Una afinidad líquido fase de captura de ensayo utilizando partículas magnéticas para estudiar la interacción proteína-proteína: el ejemplo de poliomyelits-Nanobodies

Este protocolo utiliza la interacción entre el virus de la poliomielitis y el virus de la poliomielitis, reconociendo nanocuerpos para demostrar un ensayo cuantitativo simple de captura de afinidad de fase líquida. Principalmente, las perlas magnéticas recubiertas de cobalto se utilizan para tirar hacia abajo de las proteínas marcadas, así como de cualquier proteína marcada por radio que interactúe. Primero, mezcle las proteínas marcadas y marcadas e incube a temperatura ambiente.

A continuación, añada perlas magnéticas que reconozcan la etiqueta, separe la fracción unida de la proteína marcada de la fracción no unida mediante imanes. A continuación, mida la señal de la proteína marcada que se encuentra en la fracción no unida y determine la cantidad de proteína marcada que se encuentra en la fracción no unida. Los resultados de este ensayo de afinidad en fase líquida son extremadamente útiles cuando se analizan proteínas sensibles a la conversión confirmacional.

Este ensayo de captura de afinidad en fase líquida puede proporcionar información sobre la interacción entre el virus de la poliomielitis, reconociendo los nano boies y diferentes antígenos de virus de la poliomielitis. El método también se puede aplicar a otras interacciones proteína-proteína, siempre que una proteína pueda ser etiquetada y la otra pueda ser detectada. La primera vez que tuvimos la identificación de este método fue cuando nos interesaba investigar la interacción entre el virus de la poliomielitis, el reconocimiento de nanocuerpos y diferentes antígenos de virus de la poliomielitis.

Dado que el virus de la poliomielitis es sensible a la conversión de confirmación, cuando se adhiere a una superficie sólida, el uso de e LSA es limitado. Por lo tanto, debe preferirse un sistema basado en fase líquida. Un ejemplo de este tipo de sistema basado en la fase líquida que se utiliza a menudo en la investigación sobre el poliovirus es la microproteína.

Un ensayo de inmunoprecipitación. A pesar de que esta prueba ha demostrado su aplicabilidad, requiere la estructura cristalizada de un anticuerpo convencional, que está ausente en los nanocuerpos. Estos nanocuerpos, que son anticuerpos de dominio único interesantes y muy estables, se pueden diseñar fácilmente con diferentes textos.

El ampliamente utilizado. La pila muestra afinidad por los iones bivalentes, como el níquel y el cobalto, que a su vez pueden recubrirse fácilmente con perlas magnéticas. Por lo tanto, desarrollamos el ensayo de captura de afinidad cuantitativo simple basado en perlas magnéticas recubiertas de cobalto.

Reese's el stock de perlas magnéticas por vórtice y transfiere 10 microlitros por cada muestra a un tubo de pellets las perlas usando un imán. Retire el supinato transparente para lavar las cuentas. Añadir 150 microlitros de tampón aglutinante.

Coseche las cuentas con un imán y retire el supinato después de un segundo lavado. Vuelva a suspender las perlas en 40 microlitros de tampón aglutinante para cada muestra a controlar. Para el fondo en la muestra uno, prepare un pocillo sin virus radiomarcado, pero con el mismo volumen de tampón de unión para el control.

Muestra dos de 100% de actividad radiofónica. Agregue todos los componentes en un pocillo, excepto sustituya el cuerpo nano con tampón de unión. Ahora agregue 2000 recuentos por minuto de poliovirus S 35 marcado como siete cepas tipo uno en un volumen total de 80 microlitros de tampón de unión a todas las muestras.

Aceptar el control. Muestra uno. Agregue 10 microlitros de dilución de nano cuerpo a cada muestra.

Mezclar bien durante 10 segundos en una coctelera e incubar durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, agregue 40 microlitros de la suspensión de perlas magnéticas lavadas e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente bajo agitación continua, pegue las perlas con un imán y transfiera el natante SUP aclarado a un tubo para medir la radiactividad de cada muestra, transfiera 50 microlitros del supinato a un matraz de conteo. Agregue tres mililitros de mezcla de líquido de centelleo y lea sobre este aislamiento.

Tire en contra de las perlas magnéticas usadas en un tubo con agua y centrifugue 500 veces G durante dos minutos. Deseche el supinato y vuelva a suspender las perlas en seis mililitros de hidróxido de sodio 0,5 molar. A continuación, alícuota de la suspensión en varios tubos e incubar en un baño ultrasónico durante cinco minutos.

Después de peletizar las perlas con un imán y quitar el supinado, agregue un mililitro de solución de SDS al 2% a cada tubo, luego mezcle mediante vórtice y papel de aluminio durante cinco minutos. Ahora, cosecha las cuentas. Añada un mililitro de EDTA 0,2 molar pH siete a cada tubo, e incube los tubos en un baño ultrasónico durante cinco minutos.

Luego recoja las perlas, lave las perlas con un mililitro de agua tres veces seguido de un mililitro de solución de cloruro de cobalto de 10 milimolares. Coloque los tubos en una coctelera durante 10 minutos. Proceda a recolectar las perlas en un imán y resus suspenderlas en un mililitro de tampón aglutinante.

Lavar dos veces en un mililitro de etanol al 20%, finalmente resuspender las perlas en su volumen original de etanol al 20%para obtener perlas regeneradas en una concentración de 40 miligramos por mililitro. Corrija la radiactividad de fondo configurando el control. La muestra uno como el valor de radiactividad del 0% y la muestra de control dos como el valor de radiactividad del 100%.

Ahora, para cada muestra, calcule el porcentaje de radiactividad en el estado como una medida de la precipitación general del virus marcado con radio por el nano cuerpo. En este experimento se evalúa la afinidad de PVSS 38 C y el anticuerpo específico para el virus de la poliomielitis utilizando tres antígenos diferentes de poliovirus, antígeno nativo, antígeno calentado y subunidades de 14 s. Curiosamente, la radiactividad en el estado de las muestras que contienen subunidades 14 s marcadas con radio disminuye con el aumento de las concentraciones del nanocuerpo PVSS 38 C. Esto indica un aumento en la cantidad de subunidades del virus de la poliomielitis 14 s conectadas al nanocuerpo P pvs, S 38 C, e indirectamente a las perlas magnéticas.

Dado que no se observa afinidad de pvs S 38 C por la forma antigénica N y antigénica H del poliovirus, el cuerpo nano parece específico para la subunidad 14 s del poliovirus. La afinidad del nanocuerpo hacia sus antígenos, medida por este método, es específica del nanocuerpo no relacionado. Nota: uno no muestra reactividad contra las tres formas antigénicas del virus de la poliomielitis.

Este sistema produce una alta reproducibilidad, como se indica en esta curva de dosis-respuesta generada por diferentes investigadores en diferentes días. Una vez dominada esta fase líquida fiable, el ensayo de captura de afinidad se puede realizar correctamente en dos horas, reciclando los batidos incluidos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar este ensayo de captura de afinidad en fase líquida basado en latidos magnéticos al estudiar la interacción entre diferentes proteínas, especialmente cuando no se pueden usar sistemas basados en fase sólida.