambios en citrus resolve durante dos minutos cada uno.

Finalmente, monte un cubreobjetos sobre el portaobjetos con un medio de resonancia como cyto seal 60 para teñir los tejidos con ácido periódico de Schiff. En primer lugar, enjuague los portaobjetos con agua y luego incube con ácido periódico al 1 % recién preparado durante cinco minutos. A continuación, lave los portaobjetos tres veces con agua desionizada.

Sumerja las laminillas una vez en agua Milli Q y luego tiña los tejidos con el reactivo de Schiff. Después de 15 minutos, lave las laminillas con agua corriente del grifo durante otros 10 minutos y luego sumérjalas una vez en agua DI. Contratiña los núcleos con metilo verde SGIO durante 30 segundos y luego lave las laminillas tres veces en agua DI.

Finalmente, incubar las laminillas durante 30 segundos. En el reactivo azulante Scot's tap water, lavar tres veces más en agua DI y luego deshidratar los tejidos como se acaba de indicar para la tinción con azul de calcio. Montar las laminillas con un cubreobjetos para la detección de epítopos de glicanos mediante lectinas por fluorescencia.

Primero, bloquee el portaobjetos con BSA en PBS durante 10 a 30 minutos. Luego bloquee la biotina endógena incubando el portaobjetos durante 15 minutos con avadon, seguido de un lavado con PBS, y posteriormente una incubación de 15 minutos con biotina al 0,01 % tras otro lavado con PBS. Coloque el portaobjetos en una caja de tinción, agregue una mezcla recién preparada de las lectinas deseadas sobre cada sección de tejido, y luego cubra suavemente la mezcla de lectinas con parfum.

Ahora incube la preparación en la oscuridad tras una hora. Retire cuidadosamente el parfum y lave la preparación tres veces con PBS. A continuación, cubra la preparación con strep avid conjugado SCI cinco e incube nuevamente en la oscuridad tras 30 minutos, lave las preparaciones tres veces con PBS y luego contratiña los núcleos con dappy.

Finalmente, monte el portaobjetos con una cubierta utilizando un medio acuoso, como el medio de montaje vector mount, para el control de la enzima sase. Comience agregando agua en la parte inferior de una caja de puntas vacía para formar una cámara húmeda. Coloque los portaobjetos de control negativo con la cara hacia arriba en la bandeja superior de la caja de puntas.

Coloque de 150 a 200 microlitros de una solución US sobre las secciones de tejido y luego cubra cada portaobjetos con una laminilla, evitando la formación de burbujas de aire. Cierre la tapa de la caja e incube la caja a 37 grados Celsius durante dos horas y media. Lave las laminas tres veces en PBS a temperatura ambiente para eliminar los ácidos slic libres.

Luego, incubar las laminillas con SNA durante una hora a temperatura ambiente para la inhibición competitiva. Distribuir alícuotas de 200 microlitros de la mezcla de lectina en dos viales einor. A continuación, añadir 200 milimolares del inhibidor Jacqueline Meli bios a uno de los viales, y añadir el inhibidor SWGA, hidrolizado de quitina, en una dilución de uno a 10 al otro vial.

Luego, incube los portaobjetos con las mezclas que contienen el inhibidor durante una hora a temperatura ambiente. En esta primera figura de tejido, secciones de colon de ratón o de pollo incluidas en OCT o embebidas en parafina fueron teñidas con ácido periódico de Schiff en color rosa o con azul de calcio en azul. Una comparación entre muestras de tejido embebidas en parafina y tejidos congelados embebidos en medio crioprotector OCT reveló diferencias notables en la conservación y calidad de la tinción de las mucinas glucoproteicas en los tejidos congelados.

Además de la mucina en las células caliciformes, el moco secretado también era visible, tal como indican las flechas en los tejidos incluidos en parafina. La tinción de moco se limitó a las células caliciformes. En esta figura, se puede observar la considerable pérdida de mucina y de tejidos incubados en citrato.

Secciones seriadas de especímenes congelados de íleon de pollo se fijaron en formalina tamponada al 10% y se mantuvieron hidratadas, deshidratadas en etanol mediante incubación secuencial en etanol al 70%, 90% y 100% durante 20 minutos cada una, o deshidratadas en etanol y luego aclaradas con citrus all durante una hora. La deshidratación con etanol sola y la deshidratación con etanol seguida de aclaramiento con citrus all mejoraron la morfología del tejido. Una deshidratación adicional con etanol por sí sola no tuvo un efecto significativo sobre la tinción azul.

En contraste, en todos los cítricos la incubación redujo la coloración azul y la limitó a las células caliciformes, en un patrón similar al observado en los tejidos incluidos en parafina que se muestran en la figura anterior. Los cuadros indican las áreas de mayor magnificación en las secciones teñidas con azul de alumbre. En esta siguiente serie de imágenes, se muestran especímenes de íleon de pollo congelados en OCT o incluidos en parafina, y luego marcados con Jacqueline en azul, SWG en verde y SNA en rojo, en tejidos congelados.

La unión de Jacqueline a los glicanos Olink reveló estructuras que parecían estar siendo segregadas desde las células caliciformes hacia la luz, tal como indican las flechas en la sección de tejido congelado OCT. En contraste, la unión de Jacqueline a los tejidos incluidos en parafina se limitó a las células caliciformes y al borde en cepillo de las vellosidades, indicado por estas flechas. La tinción con SWGA de beta uno cuatro GL se localiza parcialmente de forma coincidente con la unión de la lectina Jacqueline tanto en tejidos congelados como en tejidos incluidos en parafina, tal como indican las flechas.

En contraste, la lectina SNA en rojo y señalada por las cabezas de flecha se une intracelularmente a ácidos siálicos alfa dos seis enlazados y no co-localiza con Jacqueline, que aparece en azul y se indica con flechas punteadas en esta figura. Los epítopos de ácido siálico se eliminaron de muestras de íleon de pollo mediante la digestión de la sección de tejido con una US o se dejaron sin eliminar mediante incubación en tampón de acetato de sodio, como se observa aquí. El tratamiento con US abolió la tinción con SNA biotinilada que se observa en el tejido no tratado, confirmando la especificidad de unión de SNA a los ácidos siálicos.

La especificidad de las lectinas también se puede confirmar mediante la adición de un inhibidor competitivo, como mely bios para la tinción con Jacqueline o hidrolizado de quitina para la tinción con SWGA. Una vez más, se incubaron muestras de íleon de pollo con una mezcla de Jacqueline y SWGA, esta vez también en presencia de inhibidores específicos de lectinas: mely bios o hidrolizado de quitina. La tinción con Jacqueline fue inhibida por mely bios, pero no por el hidrolizado de quitina. A la inversa, la tinción con SWGA fue inhibida por el hidrolizado de quitina, pero no por mely bios.

Esta serie final de imágenes demuestra que muestras de tejido congeladas rápidamente, que se obtienen rutinariamente en la clínica y en laboratorios de investigación, pueden ser embebidas adicionalmente en OCT y utilizadas para estudiar glicanos en mucinas, glicoproteínas, glicolípidos y glicanos. Estas biopsias de cáncer colorrectal procedentes de tejidos de carcinoma velloso y carcinoma mucinoso fueron congeladas rápidamente en nitrógeno líquido, embebidas en OCT y teñidas exitosamente para diversos epítopos de mucinas y glicanos indicados. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo embeber tejidos en OCT y cómo analizar la mucosidad y la glicosilación tisular utilizando métodos inmunoquímicos.