Name: Una afinidad líquido fase de captura de ensayo utilizando partículas magnéticas para estudiar la interacción proteína-proteína: el ejemplo de poliomyelits-Nanobodies (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Aprende un ensayo de captura de afinidad en fase líquida con partículas magnéticas recubiertas de cobalto para estudiar interacciones proteína-proteína. Este método cuantitativo permite analizar proteínas sensibles a cambios conformacionales.

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Los autores agradecen al personal del departamento de Biotecnología Farmacéutica y Biología Molecular y sobre todo Pelsmacker Monique De la preparación del virus de la etiqueta radiactivo. Estamos muy agradecidos a Elena de Merckx y Hadewych Halewyck por sus interesantes comentarios y discusiones y Gerrit De Bleeser por su ayuda en el laboratorio. Este trabajo fue apoyado financieramente por un subsidio OZR de la Vrije Universiteit Brussel (OZR1807), el Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (G.0168.10N) y la Organización Mundial de la Salud (TSA 200 410 791). Lise Schotte es un becario predoctoral del Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO).

El principio (A) y una visión general del método (B) se muestra en la Figura 1. 1. Preparación del tampón <ol><li> Preparar Encuadernación / tampón de lavado por disolución de dihidrógeno fosfato sódico (50 mM) y cloruro de sodio (300 mM) en agua y ajustar el pH a 8,0. Adicionalmente añadir Tween 20 (0,01% (m / v) de concentración final), metionina (2% (m / v) de concentración final) y la albúmina (0,1% (m / v) de concentración final) y ajustar el volumen requerido. </li></ol> 2. Preparación de las perlas magnéticas Preparar las partículas magnéticas de acuerdo con el manual de instrucciones. En pocas palabras: <ol><li> Resuspender las perlas magnéticas usando un vórtice. </li><li> Transferencia, para cada muestra, 10 l de las perlas magnéticas resuspendidos (40 mg / ml) en un tubo. </li><li> Recoge las bolas magnéticas con un imán, hasta que el sobrenadante es claro (+ / - 30 segundos) y separar el sobrenadante con cuidado. </li><li> Lave elperlas magnéticas dos veces: volver a suspender las bolas en 150 l de unión / tampón de lavado. Migración de las perlas magnéticas a un lado del tubo utilizando un imán hasta que el sobrenadante es claro y quitar cuidadosamente el sobrenadante. </li><li> Utilizar 40 l de unión / tampón de lavado, para cada muestra, para volver a suspender las perlas (10 mg / ml). </li></ol> 3. Afinidad ensayo de captura Nota: Para medir la radiactividad de fondo (cósmico) (0% de radioactividad), ningún virus radiomarcado se añade a una muestra de control 1. En cambio, el mismo volumen Encuadernación / tampón de lavado, se añade. Nota: 100% radiactividad se define por una muestra de control 2 para que todos los componentes se añaden excepto el nanocuerpos. En cambio, el mismo volumen Encuadernación / tampón de lavado, se añade. <ol><li> Llevar 2000 cpm de 35 S etiquetados (β-radiación) poliovirus Sabin tipo de cepa 1 9, se diluyó con Encuadernación / tampón de lavado a 80 l en una placa de microtitulación de 96 pocillos. </li><li> Añadir 10 &amp; mu, l de dilución nanocuerpos a los pocillos. </li><li> Mezclar durante unos 10 segundos con un agitador. </li><li> Permitir que las muestras se incuban durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Añadir 40 l de la suspensión lavada perlas magnéticas y se incuba durante 10 minutos a temperatura ambiente, bajo agitación continua. </li><li> Separar las perlas y el sobrenadante utilizando un imán y transferir el sobrenadante aclarado en un tubo. </li></ol> 4. La medición de la radiactividad <ol><li> Transferir 50 l del sobrenadante de la etapa 3.6 en un matraz de escrutinio. </li><li> Añadir 3 ml de líquido de centelleo y se mezcla. Medir la radiactividad en un contador de centelleo β-. </li></ol> 5. El reciclaje de las perlas <ol><li> Recoger las perlas magnéticas utilizadas en un tubo y se centrifuga a 500 xg durante 2 minutos o hasta que un sobrenadante claro se obtiene. </li><li> Eliminar el sobrenadante y resuspender las cuentas en 6 ml de NaOH 0,5 M. </li><li> Transferir la suspensión a multipltubos electrónicos y se incuba en un baño de ultrasonidos durante 5 minutos. </li><li> Utilizar los imanes para recoger las perlas magnéticas y separar el sobrenadante. </li><li> Añadir 1 ml de SDS al 2%-solución a cada tubo y resuspender utilizando un vórtice. Se hierve durante 5 minutos. </li><li> Recoger las perlas y separar el sobrenadante. Resuspender las perlas en 1 ml de EDTA 0,2 M (pH = 7). </li><li> Incubar los tubos en un baño de ultrasonidos durante 5 minutos y una vez más, separar el sobrenadante. </li><li> Añadir 1 ml de agua a cada tubo y resuspender las perlas. Recoger las perlas y separar el sobrenadante. Repita este paso de lavado dos veces. </li><li> Eliminar el sobrenadante y resuspender las perlas en 1 ml de 10 mM CoCl 2 solución. Colocar en un agitador durante 10 minutos. </li><li> Eliminar el sobrenadante utilizando un imán para recoger las perlas y resuspender en 1 ml de enlace / tampón de lavado. </li><li> Eliminar el sobrenadante y lavar las perlas dos veces utilizando 1 ml de 20% (v / v) de etanol </li><li> Resuspender las perlas de su volumen original de 20% (v / v) ethanol para obtener perlas regeneradas en una concentración de 40 mg / ml. </li></ol> 6. Interpretación de los Resultados <ol><li> Muestra de control 1, en la que se añadió ningún virus radiomarcado, se utiliza para corregir la radioactividad de fondo y para establecer el valor radiactividad 0%. Muestra de control 2, que no contiene nanocuerpos y donde por consiguiente, todos los virus radiomarcado permanece en el sobrenadante, se establece como el valor radiactividad 100%. </li><li> El porcentaje de radiactividad en el sobrenadante (= un%) es una medida de la precipitación total (= 100 - un%) del virus radiomarcado por el nanocuerpos. </li></ol> 7. Los resultados representativos Los resultados representativos para este ensayo de captura de afinidad se muestran en las figuras 2, 3 y 4. En la Figura 2, la afinidad de PVSS38C, una específica para nanocuerpos poliovirus, se muestra. La afinidad de PVSS38C fue probado para tres diferentes antígenos de poliovirus: Nativo-antígeno (N-antígeno), climatizada antígeno (H-antígeno) y las subunidades 14S. N-antígeno es el virus intacto que es infeccioso. Cuando el virus se calienta (20 minutos a 56 ° C) o unida a una superficie sólida (resultados no publicados), la conformación de los cambios cápside, resultando en una pérdida (parcial) del ARN viral y la proteína de la cápside VP4, y vacío cápsides se forman que luego se llama H-antígenos. Subunidades 14S son intermedios de montaje. Estos antígenos son reconocidos por los diferentes conjuntos de anticuerpos después de la vacunación 10 y por lo tanto, poseen epítopos antigénicos y sitios diferentes. En la figura el porcentaje de la radiactividad se encuentra en el sobrenadante se representa como una función de la concentración de Nanobodies. Se puede observar que la radioactividad en el sobrenadante de las muestras que contienen radiomarcados subunidades 14S disminuye con concentraciones crecientes de la PVSS38C nanocuerpos. Esto puede traducirse como un aumento en la cantidad de poliovirus 14S Con subunidadesconectado al PVSS38C nanocuerpos e indirectamente a las perlas magnéticas. El título de la captura (= la concentración de Nanobodies necesario para capturar 50% del virus radiomarcado) puede ser calculada como gráficamente 0.099 nM. N afinidad de PVSS38C para la N-antigénica y H-antigénica forma de poliovirus se observa. A partir de estos datos se interpreta que PVSS38C está interactuando con un epítopo que es exclusivamente presentes en la subunidad 14S y no en las dos formas antigénicas otros de poliovirus. Para demostrar que la pérdida de la radiactividad del sobrenadante es sólo debido a la afinidad específica de la nanocuerpos hacia sus antígenos, el mismo ensayo se realizó con NB1, un nanocuerpos generada contra el regulador transcripcional de lrpB sulfataricus Sulfolobus y se sabe que no tienen ninguna interacción con cualquier antígeno de poliovirus. El resultado de este ensayo se muestra en la Figura 3. Todos los virus radiomarcado permanece en los sobrenadantes que muestran que no hay reactividad deNB1 en contra de las tres formas antigénicas del virus de la polio. Reproducibilidad de los resultados fue probado por repetir el experimento para un total de ocho veces para un determinado Nanobodies (es decir, PVSP29F) en días diferentes y por diferentes personas. Los resultados se muestran en la Figura 4. El valor medio de la radiactividad porcentaje en el sobrenadante se calculó para cada concentración nanocuerpos y está representado en correspondencia con su desviación estándar. <img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3937/3937fig1.jpg" /> Figura 1. Una visión general del principio de (A) y el método (B) del ensayo. A. Su-etiquetados nanocuerpos que reconocen específicamente un antígeno determinado poliovirus será capaz de interactuar con las perlas magnéticas recubiertas de cobalto y se precipitará el virus marcado radiactivamente. Nanocuerpos B. Su-etiquetados se añaden a poliovirus marcado radiactivamente y se incubaron. El cobalto-perlas magnéticas recubiertas sonagregado y separación magnética del antígeno unido / no unido se realiza. La radiactividad del sobrenadante y se mide la cantidad de antígeno capturado puede ser derivado. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3937/3937fig2.jpg" /> Figura 2. Magnética perlas de captura por afinidad de los antígenos de poliovirus diferentes por nanocuerpos PVSS38C. El porcentaje de la radiactividad se encuentra en el sobrenadante se representa como una función de la concentración de PVSS38C. Por 14S una relación concentración-respuesta se puede encontrar, que muestra la interacción de PVSS38C con un epítopo presente exclusivamente en 14S. No hay interacción significativa con N-, ni H-antígeno se puede detectar, aunque un insignificante no específica capturar a concentraciones muy altas se nota. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3937/3937fig3.jpg" /> Figura 3. Magnética perlas de captura por afinidad de los antígenos de poliovirus diferentes por nanocuerpos NB1 </strong&gt;. El porcentaje de la radiactividad se encuentra en el sobrenadante se representa como una función de la concentración de NB1. NB1 se sabe que tiene ninguna interacción con cualquier virus de la polio-antígeno o subunidad. Desde 100% de la radiactividad se encuentra en el sobrenadante, ningún virus era no unido específicamente a NB1. La pérdida de radiactividad en la figura 2 es por lo tanto, sólo debido a la afinidad específica de la nanocuerpos hacia sus antígenos. <img alt="Figura 4." src="/files/ftp_upload/3937/3937fig4.jpg" /> Figura 4. Reproducibilidad del ensayo. El valor medio de la radiactividad porcentaje en el sobrenadante se representa como una función de la concentración de Nanobodies. El experimento se repitió ocho veces en días diferentes y por diferentes personas. La desviación estándar se representa como barras verticales.

<ol><li>Thys, B., Schotte, L., Muyldermans, S., Wernery, U., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+antiviral+activity+of+single+domain+antibody+fragments+against+poliovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">In vitro antiviral activity of single domain antibody fragments against poliovirus.</a> Antiviral Res. 87, 257-264 (2010).</li>
<li>Meloen, R. H., Briaire, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+the+cross-reacting+antigens+on+the+intact+foot-and-mouth+disease+virus+and+its+12S+subunits+with+antisera+against+the+structural+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">A study of the cross-reacting antigens on the intact foot-and-mouth disease virus and its 12S subunits with antisera against the structural proteins.</a> J. Gen. Virol. 51, 107-116 (1980).</li>
<li>Vrijsen, R., Rombaut, B., Boeye, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+quantitative+protein+A+micro-immunoprecipitation+method%3A+assay+of+antibodies+to+the+N+and+H+antigens+of+poliovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple quantitative protein A micro-immunoprecipitation method: assay of antibodies to the N and H antigens of poliovirus.</a> J. Immunol. Methods. 59, 217-220 (1983).</li>
<li>Rombaut, B., Jore, J., Boeye, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+competition+immunoprecipitation+assay+of+unlabeled+poliovirus+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A competition immunoprecipitation assay of unlabeled poliovirus antigens.</a> J. Virol. Methods. 48, 73-80 (1994).</li>
<li>Kessler, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+antigens+from+cells+with+a+staphylococcal+protein+A-antibody+adsorbent%3A+parameters+of+the+interaction+of+antibody-antigen+complexes+with+protein+A%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of antigens from cells with a staphylococcal protein A-antibody adsorbent: parameters of the interaction of antibody-antigen complexes with protein A.</a> J. Immunol. 115, 1617-1624 (1975).</li>
<li>Hamers-Casterman, C., Atarhouch, T., Muyldermans, S., Robinson, G., Hamers, C., Songa, B. ajyana, Bendahman, E., N,, Hamers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+antibodies+devoid+of+light+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring antibodies devoid of light chains.</a> Nature. 363, 446-448 (1993).</li>
<li>Arbabi Ghahroudi, M., Desmyter, A., Wyns, L., Hamers, R., Muyldermans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+and+identification+of+single+domain+antibody+fragments+from+camel+heavy-chain+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies.</a> FEBS Lett. 414, 521-526 (1997).</li>
<li>Muyldermans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+domain+camel+antibodies%3A+current+status%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Single domain camel antibodies: current status.</a> Rev. Mol. Biotechnol. 74, 277-302 (2001).</li>
<li>Rombaut, B., Vrijsen, R., Boeye, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+evolution+in+poliovirus+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Virol%22%5BJournal%5D)">Epitope evolution in poliovirus maturation.</a> Arch. Virol. 76, 289-298 (1983).</li>
<li>Brioen, P., Sijens, R. J., Vrijsen, R., Rombaut, B., Thomas, A. A., Jackers, A., Boeye, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybridoma+antibodies+to+poliovirus+N+and+H+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Virol%22%5BJournal%5D)">Hybridoma antibodies to poliovirus N and H antigen.</a> Arch. Virol. 74, 325-330 (1982).</li>
<li>Thys, B., Saerens, D., Schotte, L., De Bleeser, G., Muyldermans, S., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+quantitative+affinity+capturing+assay+of+poliovirus+antigens+and+subviral+particles+by+single-domain+antibodies+using+magnetic+beads%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple quantitative affinity capturing assay of poliovirus antigens and subviral particles by single-domain antibodies using magnetic beads.</a> J. Virol. Methods. 173, 300-305 (2011).</li>
<li>Wild, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWild%2C+D+%22The+Immunoassay+Handbook%22">The Immunoassay Handbook</a>. , Third edition, Elsevier. (2005).</li>
<li>Kremser, L., Konecsni, T., Blaas, D., Kenndler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+labeling+of+human+rhinovirus+capsid+and+analysis+by+capillary+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescence labeling of human rhinovirus capsid and analysis by capillary electrophoresis.</a> Anal. Chem. 76, 4175-4181 (2004).</li>
<li>Pelkmans, L., Kartenbeck, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caveolar+endocytosis+of+simian+virus+40+reveals+a+new+two-step+vesicular-transport+pathway+to+the+ER%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Caveolar endocytosis of simian virus 40 reveals a new two-step vesicular-transport pathway to the ER.</a> Nat. Cell Biol. 3, 473-483 (2001).</li>
</ol>

No tenemos nada que revelar.

En el protocolo, la radiactividad de la interacción con el antígeno nanocuerpos se define como la pérdida de virus radiomarcado a partir del sobrenadante. Por lo tanto la cantidad de radiactividad precipitada (= 100 - un%) (unido a las perlas magnéticas) se puede estimar en una forma indirecta por la radioactividad en el sobrenadante (= un%). Por otro lado, también es posible medir la radiactividad de la fracción precipitada la envolvente de antígeno en una forma particular a eluyendo los inmunocomplejos de las perlas m...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Nombre del reactivo</strong</td&gt;<td<strong&gt; Empresa</strong</td&gt;<td<strong&gt; Número de catálogo</strong</td&gt;<td<strong&gt; Comentarios</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Dynabeads Su etiqueta de aislamiento y Jalón</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 101.03D</td&gt;<td&gt; Las perlas magnéticas</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; OptiPhase &#39;HiSafe&#39; 2</td&gt;<td&gt; Perkin Elmer</td&gt;<td&gt; 1200 - 436</td&gt;<td&gt; Centelleo líquido</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

una afinidad líquido fase de captura de ensayo utilizando partículas magnéticas para estudiar la interacción proteína-proteína: el ejemplo de poliomyelits-nanobodies

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

En este artículo, un simple, cuantitativo, la afinidad de la fase líquida ensayo de captura se presenta. Siempre que una proteína puede ser marcados y etiquetados otra proteína, este método puede ser aplicado para la investigación de las interacciones proteína-proteína. Se basa en una mano en el reconocimiento de la proteína marcados por perlas magnéticas recubiertas de cobalto y en la otra mano en la interacción entre la proteína marcados y una segunda proteína específica que se etiqueta. En primer lugar, las proteínas marcadas y etiquetada se mezclan y se incuban a temperatura ambiente. Las perlas magnéticas, que reconocen la etiqueta, se añaden y la fracción unida de proteína marcada se separa de la fracción no unida mediante imanes. La cantidad de proteína marcada que es capturada se puede determinar de una manera indirecta mediante la medición de la señal de la proteína marcada se mantuvo en la fracción no unida. La fase líquida se describe ensayo de afinidad es muy útil cuando las proteínas conformacionales de conversión son sensibles culoAyed. El desarrollo y la aplicación del ensayo se demuestra por la interacción entre poliovirus y poliovirus reconociendo nanocuerpos 1. Dado que el poliovirus es sensible a la conversión conformacional 2 cuando está unido a una superficie sólida (resultados no publicados), el uso de ELISA es limitado y un sistema basado en fase líquida, por tanto, se prefiere. Un ejemplo de un sistema de fase líquida basada utiliza a menudo en polioresearch 3,4 es la proteína de micro-inmunoprecipitación Un ensayo 5. A pesar de que esta prueba ha demostrado su aplicabilidad, se requiere un Fc-estructura, que está ausente en los Nanobodies 6,7. Sin embargo, como otra oportunidad, estos interesantes y estable de un solo dominio anticuerpos 8 puede ser fácilmente diseñado con diferentes etiquetas. El ampliamente utilizado (Su) 6-etiqueta muestra afinidad por los iones bivalentes tales como níquel o cobalto, que puede a su vez, ser fácilmente recubierta por perlas magnéticas. Por lo tanto, desarrolló este cuantitativo simpleensayo de afinidad de captura sobre la base de cobalto perlas magnéticas recubiertas. Poliovirus se marcó con 35 S para permitir una interacción sin obstáculos con los Nanobodies y para hacer una detección cuantitativa factible. El método es fácil de realizar y puede establecerse con un bajo costo, que se ve apoyada por la posibilidad de regenerar eficazmente las perlas magnéticas.

En este artículo, un simple, cuantitativo, la afinidad de la fase líquida ensayo de captura se presenta. Es una técnica fiable basado en la interacción entre partículas magnéticas y las proteínas marcadas (por ejemplo nanocuerpos) en una mano y la afinidad entre la proteína marcados y una segunda proteína, con la etiqueta (por ejemplo, virus de la polio) en el otro.

Una afinidad líquido fase de captura de ensayo utilizando partículas magnéticas para estudiar la interacción proteína-proteína: el ejemplo de poliomyelits-Nanobodies

En este artículo, se presenta un ensayo de captura por afinidad en fase líquida, cuantitativo y sencillo. Siempre que una proteína pueda etiquetarse y otra proteína...

Este protocolo utiliza la interacción entre el poliovirus y los nanocuerpos que reconocen al poliovirus para demostrar un ensayo sencillo de captura por afinidad en fase líquida y cuantitativo. Principalmente, se utilizan perlas magnéticas recubiertas de cobalto para retener las proteínas marcadas y cualquier proteína marcada con radio que interactúe con ellas. Primero, mezcle las proteínas marcadas y etiquetadas e incube a temperatura ambiente.Luego agregue perlas magnéticas que reconozcan la etiqueta, separe la fracción unida de la proteína marcada de la fracción no unida utilizando imanes. Luego mida la señal de la proteína marcada encontrada en la fracción no unida y determine la cantidad de proteína marcada presente en la fracción no unida. Los resultados de este ensayo de afinidad en fase líquida son extremadamente útiles cuando se analizan proteínas sensibles a la conversión conformacional.Este ensayo de captura por afinidad en fase líquida puede proporcionar información sobre la interacción entre el poliovirus, nanoanticuerpos reconocedores y diferentes antígenos del poliovirus. El método también puede aplicarse a otras interacciones proteína-proteína, siempre que una proteína pueda ser marcada y la otra pueda detectarse. Tuvimos por primera vez la idea de este método cuando nos interesó investigar la interacción entre el poliovirus, nanoanticuerpos reconocedores y diferentes antígenos del poliovirus.Dado que el poliovirus es sensible a la conversión conformacional cuando se une a una superficie sólida, el uso del LSA está limitado. Por lo tanto, debe preferirse un sistema basado en fase líquida. Un ejemplo de un sistema así basado en fase líquida, comúnmente utilizado en la investigación del poliovirus, es la microproteína.Un ensayo de inmunoprecipitación. Aunque esta prueba ha demostrado su aplicabilidad, requiere la estructura cristalizada de un anticuerpo convencional, que está ausente en los nanocuerpos. Estos nanocuerpos, que son anticuerpos monocatenarios interesantes y muy estables, pueden ser fácilmente modificados con diferentes textos.El sistema ampliamente utilizado His-tag muestra afinidad por iones bivalentes, como el níquel y el cobalto, que a su vez pueden recubrirse fácilmente sobre perlas magnéticas. Por lo tanto, desarrollamos un ensayo sencillo de captura por afinidad cuantitativo basado en perlas magnéticas recubiertas con cobalto.Reese el stock de perlas magnéticas mediante vortex y transfiera 10 microlitros para cada muestra a un tubo; haga un pellet de las perlas utilizando un imán. Retire el sobrenadante para lavar las perlas. Añada 150 microlitros de tampón de unión.Recupere las perlas utilizando un imán y elimine el sobrenadante tras un segundo lavado. Re suspenda las perlas en 40 microlitros de tampón de unión por cada muestra para controlar. Para el fondo en la muestra uno, prepare un pocillo sin virus radiomarcado, pero con un volumen igual de tampón de unión como control.Muestre dos de 100 % de actividad radiactiva. Añada todos los componentes en un pocillo, excepto que sustituya el nanocuerpo por tampón de unión. Ahora añada 2000 cuentas por minuto del poliovirus marcado con S 35, cepa siete, tipo uno, en un volumen total de 80 microlitros de tampón de unión a todas las muestras.Acepte el control. Muestra uno. Añada 10 microlitros de dilución de nanocuerpo a cada muestra.Mezcle bien durante 10 segundos en un agitador e incube una hora a temperatura ambiente. A continuación, añada 40 microlitros de la suspensión de perlas magnéticas lavadas e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación continua, separe las perlas mediante un imán y transfiera el sobrenadante clarificado a un tubo para medir la radiactividad de cada muestra; transfiera 50 microlitros del sobrenadante a un frasco de conteo. Añada tres mililitros de mezcla de líquido de centelleo y lea en este aislamiento.Contrarrestar la extracción de las perlas magnéticas usadas en un tubo utilizando agua y centrifugar a 500 ×g durante dos minutos. Desechar el sobrenadante y resuspender las perlas en seis mililitros de hidróxido de sodio 0,5 molar. A continuación, distribuir la suspensión en varios tubos e incubar en un baño ultrasónico durante cinco minutos.Después de centrifugar las perlas con un imán y eliminar el sobrenadante, añada un mililitro de solución de SDS al 2% a cada tubo, luego mezcle mediante vortex y envuelva con papel de aluminio durante cinco minutos. Ahora, recoja las perlas. Añada un mililitro de EDTA 0,2 molar, pH 7, a cada tubo e incube los tubos en un baño ultrasónico durante cinco minutos.Luego, recolecte los gránulos, lave los gránulos con un mililitro de agua tres veces, seguido de un mililitro de solución de cloruro de cobalto 10 milimolar. Coloque los tubos en un agitador durante 10 minutos. A continuación, retire los gránulos mediante un imán y resuspenda en un mililitro de tampón de unión.Lave dos veces en un mililitro de etanol al 20%. Finalmente, re suspenda las perlas en su volumen original de etanol al 20% para obtener perlas regeneradas en una concentración de 40 miligramos por mililitro. Corrija la radiactividad de fondo ajustando el control. Tome una muestra como valor de radiactividad del 0% y la muestra de control dos como valor de radiactividad del 100%.Ahora, para cada muestra, calcule el porcentaje de radioactividad en el sobrenadante como una medida de la precipitación total del virus marcado con radioisótopos por el nanocuerpo. Este experimento evalúa la afinidad de PVSS 38 C y un anticuerpo específico para el poliovirus utilizando tres antígenos diferentes del poliovirus: antígeno nativo, antígeno calentado y subunidades de 14 s. Curiosamente, la radioactividad en el sobrenadante de las muestras que contienen subunidades de 14 s marcadas con radioisótopos disminuye con el aumento en la concentración del nanocuerpo PVSS 38 C. Esto indica un incremento en la cantidad de subunidades de 14 s del poliovirus unidas al nanocuerpo PVSS 38 C y, de forma indirecta, a las perlas magnéticas.Dado que no se observa afinidad de pvs S 38 C por la forma antigénica N y la forma antigénica H del poliovirus, el nanocuerpo parece ser específico para la subunidad de 14 s del poliovirus. La afinidad del nanocuerpo hacia sus antígenos medida mediante este método es específica, ya que el nanocuerpo no relacionado NB uno no muestra reactividad contra las tres formas antigénicas del poliovirus.Este sistema produce una alta reproducibilidad, tal como se indica en esta curva de respuesta a la dosis generada por diferentes investigadores en distintos días. Una vez dominado, este ensayo de captura por afinidad en fase líquida y confiable puede realizarse adecuadamente en menos de dos horas, incluyendo el reciclaje de las perlas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar este ensayo de captura por afinidad en fase líquida basado en perlas magnéticas al estudiar la interacción entre diferentes proteínas, especialmente cuando no pueden usarse sistemas basados en fase sólida.

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Investigación

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Biología

La célula permeable reticulante DSP [ditiobis (propionato de succinimidilo)] estabiliza interacciones transitoria e...

El aislamiento de lábil Multi-complejos de proteínas por In vivo Control Celular entrecruzamiento y Inmuno-cromatografía de afinidad magnética

Para probar la interacción de una proteína con su objetivo de lípidos se utilizó MACS y anexina V conjugada con partículas magnéticas y de las vesículas de lípidos sintetizados a partir de los lípidos de destino y fosfatidilserina anexina V vinculante. Proteínas unidas a los lípidos de destino se co-purificados y analizados después de la elución de las cuentas.

Lípidos vesículas mediada por cromatografía de afinidad utilizando magnética clasificación de células activadas (LIMACS): un nuevo método para analizar la interacción de proteínas y lípidos

Una partícula desarrollado recientemente la novela de aglutinación (PA) de ensayo utilizando virus molécula del receptor permite una identificación rápida y fácil de poliovirus (PV). En este artículo vamos a mostrar el procedimiento para el ensayo de PA para la identificación de PV.

Método de aglutinación de partículas para la identificación de poliovirus

Tandem purificación de afinidad es un enfoque sólido para la identificación de socios de la unión a proteínas. Como prueba de concepto, esta metodología se aplicó a la traducción factor eIF4E bien caracterizado iniciación a co-precipitado los factores implicados en la célula huésped iniciación de la traducción. Este método se adapta fácilmente a cualquier proteína celular o viral.

Identificación de los socios interacción de proteínas en tándem de purificación de afinidad

En este video, demostramos un ensayo de inmunoprecipitación, llamado ensayo de captura VLP, para aislar partículas similares a virus que muestran antígenos, o VLP, de una muestra. El antígeno se une a anticuerpos específicos unidos a perlas magnéticas, formando un complejo antígeno-anticuerpo inmovilizado que luego se separa y almacena para su posterior análisis.

El ensayo de captura de partículas similares a virus: un método para aislar VLP que muestran antígenos de una muestra utilizando perlas magnéticas conjugadas con anticuerpos neutralizantes

Aquí se describe protocolos para romper las células de mamíferos por molienda en estado sólido a una temperatura criogénica, producir un extracto celular a partir del polvo de células resultante, y aislar los complejos de proteínas de interés por captura de afinidad sobre perlas paramagnéticas a escala micrométrica de anticuerpos acoplados.

Complejo de proteínas de captura por afinidad a partir de células de mamífero Cryomilled

Los virus o vesículas extracelulares fueron inmunocapturados con nanopartículas magnéticas de 15 nm acopladas a anticuerpos que reconocen antígenos de superficie. Los viriones o vesículas capturadas se marcaron con anticuerpos fluorescentes contra otros antígenos de superficie. Los complejos resultantes se separaron en un campo magnético alto y se analizaron con citómetros de flujo convencionales activados por fluorescencia.

Flujo Virometry para analizar antigénica Spectra de viriones y extracelular Vesículas

Las interacciones proteína-proteína pueden ocurrir tanto en el núcleo como en el citoplasma de una célula. Para investigar estas interacciones, se aplica la coinmunoprecipitación tradicional y el ensayo moderno de ligadura de proximidad. En este estudio, comparamos estos dos métodos para visualizar la distribución de las interacciones NF90-RBM3 en el núcleo y el citoplasma.

La visualización de la interacción proteína-proteína en las fracciones nucleares y citoplasmáticas de Co-inmunoprecipitación y<em&gt; In Situ</em&gt; Ligadura ensayo de proximidad

Aquí, presentamos un protocolo para detectar epítopos de neutralización en partículas similares a virus (VLP) que muestran antígenos. La inmunoprecipitación de las VLP derivadas del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) se realiza utilizando anticuerpos monoclonales específicos de glicoproteínas de la envoltura acoplados a perlas magnéticas conjugadas con proteína g. Las VLP capturadas se someten posteriormente a SDS-PAGE y western blot-análisis empleando anticuerpos específicos de gag de...

Detección de epítopos sensibles a la neutralización en antígenos mostrados en vacunas basadas en partículas similares a virus (VLP) utilizando un ensayo de captura

Aquí, describimos un inmunoensayo fluorescente multiplex recientemente desarrollado que utiliza un sistema citométrico de flujo de doble reportero para detectar simultáneamente dos epítopos únicos de proteína de pico en partículas virales intactas del coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2) que habían sido capturadas por microesferas magnéticas acopladas a la enzima convertidora de angiotensina-2.

Perfil de epítopos de proteínas de superficie en partículas virales mediante la estrategia Multiplex Dual-Reporter

Aprende un ensayo de captura de afinidad en fase líquida con partículas magnéticas recubiertas de cobalto para estudiar interacciones proteína-proteína. Este método cuantitativo permite analizar proteínas sensibles a cambios conformacionales.

Una afinidad líquido fase de captura de ensayo utilizando partículas magnéticas para estudiar la interacción proteína-proteína: el ejemplo de poliomyelits-Nanobodies (Video) | JoVE Journal

Una afinidad líquido fase de captura de ensayo utilizando partículas magnéticas para estudiar la interacción proteína-proteína: el ejemplo de poliomyelits-Nanobodies

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