Bioensayo electroantenográfico como herramienta de detección de compuestos volátiles de las plantas hospederas

El objetivo general de este procedimiento es cribar rápidamente un gran número de volátiles de plantas hospederas en busca de actividad biológica potencial. Esto se logra primero recolectando y analizando mediante GCMS los volátiles de la planta hospedera de interés. Luego, se identifican y verifican los componentes químicos.

El tercer paso consiste en analizar los componentes individuales en réplicas suficientes para determinar su bioactividad mediante análisis electrográficos. El paso final es formular y evaluar mezclas de los componentes activos. En última instancia, los resultados pueden proporcionar una serie reducida de componentes o una mezcla de componentes lista para investigaciones posteriores en estudios conductuales con el insecto de interés.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como los estudios conductuales intensivos en tiempo, es que el cribado rápido mediante análisis electrográficos disminuye significativamente la cantidad de compuestos que deben seleccionarse para otros estudios que demuestran un procedimiento. ¿Es el Sr. Wage un técnico de mi laboratorio? Una vez que los compuestos volátiles relevantes hayan sido identificados mediante cromatografía de gases y espectrometría de masas, es posible realizar primero un análisis de electroiconografía o EAG de cada compuesto volátil disponible.

Sin embargo, es necesario preparar los volátiles disponibles. Prepare una solución de cada compuesto volátil en pentano a una concentración de cinco miligramos por mililitro en un recipiente que pueda sellarse herméticamente y almacenarse a cuatro grados Celsius. A continuación, prepare las pipetas de estímulo.

Etiquete 10 pipetas Pasteur por cada compuesto volátil y envuelva sus puntas con un pequeño trozo de parafina. Un conjunto de 10 pipetas es suficiente para entregar el compuesto volátil a cada sexo en una prueba preliminar con un número bajo de réplicas. Ahora alinee el conjunto restante de cinco pipetas en un soporte para pipetas y coloque un disco de bioensayo en el extremo abierto de cada pipeta.

Doble suavemente un disco con pinzas y colóquelo parcialmente en el extremo grande de la pipeta de modo que dos o tres milímetros del disco queden expuestos. Utilizando una pipeta o jeringa, cargue 10 microlitros de solución volátil sobre cada disco. Es extremadamente importante calcular, formular y preparar correctamente las soluciones para garantizar réplicas consistentes.

Deje transcurrir dos minutos y luego empuje completamente los discos dentro de sus pipetas. Una vez cargadas, selle inmediatamente cada pipeta con parafina. Repita esta preparación de pipetas para el número deseado de réplicas.

Utilizando el mismo protocolo, prepare un control negativo con solo pentanos y controles positivos, en este caso acetofenona y hormona sexual. Ahora continúe con la preparación de las antenas de insecto.

En este experimento, un preamplificador transmite la señal desde un electrodo en horquilla hasta el instrumento de adquisición de EAG. El software proporcionado con el instrumento de EAG debe configurarse adecuadamente en el software. Configure los ajustes estableciendo primero la frecuencia de muestreo en 106,7.

Establezca el conmutador de rectificación en "conocido" y configure el filtro en cero a 42 hercios en la pestaña de filtro. Active el filtro EAG y establezca el corte inferior en 0,1 hercios. Luego guarde la configuración en un archivo de configuración para su uso futuro.

El funcionamiento del programa es tan sencillo como abrir un archivo de proyecto nuevo, guardarlo con un nombre específico y proceder con la grabación. El icono de triángulo rojo inicia el proceso de grabación y permanece activo durante un tiempo predeterminado para cada soplo individual. Cuando se han realizado todos los soplos para las antenas, el icono de equis negro detiene la grabación para facilitar la lectura precisa de las respuestas EAG.

Puede fijarse con cinta adhesiva una regla pequeña en la pantalla del ordenador en la línea base de la señal. La respuesta se registra en milímetros y luego se convierte a la amplitud en microvoltios. Si es necesario, las grabaciones pueden reproducirse para una evaluación posterior.

En este ejemplo, se utilizan naranjas agria de tres a cuatro días de antigüedad con polillas macho y hembra apareadas. Sin embargo, este protocolo puede adaptarse a otros insectos. Transfiera cada insecto a un pequeño recipiente plástico con camada.

El día del análisis, justo antes del bioensayo, introduzca el insecto en la abertura grande de una punta de pipeta, que tiene una abertura más pequeña, apenas lo suficientemente grande como para que quepa su cabeza. Luego, utilizando una punta de pipeta más pequeña, empuje cuidadosamente el insecto hacia la abertura más pequeña hasta que su cabeza quede expuesta bajo un estereoscopio. Asegúrese de que las antenas estén sujetas dentro del tubo de sujeción y de que la base de las antenas quede expuesta para la extirpación.

A continuación, coloque el soporte del tenedor con una fina película de gel electrodo en estrecha proximidad a la antena; utilizando tijeras microquirúrgicas, separe con cuidado y luego extirpe ambas antenas, e inicie un cronómetro para registrar el tiempo entre este evento y el de los estímulos subsiguientes. Con una herramienta de punta metálica y una pequeña cantidad de gel en el extremo, tome una antena y colóquela sobre el tenedor. Asegúrese de que la base de la antena quede colocada sobre el electrodo de referencia no rojo (electrodo de tierra) del tenedor.

Realice lo mismo con la segunda antena. Coloque la base de la antena en el mismo lado del tenedor, a dos o tres milímetros de distancia, con la antena posicionada. Recorte las puntas de la antena según sea necesario.

Aplique el electrodo al gel con un pincel y asegúrese de que su base y punta estén sumergidas en el gel electrolítico para que no haya burbujas en el gel. Evite cubrir la porción central de la antena con gel para maximizar el área de superficie de la antena expuesta al chorro de compuestos volátiles. Una vez que la preparación esté adecuadamente gelificada, conecte el tenedor al preamplificador de la sonda.

Ahora aplique un flujo de aire humidificado sobre la preparación para mantener la viabilidad de una preparación de antena. Después de 10 minutos desde el momento de la extirpación, proceda a aplicar los primeros estímulos. El orden de operación para estimular una preparación comienza y termina con un control positivo, intercalando una secuencia aleatorizada de compuestos sin compuestos idénticos consecutivos y con al menos un control negativo; el número de compuestos administrados a una antena varía según la especie.

Una preparación de polilla de la oruga del naranjo puede permanecer activa durante más de 30 minutos, lo que permite analizar fácilmente hasta 10 compuestos volátiles con un número bajo de réplicas. El mismo principio de entrega de la muestra se aplica a las pantallas posteriores de mezclas de compuestos que mostraron provocar respuestas en la pantalla preliminar. El primer pipeta de estímulo debe prepararse 30 segundos antes de aplicar el chorro; desprecinte la pipeta y colóquela en el soporte de manera que dirija el flujo de aire a dos o tres milímetros de las antenas, a los 10 minutos posteriores a la extirpación de la antena.

Administre la primera ráfaga de estímulo durante uno o dos segundos a 300 mililitros por minuto. Ahora, reemplace rápidamente la pipeta para que un minuto después del primer estímulo, se administre el segundo. Mantener la consistencia entre las muestras minimizará la variabilidad de las cantidades de compuestos volátiles que se dispensan realmente.

Después de administrar el último soplo de control positivo, retire la antena y limpie el tenedor. Con una toallita saturada en etanol, deje que se seque completamente antes del uso posterior. Para aumentar el rendimiento de los ensayos, un asistente debe preparar la siguiente antena con tenedores limpios 10 minutos antes del final de las preparaciones anteriores.

Secuencia de pruebas, se requiere más de un tenedor para este método. Después de cada experimento, sacrificar las polillas de prueba en un ambiente de hielo seco y diseccionar las hembras para verificar su estado de apareamiento. Suponer que los machos convivientes deben haber copulado. La antena de la polilla naranja naval se estimuló con ráfagas de dos segundos y se realizaron grabaciones de diez segundos con una ventana de diez segundos en una escala de cinco milivoltios.

Una deflexión negativa fue la respuesta típica. Sin embargo, se registraron los valores absolutos. Todos los preparados femeninos con una respuesta débil al control positivo fueron descartados.

La respuesta promedio de las preparaciones restantes fue de 2.600 microvoltios. De manera similar, la respuesta promedio de los machos al control de pH sexual fue típicamente de 3000 microvoltios. Por lo tanto, se descartaron los anani con una respuesta inferior al estándar, así como los datos provenientes de antenas que mostraron una respuesta degradada durante el ensayo.

La degradación ocurrió si la respuesta de Anton al soplo del control positivo final fue inferior al 75 % del primer soplo del control previo a la condición (pre-con), o menor que el segundo soplo del control pre-con para las restantes repeticiones experimentales. Los valores de respuesta se analizaron tomando las mediciones brutas de cada repetición y restando la respuesta del control negativo de esa repetición de cada valor dentro de la misma. A continuación, se promediaron todos los controles positivos en cada repetición y se corrigieron a 1000 microvoltios, anotando la proporción de corrección a 1000 microvoltios para cada repetición.

Los valores de los compuestos analizados se multiplicaron entonces por la relación de corrección del control positivo. Por último, se comparó la respuesta corregida promedio de cada compuesto analizado en todas las repeticiones para evaluar la idoneidad de cada compuesto para investigaciones posteriores. No olvide que trabajar con productos químicos puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar las precauciones adecuadas.