Name: Bioensayo electroantenográfico como herramienta de detección de compuestos volátiles de las plantas hospederas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 43 s
Description: Aprende a realizar bioensayos electroantenográficos para detectar compuestos volátiles de plantas hospederas usando antenas de Amyelois transitella. Este método permite el cribado rápido de volátiles mediante análisis electrofisiológico.

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Esta investigación se llevó a cabo en virtud de USDA-ARS CRIS Proyecto de 5.325 a 42.000-037-00D, y con los resultados de CRADA 58-3K95-7-1198 y TFCA 58-5325-8-419. Los autores agradecen Suterra por el don de la (Z, Z) -11,13-hexadecadienal, B. Higbee de discusiones productivas, y J. Baker, de asistencia técnica.

1. La preparación de compuestos volátiles detectados a partir de la planta huésped de EAG detección <ol><li> Después de la identificación y autentificación de todas las sustancias volátiles a través de GC-MS, el análisis EAG bocanada de cada uno disponible volátil. La selección inicial puede ser un número duplicado bajo de respuestas antenales (N = 3-5) para cada sexo con el fin de lograr una indicación de chemoreceptivity relativa en un corto período de tiempo (Tabla 1). </li><li> Preparar una solución de cada volátil a un 5 mg / ml de concentración en pentano. Selle herméticamente y refrigerar la muestra hasta que esté listo para su uso inmediato (por ejemplo, acetofenona, densidad = 1,03 g / ml, volumen = (0,005 g/1.03 g / ml) x 1000 = 4,85 l de acetofenona en un matraz aforado de 1,0 ml y se diluye hasta 1,0 ml con pentano). </li><li> Justo antes de su análisis EAG, eliminar los viales que contienen el 5 mg / ml de concentración de los volátiles a ensayar y se deja calentar a temperatura ambiente. Mientras tanto, marcar el número apropiado de pipetas Pasteur decorrelacionan con cada volátil a ensayar, y envolver un pequeño trozo de parafina (ca. 15 x 15 mm) sobre la punta de la pipeta. Para las pipetas de detección iniciales de estímulo 10 (N = 4 para cada hombre y mujer) se cargan en el caso de una preparación mal o un obstáculo imprevisto otro. </li><li> Utilizando un par de pinzas, suavemente doblar el disco bioensayo en un medio para facilitar la colocación en la pipeta, a continuación, parcialmente colocar el disco doblado en el extremo grande de la pipeta para que ca. 2-3 mm del disco están expuestos. Alinear las pipetas marcadas y preparado en un soporte de estante. </li><li> Utilizando una pipeta o una jeringa, cargar 10 l (50 mg) de solución volátil en cada disco y permitir 2 minutos antes de pasar completamente la inserción de los discos en la pipeta. Una vez cargado, inmediatamente sellar el extremo de la pipeta con parafilm (ca. 15 x 30 mm). La cantidad de estímulos volátiles para ser cargados y sopló más probable es que varía con las especies de insectos. </li><li> Siguiendo el mismo protocolo que se ha indicado anteriormente, preparar los controles deincluir en cada análisis. Para la carga negativa de control de 10 l de pentano solo en cada disco, espere 2 minutos, cargar en la pipeta de la etiqueta y el sello. Para el control positivo, carga de 10 l (50 mg) en el disco, espere 2 minutos, la carga en la pipeta etiquetado y sellado con parafilm. </li><li> La viabilidad de la preparación de las antenas de insectos más probable es que varían según las especies, pero hemos encontrado que Amyelois transitella antenas suelen permanecer activa y constante por más de 30 minutos después de la escisión con el protocolo descrito. Esta cantidad de tiempo que generalmente se permiten hasta 4-10 muestras volátiles para ser evaluados. Tabla 2 proporciona un ejemplo de los tiempos y las secuencias. </li></ol> 2. Preparación de las antenas de los insectos para el bioensayo EAG <ol><li> El objetivo de este experimento es el análisis de EAG, por lo que la suposición de que cada investigador tendrá acceso a los insectos criados adecuadamente. </li><li> Para este experimento vamos a estudiar 3-4 días old, se aparearon las polillas masculinas y femeninas. Polillas individuales se transfieren a un pequeño recipiente con tapa de plástico del día de análisis. Inmediatamente antes de la bioensayo, la polilla a ensayar se transfiere de cabeza en un aparato de sujeción (es decir, a partir de diversas puntas pipeteador de plástico) y asegurado por detrás. La manipulación de los insectos puede ser visto bajo un bajo consumo de energía estéreo-microscopio para facilitar la escisión. </li><li> Las antenas son objeto de burlas a cabo utilizando una herramienta de alambre en la punta. El titular de tenedor, con una pequeña película de gel de electrodo, se coloca en estrecha proximidad para la transferencia rápida de las antenas. La primera antena se extirpa el uso de tijeras micro y se coloca en el tenedor, asegurando la base de la antena se coloca en la porción no-rojo del tenedor (el electrodo de tierra indiferente). Un conjunto temporizador durante 10 minutos y se inicia la segunda antena se extirpa y se coloca al lado de la primera antena con ambas bases en el mismo lado del tenedor. </li><li> Alternativamente, las antenas pueden quedar asegurada dentro de la holdintubo g, extirpados, entonces suavemente retirado de entre el tubo y el insecto utilizando una herramienta con punta de alambre con una pequeña cantidad de gel en el extremo. </li><li> Antenas se comprueban para asegurar la base y la punta se sumergen en gel de electrodo y no hay burbujas están presentes en el gel. Los extremos y consejos pueden ser ajustados para garantizar la exposición total al gel para electrodos. Se debe tener cuidado para asegurar que el resto de cada antena no está cubierto con gel, garantizando así la máxima área de superficie antenal está expuesto a la calada. </li><li> El tenedor preparado se inserta en la sonda de pre-amplificador y se mantiene bajo un constante flujo de aire húmedo a 200 ml / min durante el tiempo restante del período de espera de 10 minutos. El tiempo especial y EAG veces iniciación se observó (Tabla 2) y 30 segundos antes de la primera bocanada de estímulo, la pipeta que contiene el control positivo está abierta y se coloca en el soporte que se ajusta para dirigir el aire / bocanada flujo 2-3 mm desde el preparado antenas. </li><li> Después de cada experperimento, las polillas de prueba son sacrificados en un ambiente de hielo seco y bien dispuestos. </li><li> Las polillas hembras se diseccionan para comprobar el estado de apareamiento. Los hombres que cohabitan se supone que se han apareado. </li></ol> 3. EAG Protocolo de componentes individuales <ol><li> Respuestas antenales se registran a través del software incluido con AutoSpike el instrumento EAG Syntech. La configuración en la pestaña Propiedades AutoSpike para el canal con la sonda de EAG se ha fijado en una tasa de muestreo de 106,7, NO a la rectificación, y un filtro de 0 a 42 Hz. Por la ficha Filtro, el filtro de EAG está en ON y el punto de corte bajo se ajusta a 0,1 Hz. </li><li> Bocanadas de estímulo son de 1-2 segundos de duración. Un contador de tiempo establecido para un minuto se inicia después de cada bocanada. </li><li> La pipeta prueba volátil próximo está abierta y se coloca en el soporte. La secuencia de los volátiles de ensayo, aleatorizado entre ejecuta para asegurar que no compuestos de ensayo consistente seguir otra prueba volátil, es seguido a continuación (por ejemplo, Tabla 2) cuidadosamente allowing 1 minuto entre cada disparo. </li><li> Para facilitar la lectura de las respuestas EAG, las porciones de los gobernantes se colocan sobre la pantalla del ordenador y el nivel basal hasta el ápice de la señal de deflexión hacia abajo se mide en milímetros y se registra en una hoja de datos (es decir, para el ajuste mV 5, 33 mm = 2,5 mV). El software tiene la capacidad de reproducción de las grabaciones guardadas para su posterior análisis. La conversión de mm a cualquiera mV o amplitud mV se realiza en el análisis de datos más adelante. </li><li> Después de la bocanada final de control positivo (por ejemplo, el registro # 12) se administra, las antenas se retiran, el tenedor se limpia con una toallita de etanol saturado y se deja secar antes de su uso posterior. </li><li> Para aumentar el rendimiento de los ensayos, la escisión de la siguiente serie de antenas puede ser iniciado por un personal de laboratorio de segunda a unos 10 minutos antes del final del experimento actual - después de la cuarta de hojaldre, la segunda prueba volátil de la experiencia actual, según la tabla 2. Esto permitirá FOr el comienzo del experimento siguiente directamente después de los extremos experimento actual. </li><li> Mayor número de repeticiones (a antenas diferentes) puede realizarse en compuestos de interés para proporcionar una mayor validación estadística. </li></ol> 4. Un ejemplo de análisis de los EAG mezclas u otras matrices (Tabla 3) <ol><li> A continuación, las proporciones y los volúmenes de dos mezclas terciarias (3-componente mezclas) se calcula para proporcionar un ejemplo de la combinación de compuestos volátiles que suscitan respuestas de alta EAG (Tabla 4). Los cálculos son para algunas relaciones básicas, una proporción 1:1:1 molar de α-humuleno: 2-undecanona: 2-feniletanol y luego comparar a una relación de mezcla de la segunda 1:02:04. </li><li> Utilizando protocolos similares se describió anteriormente, las mezclas se preparan y etiquetados pipetas Pasteur se cargan junto con los controles necesarios positivos y negativos. </li><li> Las muestras volátiles se inflan a través de antenas de los machos y hembras, y las respuestas se miden y haber iniciado sesióna una hoja de datos (Tabla 3). </li></ol> 5. Los resultados representativos Para la naranja ombligo femenino las siguientes opciones se utilizan: 2 inhalaciones segundo, 10 veces segundo disco, 10 segundos de la ventana, y el 5 de escala de mV. Una desviación negativa es la respuesta típica, sin embargo, el valor absoluto se registra (por ejemplo, -3.400 deflexión mV se registra como 3.400 mV). Una respuesta relativamente débil de la preparación para el control positivo se descarta. Figura 1 proporciona una representación gráfica de una mala respuesta al control positivo por la naranja ombligo. Por ejemplo de un resultado pobre control, la media de respuesta de las hembras antenal a acetofenona es típicamente ca. 2.600 mV (Figura 2), si la preparación sólo dio una respuesta de ca. 1.300 mV que se descarta y se prepara otro par de antenas. Del mismo modo, la respuesta media de los hombres de (Z, Z) -11,13-hexadecadienal era tipicay 3.000 mV, por lo que cualquier respuesta es inferior a 1.500 mV se descartó típicamente. El control positivo al comienzo y al final de cada experimento también proporciona información relativa a la condición de las antenas. Una regla de oro se sigue para la detección rápida es si la respuesta antenal a la nube de la post-control (expediente n º 12, Tabla 2) es menor que el 75% del hojaldre 1 º de la pre-control (registro # 1 , Tabla 2) o menor que el hojaldre 2 ª de la pre-control (registro # 2, Tabla 2) a continuación, el experimento no se utiliza en el análisis de datos debido a la posible degradación de la preparación (Figura 3). Un ejemplo de la primera regla de oro sería el registro # 1 = 2.730 mV y el registro n º 12 = 1680 mV, y la segunda regla de oro si el registro n º 2 = 2.350 mV y el registro n º 12 = 1680 mV, en cada uno de estos casos , los resultados del PREP y el experimento se descarta. Aejemplo representativo de la corrección de los valores de respuesta EAG medidos para el control positivo sería como sigue. <table border="1"><tbody><tr><td> Ejecutar # </td><td> GAE (mV) </td><td> Ejecutar # 2 </td><td> GAE (mV) </td><td> Ejecutar # 3 </td><td> GAE (mV) </td></tr><tr><td> (+) Ctrl </td><td> 2800 </td><td> (+) Ctrl </td><td> 2420 </td><td> (+) Ctrl </td><td> 3030 </td></tr><tr><td> Un Cmpnd </td><td> 3000 </td><td> Un Cmpnd </td><td> 2500 </td><td> Un Cmpnd </td><td> 3440 </td></tr><tr><td> (-) Ctrl </td><td> 530 </td><td> (-) Ctrl </td><td> 755 </td><td> (-) Ctrl </td><td> 910 </td></tr><tr><td> Cmpnd B </td><td> 2400 </td><td> Cmpnd B </td><td> 2000 </td><td> Cmpnd B </td><td> 2560 </td></tr><tr><td> (+) Ctrl </td><td> 2770 </td><td> (+) Ctrl </td><td> 2400 </td><td> (+) Ctrl </td><td> 3020 </td></tr></tbody></table> Utilizando los valores anteriores para un N = 3 experimento, la respuesta de control negativo se resta de cada valor dentro de cada experimento bajo el supuesto de que el control negativo es la respuesta basal antenal a la bocanada mecánica y el disolvente residual. <table border="1"><tbody><tr><td> Run # 1 </td><td> GAE (mV) </td><td> Ejecutar # 2 </td><td> GAE (mV) </td><td> Ejecutar # 3 </td><td> GAE (mV) </td></tr><tr><td> (+) Ctrl </td><td> 2270 </td><td> (+) Ctrl </td><td> 1665 </td><td> (+) Ctrl </td><td> 2120 </td></tr><tr><td> Un Cmpnd </td><td> 2470 </td><td> Un Cmpnd </td><td> 1745 </td><td> Un Cmpnd </td><td> 2530 </td></tr><tr><td> (-) Ctrl </td><td> 0 </td><td> (-) Ctrl </td><td> 0 </td><td> (-) Ctrl </td><td> 0 </td></tr><tr><td> Cmpnd B</td><td> 1870 </td><td> Cmpnd B </td><td> 1245 </td><td> Cmpnd B </td><td> 1650 </td></tr><tr><td> (+) Ctrl </td><td> 2240 </td><td> (+) Ctrl </td><td> 1645 </td><td> (+) Ctrl </td><td> 2110 </td></tr></tbody></table> Los controles positivos para cada experimento a continuación se promediarán y corregido en 1000 mV, teniendo en cuenta la relación para la corrección de 1000 mV. Una hoja de datos (por ejemplo, Excel) puede ser fácilmente manipulado para convertir las respuestas a los datos utilizables. <table border="1"><tbody><tr><td> Run # 1 </td><td> Media (mV) </td><td> Ejecutar # 2 </td><td> Media (mV) </td><td> Ejecutar # 3 </td><td> Media (mV) </td></tr><tr><td> (+) Ctrl </td><td> 2255 </td><td> (+) Ctrl </td><td> 1655 </td><td> (+) Ctrl </td><td> 2115 </td></tr><tr><td> (+) Ctrl adj. </td><td> 1000 (0.443) </td><td> (+) Ctrl adj. </td><td> 1000 (0.604) </td><td> (+) Ctrl adj. </td><td> 1000 (0.473) </td></tr></tbody></table> Multiplicando por la relación de corrección dentro de cada experimento, los valores para el compuesto A y el compuesto B se ajusta entonces. <table border="1"><tbody><tr><td> Run # 1 </td><td> Adj. GAE (mV) </td><td> Ejecutar # 2 </td><td> Adj. GAE (mV) </td><td> Ejecutar # 3 </td><td> Adj. GAE (mV) </td></tr><tr><td> Un Cmpnd </td><td> 1094 </td><td> Un Cmpnd </td><td> 1054 </td><td> Un Cmpnd </td><td> 1197 </td></tr><tr><td> Cmpnd B </td><td> 828 </td><td> Cmpnd B </td><td> 752 </td><td> Cmpnd B </td><td> 780 </td></tr></tbody></table> Los promedios (medias) para cada compuesto se determina a continuación junto con otros datos estadísticos pertinentes y las respuestas EAG para los compuestos ensayados, a continuación, se puede evaluara la candidatura para una mayor investigación. <table border="1"><tbody><tr><td> Compuesto </td><td> GAE (mV) </td><td> N º Corre, N = </td></tr><tr><td> A </td><td> 1115 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> B </td><td> 787 </td><td> 3 </td></tr></tbody></table><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3931/3931fig1.jpg" /> Figura 1. EAG Representante para la respuesta masculina antenal (1180 mV) a la pre-control (1 º de hojaldre control positivo) que se descarta debido a la respuesta antenal pobres después de asegurarse de las antenas tienen un buen contacto con el gel. Las barras azules en las ventanas de la parte inferior representan la hojaldre dos segundos de la volatilidad. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3931/3931fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3931/3931fig2.jpg" /> <strong&gt; Figura 2. EAG Representante para la respuesta de las hembras antenal (3400 mV) a la 1 ª bocanada de pre-control que se considere apropiada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3931/3931fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3931/3931fig3.jpg" /> Figura 3. EAG Representante para la respuesta de las hembras antenal (1680 mV) para el control a posteriori (último control positivo para cada experimento) que se considera pobre, y sugerente de las antenas de la degradación (&lt;75% del 1 de pre-control o &lt; 2 º valor bocanada de pre-control). Para este ejemplo, el 1 º de pre-control de hojaldre era 2.730 mV y 2 º de pre-control de hojaldre era 2350 mV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3931/3931fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3931/3931fig4.jpg" /> Figura 4. Representante EAG para la respuesta de las hembras antenal (3800 mV) a la nube de una mezcla volátil y candidato a las mediciones sucesivas de la desviación máxima inicial (3800 mV), la pendiente inicial, durante la duración de hojaldre (0,3 mV = s/1.2 0,25 s / mV), y la pendiente de la duración restante de hojaldre (1,6 s/1.9 mV = 0,84 s / mV). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3931/3931fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3931/3931fig5.jpg" /> Figura 5. Pequeño vaso modificado que contiene una matriz de muestra y los volátiles asociados a ser inflado a través de A. transitella antenas. <img alt="Tabla 1" src="/files/ftp_upload/3931/3931table1.jpg" /> Tabla 1. En sUIT volátiles de emisiones de almendras sin par (2007) y las respuestas EAG determinados por una configuración diferente y menos sensibles en el programa Autospike. <img alt="Tabla 2" src="/files/ftp_upload/3931/3931table2.jpg" /> Tabla 2. Ejemplo de un formulario para el registro de las respuestas antenales hombres y mujeres a los distintos componentes volátiles. <img alt="Tabla 3" src="/files/ftp_upload/3931/3931table3.jpg" /> Tabla 3. Ejemplo de un formulario para el registro de las respuestas de las antenas de ambos sexos a las mezclas volátiles y / o ramos de flores. <img alt="Tabla 4" src="/files/ftp_upload/3931/3931table4.jpg" /> Tabla 4. Ejemplos de preparación de 10 ml de una dosis de 5 mg / ml de solución para dos diferentes proporciones de las mezclas. <img alt="Tabla 5" src="/files/ftp_upload/3931/3931table5.jpg" /> Tabla 5. Ejemplo de formulario para registrar dos consecuenciascutivo inhalaciones individuales de los componentes volátiles a través de antenas de los machos y hembras.

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El autor cuenta con una investigación existente de cooperación y acuerdo de desarrollo con Paramount Farming Company, una compañía con vínculos con Suterra LLC.

El uso de grabaciones electroantenograma como un bioensayo para determinar las respuestas Quimiorecepción de un insecto objetivo es bastante común y numerosos estudios que utilizan GAE como un detector para el efluente de un cromatograma de gases (GC-EAD) se pueden encontrar en la literatura. 9,10 El método demostró proporcionará una detección rápida de cantidades equivalentes de los componentes volátiles con repeticiones altas para la asignación de confianza de la capacidad de respuesta relativa. El programa...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Acetofenona </td><td> Alfa-Aesar </td><td> A12727 </td><td> Control positivo Mujer </td></tr><tr><td> (Z, Z) -11,13-Hexadecadienal </td><td> Suterra </td><td></td><td> Control positivo Mujer </td></tr><tr><td> α-humuleno </td><td> Aldrich </td><td> 53675 </td><td> Sesquiterpénicas </td></tr><tr><td> 2-undecanona </td><td> Aldrich </td><td> U1303 </td><td> Derivado de ácido graso </td></tr><tr><td> 2-feniletanol </td><td> Aldrich </td><td> 77861 </td><td> Bencenoide </td></tr><tr><td> Pentano </td><td> EMD </td><td> PX0167-1 </td><td> Solvente </td></tr><tr><td> 4 canales de adquisición de control </td><td> Syntech </td><td> YoCAD-4 </td><td></td></tr><tr><td> GAE sonda, pre-amplificador </td><td> Syntech </td><td> Tipo de PRG-2 </td><td></td></tr><tr><td> Antena titular de la </td><td> Syntech </td><td> Para PRG-2 </td><td> Tenedor de electrodos </td></tr><tr><td> Estímulo del controlador </td><td> Syntech </td><td> CS-55 </td><td> El flujo de aire y bocanadas </td></tr><tr><td> Spectra gel para electrodos </td><td> Parker </td><td> 12-02 </td><td></td></tr><tr><td> Los discos de bioensayo </td><td> Whatman </td><td> 2017-006 </td><td> 6 mm </td></tr><tr><td> Pasteur Pipetas </td><td> VWR </td><td> 14673-010 </td><td> 5 ¾ &quot;(14,6 cm) </td></tr><tr><td> Parafilm M </td><td> Bemis </td><td> AM-992 </td><td></td></tr></tbody></table>

bioensayo electroantenográfico como herramienta de detección de compuestos volátiles de las plantas hospederas

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Volátiles de las plantas juegan un papel importante en las interacciones planta-insecto. Insectos herbívoros utilizan compuestos volátiles de las plantas, conocidas como kairomonas, para localizar su planta hospedera. 1,2 Cuando una planta huésped es un importante daño agronómica de los productos básicos de alimentación por plagas de insectos pueden causar graves pérdidas económicas a los productores. En consecuencia, kairomonas se puede utilizar como atrayentes para atraer o confundir a estos insectos y, por tanto, ofrecer una alternativa ecológica a los plaguicidas para el control de insectos. 3 Desafortunadamente, las plantas pueden emitir un número de sustancias volátiles, con grandes composiciones y proporciones variables de las emisiones que dependen de la fenología de la mercancía o la hora del día. Esto hace que la identificación de componentes biológicamente activos o mezclas de compuestos volátiles de un arduo proceso. Para ayudar a identificar los componentes bioactivos de las emisiones de las plantas hospederas volátiles que emplean el electroantenografía pruebas de laboratorio basado en bioensayos (GAE). GEA es una herramienta eficaz para evaluar y record electrofisiológicamente las respuestas olfativas de un insecto a través de sus receptores antenales. El proceso de selección EAG puede ayudar a reducir el número de sustancias volátiles a prueba para identificar prometedores componentes bioactivos. Sin embargo, los bioensayos EAG sólo proporcionan información sobre la activación de los receptores. No proporciona información sobre el tipo de comportamiento de los insectos el compuesto provoca, lo que podría ser como un tipo de atrayente, repelente o de otra índole de la respuesta conductual. Los compuestos volátiles que provoquen una respuesta significativa de EAG, con respecto a un control positivo adecuado, se suelen tomar en la realización de pruebas de respuestas de comportamiento de la plaga de insectos. El diseño experimental presenta en detalle la metodología empleada a la pantalla a base de almendras volátiles de las plantas hospederas 4,5 mediante la medición de las respuestas electrofisiológicas de las antenas de un adulto el ombligo de insectos plaga la naranja (Amyelois transitella) a los componentes individuales y combinaciones simples de componentes a través de EAG bioensayo. El método utiliza dos exantenas cised colocado a través de un porta-electrodos &quot;tenedor&quot;. El protocolo se ha demostrado aquí se presenta una rápida y de alto rendimiento método estandarizado para la detección de compuestos volátiles. Cada volátil es un conjunto, cantidad constante de estandarizar el nivel de estímulo y permitir así que las respuestas de las antenas es indicativo de la chemoreceptivity relativa. El control negativo ayuda a eliminar la respuesta electrofisiológica tanto a la fuerza disolvente residual y mecánica de la calada. El control positivo (en este ejemplo acetofenona) es un compuesto único que ha suscitado una respuesta coherente desde el ombligo masculino y femenino la naranja (NOW), la polilla. Un estándar semioquímico adicional que proporciona una respuesta coherente y se utiliza para los estudios de bioensayo con el macho AHORA polilla es (Z, Z) -11,13-hexdecadienal, un componente de aldehído de la feromona sexual hembra-producido. 6-8

Un método para rápidamente volátiles de las plantas huésped de pantalla mediante la medición de la respuesta electrofisiológica de la naranja ombligo adulto (<em&gt; Amyelois transitella</em&gt;) A los componentes de antenas individuales y mezclas a través de análisis de electroantenográfico se demuestra.

Bioensayo electroantenográfico como herramienta de detección de compuestos volátiles de las plantas hospederas

Los volátiles vegetales desempeñan un papel importante en las interacciones planta-insecto. Los insectos herbívoros utilizan los volátiles vegetales, conocidos como kairomonas, para localizar a su huésped...

El objetivo general de este procedimiento es cribar rápidamente un gran número de volátiles de plantas hospederas en busca de actividad biológica potencial. Esto se logra primero recolectando y analizando mediante GCMS los volátiles de la planta hospedera de interés. Luego, se identifican y verifican los componentes químicos.El tercer paso consiste en analizar los componentes individuales en réplicas suficientes para determinar su bioactividad mediante análisis electrográficos. El paso final es formular y evaluar mezclas de los componentes activos. En última instancia, los resultados pueden proporcionar una serie reducida de componentes o una mezcla de componentes lista para investigaciones posteriores en estudios conductuales con el insecto de interés.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como los estudios conductuales intensivos en tiempo, es que el cribado rápido mediante análisis electrográficos disminuye significativamente la cantidad de compuestos que deben seleccionarse para otros estudios que demuestran un procedimiento. ¿Es el Sr. Wage un técnico de mi laboratorio? Una vez que los compuestos volátiles relevantes hayan sido identificados mediante cromatografía de gases y espectrometría de masas, es posible realizar primero un análisis de electroiconografía o EAG de cada compuesto volátil disponible.Sin embargo, es necesario preparar los volátiles disponibles. Prepare una solución de cada compuesto volátil en pentano a una concentración de cinco miligramos por mililitro en un recipiente que pueda sellarse herméticamente y almacenarse a cuatro grados Celsius. A continuación, prepare las pipetas de estímulo.Etiquete 10 pipetas Pasteur por cada compuesto volátil y envuelva sus puntas con un pequeño trozo de parafina. Un conjunto de 10 pipetas es suficiente para entregar el compuesto volátil a cada sexo en una prueba preliminar con un número bajo de réplicas. Ahora alinee el conjunto restante de cinco pipetas en un soporte para pipetas y coloque un disco de bioensayo en el extremo abierto de cada pipeta.Doble suavemente un disco con pinzas y colóquelo parcialmente en el extremo grande de la pipeta de modo que dos o tres milímetros del disco queden expuestos. Utilizando una pipeta o jeringa, cargue 10 microlitros de solución volátil sobre cada disco. Es extremadamente importante calcular, formular y preparar correctamente las soluciones para garantizar réplicas consistentes.Deje transcurrir dos minutos y luego empuje completamente los discos dentro de sus pipetas. Una vez cargadas, selle inmediatamente cada pipeta con parafina. Repita esta preparación de pipetas para el número deseado de réplicas.Utilizando el mismo protocolo, prepare un control negativo con solo pentanos y controles positivos, en este caso acetofenona y hormona sexual. Ahora continúe con la preparación de las antenas de insecto.En este experimento, un preamplificador transmite la señal desde un electrodo en horquilla hasta el instrumento de adquisición de EAG. El software proporcionado con el instrumento de EAG debe configurarse adecuadamente en el software. Configure los ajustes estableciendo primero la frecuencia de muestreo en 106,7.Establezca el conmutador de rectificación en "conocido" y configure el filtro en cero a 42 hercios en la pestaña de filtro. Active el filtro EAG y establezca el corte inferior en 0,1 hercios. Luego guarde la configuración en un archivo de configuración para su uso futuro.El funcionamiento del programa es tan sencillo como abrir un archivo de proyecto nuevo, guardarlo con un nombre específico y proceder con la grabación. El icono de triángulo rojo inicia el proceso de grabación y permanece activo durante un tiempo predeterminado para cada soplo individual. Cuando se han realizado todos los soplos para las antenas, el icono de equis negro detiene la grabación para facilitar la lectura precisa de las respuestas EAG.Puede fijarse con cinta adhesiva una regla pequeña en la pantalla del ordenador en la línea base de la señal. La respuesta se registra en milímetros y luego se convierte a la amplitud en microvoltios. Si es necesario, las grabaciones pueden reproducirse para una evaluación posterior.En este ejemplo, se utilizan naranjas agria de tres a cuatro días de antigüedad con polillas macho y hembra apareadas. Sin embargo, este protocolo puede adaptarse a otros insectos. Transfiera cada insecto a un pequeño recipiente plástico con camada.El día del análisis, justo antes del bioensayo, introduzca el insecto en la abertura grande de una punta de pipeta, que tiene una abertura más pequeña, apenas lo suficientemente grande como para que quepa su cabeza. Luego, utilizando una punta de pipeta más pequeña, empuje cuidadosamente el insecto hacia la abertura más pequeña hasta que su cabeza quede expuesta bajo un estereoscopio. Asegúrese de que las antenas estén sujetas dentro del tubo de sujeción y de que la base de las antenas quede expuesta para la extirpación.A continuación, coloque el soporte del tenedor con una fina película de gel electrodo en estrecha proximidad a la antena; utilizando tijeras microquirúrgicas, separe con cuidado y luego extirpe ambas antenas, e inicie un cronómetro para registrar el tiempo entre este evento y el de los estímulos subsiguientes. Con una herramienta de punta metálica y una pequeña cantidad de gel en el extremo, tome una antena y colóquela sobre el tenedor. Asegúrese de que la base de la antena quede colocada sobre el electrodo de referencia no rojo (electrodo de tierra) del tenedor.Realice lo mismo con la segunda antena. Coloque la base de la antena en el mismo lado del tenedor, a dos o tres milímetros de distancia, con la antena posicionada. Recorte las puntas de la antena según sea necesario.Aplique el electrodo al gel con un pincel y asegúrese de que su base y punta estén sumergidas en el gel electrolítico para que no haya burbujas en el gel. Evite cubrir la porción central de la antena con gel para maximizar el área de superficie de la antena expuesta al chorro de compuestos volátiles. Una vez que la preparación esté adecuadamente gelificada, conecte el tenedor al preamplificador de la sonda.Ahora aplique un flujo de aire humidificado sobre la preparación para mantener la viabilidad de una preparación de antena. Después de 10 minutos desde el momento de la extirpación, proceda a aplicar los primeros estímulos. El orden de operación para estimular una preparación comienza y termina con un control positivo, intercalando una secuencia aleatorizada de compuestos sin compuestos idénticos consecutivos y con al menos un control negativo; el número de compuestos administrados a una antena varía según la especie.Una preparación de polilla de la oruga del naranjo puede permanecer activa durante más de 30 minutos, lo que permite analizar fácilmente hasta 10 compuestos volátiles con un número bajo de réplicas. El mismo principio de entrega de la muestra se aplica a las pantallas posteriores de mezclas de compuestos que mostraron provocar respuestas en la pantalla preliminar. El primer pipeta de estímulo debe prepararse 30 segundos antes de aplicar el chorro; desprecinte la pipeta y colóquela en el soporte de manera que dirija el flujo de aire a dos o tres milímetros de las antenas, a los 10 minutos posteriores a la extirpación de la antena.Administre la primera ráfaga de estímulo durante uno o dos segundos a 300 mililitros por minuto. Ahora, reemplace rápidamente la pipeta para que un minuto después del primer estímulo, se administre el segundo. Mantener la consistencia entre las muestras minimizará la variabilidad de las cantidades de compuestos volátiles que se dispensan realmente.Después de administrar el último soplo de control positivo, retire la antena y limpie el tenedor. Con una toallita saturada en etanol, deje que se seque completamente antes del uso posterior. Para aumentar el rendimiento de los ensayos, un asistente debe preparar la siguiente antena con tenedores limpios 10 minutos antes del final de las preparaciones anteriores.Secuencia de pruebas, se requiere más de un tenedor para este método. Después de cada experimento, sacrificar las polillas de prueba en un ambiente de hielo seco y diseccionar las hembras para verificar su estado de apareamiento. Suponer que los machos convivientes deben haber copulado. La antena de la polilla naranja naval se estimuló con ráfagas de dos segundos y se realizaron grabaciones de diez segundos con una ventana de diez segundos en una escala de cinco milivoltios.Una deflexión negativa fue la respuesta típica. Sin embargo, se registraron los valores absolutos. Todos los preparados femeninos con una respuesta débil al control positivo fueron descartados.La respuesta promedio de las preparaciones restantes fue de 2.600 microvoltios. De manera similar, la respuesta promedio de los machos al control de pH sexual fue típicamente de 3000 microvoltios. Por lo tanto, se descartaron los anani con una respuesta inferior al estándar, así como los datos provenientes de antenas que mostraron una respuesta degradada durante el ensayo.La degradación ocurrió si la respuesta de Anton al soplo del control positivo final fue inferior al 75 % del primer soplo del control previo a la condición (pre-con), o menor que el segundo soplo del control pre-con para las restantes repeticiones experimentales. Los valores de respuesta se analizaron tomando las mediciones brutas de cada repetición y restando la respuesta del control negativo de esa repetición de cada valor dentro de la misma. A continuación, se promediaron todos los controles positivos en cada repetición y se corrigieron a 1000 microvoltios, anotando la proporción de corrección a 1000 microvoltios para cada repetición.Los valores de los compuestos analizados se multiplicaron entonces por la relación de corrección del control positivo. Por último, se comparó la respuesta corregida promedio de cada compuesto analizado en todas las repeticiones para evaluar la idoneidad de cada compuesto para investigaciones posteriores. No olvide que trabajar con productos químicos puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar las precauciones adecuadas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Sistemas olfativos de insectos proporcionan oportunidades únicas para el registro de olor inducida por las respuestas en las formas de electroantennograms (EAG) y las grabaciones individuales sensillum (SSR), que se resumen las respuestas de todas las neuronas del receptor odorante (ORNs), ubicado en la antena y de los alojados en individuales sensilla, respectivamente.

Las mediciones electrofisiológicas de un sistema olfativo Polilla

Señales olfativas mediar muchas conductas diferentes en los insectos, y son a menudo mezclas complejas compuestas de decenas a cientos de compuestos volátiles. Utilizando cromatografía de gases con la grabación de múltiples canales en el lóbulo antenal de insectos, se describe un método para la identificación de compuestos bioactivos.

La identificación de los compuestos volátiles olfativas utilizando cromatografía de gases-de varias unidades Grabaciones (GCMR) en el lóbulo antenal insectos

En este video, demostramos un ensayo de cribado para identificar la eficacia de nematicidas de moléculas pequeñas contra nematodos. Los nematicidas se consideran eficaces si causan una disminución en el número de nematodos móviles en la muestra después de la exposición.

Ensayo de cribado de nematicidas de moléculas pequeñas: un método de rendimiento medio para cribar posibles nematicidas contra Ditylenchus dipsaci

Una vertical, laberinto en T olfatómetro se describe para el ensayo de la respuesta de comportamiento de los artrópodos. El olfatómetro permite al experimentador para medir las opciones realizadas por los sujetos del ensayo cuando a dos campos de olores potenciales. Tanto atracción y repulsión a partir de sustancias olorosas se pueden medir con este dispositivo.

Vertical T-laberinto Choice Ensayo para la respuesta a los olores artrópodos

Describimos un protocolo para usar antenogramas de insectos en forma de electroantenogramas (EAG) en robots autónomos. Nuestro diseño experimental permite grabaciones estables en un día y resuelve parches de olor individuales de hasta 10 Hz. La eficiencia de los sensores EAG para búsquedas olfativas se demuestra al conducir un robot hacia una fuente de olor.

El uso de insectos electroantenograma Sensores de Robots Autónoma de Búsquedas olfativas

Las chinches dependen de las neuronas receptoras olfativas alojadas en su sensibilidad olfativa antenal para detectar semioquímicos en el medio ambiente. Utilizando el registro de un solo sensillum, demostramos un método para evaluar la respuesta de las chinches a los semioquímicos y exploramos el proceso de codificación involucrado.

Uso Individual sensillum grabación para detectar respuestas olfativo neurona de chinches de cama a Semioquímicos

Arenas de bioensayo de foto-la atracción se utilizan para determinar los colores de luz óptima para maximizar la atracción de insectos; sin embargo pruebas biológicas y los métodos son específicos de hábitat y comportamiento de insectos. Modificaciones y equipo adaptable se explican para insectos nocturnos o diurnos y terrestres o aéreos.

Elementos clave de la prueba biológica de atracción foto insectos estudios o programas de monitoreo

Aquí, describimos la construcción y el uso de un túnel de viento para olor había mediada ensayos conductuales con insectos. El diseño de túnel de viento facilita la liberación de las fuentes de olor por varios métodos, con y sin estímulos visuales. Túnel de viento los experimentos es métodos importantes para identificar su comportamiento activos sustancias químicas volátiles.

Un túnel de viento para olor mediada por insectos ensayos conductuales

El presente artículo detalla un protocolo paso a paso para electroantennogramas exitosos y de bajo ruido en varios géneros de mosquitos, incluyendo hembras y machos.

Una guía paso a paso para la electroantenografía de mosquitos

Este estudio introduce protocolos experimentales para un dron bio-híbrido de detección de olores basado en antenas de seda. Se presenta el funcionamiento de un dispositivo experimental de electroantenograma con antenas de sedamo, además de la estructura de un dron biohíbrido diseñado para la localización de fuentes de olor utilizando el algoritmo de sobretensión en espiral.

Drone bio-híbrido de detección de olores basado en electroantennografía utilizando antenas Silkmoth para la localización de fuentes de olor

Este protocolo establece métodos para extraer y cuantificar las respuestas a la feromona sexual volátil en C. elegans, proporcionando herramientas para estudiar la comunicación química y la trayectoria de navegación.

Extracción de feromonas sexuales volátiles y ensayo de quimioatracción en Caenorhabditis elegans

Aprende a realizar bioensayos electroantenográficos para detectar compuestos volátiles de plantas hospederas usando antenas de Amyelois transitella. Este método permite el cribado rápido de volátiles mediante análisis electrofisiológico.

Bioensayo electroantenográfico como herramienta de detección de compuestos volátiles de las plantas hospederas

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