La eliminación rápida de fibroblastos de alta densidad Humanos culturas de células madre embrionarias

El objetivo general del siguiente experimento es aislar colonias de células madre humanas de forma rápida y eficiente. Esto se logra cultivando células embrionarias humanas sobre una capa densa de fibroblastos embrionarios de ratón. Con el tiempo, la expansión de la población de células madre aumenta el número de células madre humanas, pero también les permite formar colonias semejantes a islas en el mes.

A continuación, se elimina la capa de met por aspiración, dejando atrás las colonias individuales de células madre embrionarias humanas. Los resultados de la tinción inmunohistoquímica para marcadores de células madre muestran que este es un método eficaz para eliminar las células alimentadoras y mantener la integridad de las colonias. Tuve la idea original de este método mientras cultivaba células en co-cultivo en nuestro laboratorio; quería salvar los cultivos de células madre de sistemas de cultivo sobreadyacentes.

Por lo tanto, el problema que la mayoría de las personas experimentarán al utilizar este sistema es la falta de experiencia en el cultivo de células madre humanas. Hemos encontrado que esta técnica es particularmente útil cuando necesitamos aislar grandes cantidades de células madre embrionarias humanas para experimentación, en comparación con otros métodos como la clasificación o la selección manual de colonias de células madre. Este método es más rápido y eficiente para aislar colonias de cultivos de alta densidad.

Los fibroblastos embrionarios de ratón deben tratarse con mitomicina C o irradiarse antes de co-cultivarlos con células madre embrionarias para impedir que pasen por división. Dos horas antes de sembrar los meph, recubrir cada placa de cultivo de 60 milímetros tratada con plasma con dos mililitros de gelatina al 0,05 %. Descongelar un vial de mes tratados, centrifugar durante cinco minutos a 1.500 RPM y sembrar. Sembrar un cultivo de aproximadamente 20.000 células por centímetro cuadrado en la placa recubierta con gelatina e incubar el cultivo durante la noche para células adherentes. Pueden iniciarse cultivos nuevos a partir de células criopreservadas o pasando los cultivos actuales a placas recubiertas con metilo. Cuando se comience con una placa que contenga colonias grandes de células madre embrionarias humanas, lavar una vez con tres mililitros de solución salina tamponada con fosfato calentada.

Añada tres mililitros de una solución de colagenasa cuatro de un miligramo por mililitro e incube de cinco a 10 minutos. A 37 grados Celsius, las células no se volverán distintas ni formarán agregados como se observa con la tripsina. Utilizando el borde de la punta de una pipeta de cinco mililitros, cree un patrón de cuadrícula sobre las colonias y rompa estas en pequeños agregados celulares.

Ahora, sosteniendo el extremo de la punta de pipeta en un ángulo perpendicular respecto a la placa de cultivo, raspe el fondo de la placa de cultivo y desprenda todas las células de la superficie. Transfiera las células a un tubo cónico para cosecharlas; centrifugue a 1000 RPM durante cinco minutos y aspire el medio. A continuación, aspire el medio de los fibroblastos embrionarios de ratón sembrados el día anterior.

Luego siembre las células madre embrionarias humanas en una proporción de uno a tres respecto a la placa original y agregue tres mililitros de medio para células madre embrionarias humanas. Las células HECS humanas se cultivan a alta densidad durante 10 a 14 días. Coloque la punta de una pipeta de aspiración en el borde de la placa y use succión para levantar suavemente el borde de la lámina de metilo.

Retire el medio del recipiente. Deje que la punta capture la lámina celular y luego mueva lentamente la punta de forma arqueada por encima de la placa. Si la lámina obstruye principalmente la pipeta, retire la lámina del cultivo.

Toque la parte superior de la placa de cultivo con un aspirador para terminar de desagregar las células y retire las células mediante una aspiración completa. Reemplace inmediatamente el medio de células madre embrionarias humanas y devuelva el cultivo a una incubadora de cultivo celular después de sembrarlas en las placas de cultivo. Este sistema de co-cultivo da como resultado colonias densas de células madre embrionarias humanas rodeadas por fibroblastos embrionarios de ratón.

La técnica de aspiración elimina el MES y produce colonias pequeñas de células madre embrionarias humanas sin alteraciones. Con muy pocos MES alrededor de la colonia intacta, las colonias de células madre embrionarias pueden experimentar una expansión significativa hasta convertirse en colonias muy grandes. Por ejemplo, esta colonia de células madre embrionarias humanas mostrada inmediatamente después del agotamiento de met se expandió en una colonia muy grande, con identificación mediante inmunofluorescencia de colonias hasta 10 días después de la met.

El agotamiento muestra que las colonias mantienen su expresión de marcadores de pluripotencia y no exhiben diferenciación hacia el destino mesodérmico. Estas imágenes de luz de transmisión muestran la morfología de colonias teñidas inmunofluorescentemente a diferentes aumentos. DAPI tiñe los núcleos de las células.

Es importante destacar que las células madre embrionarias humanas expresan los marcadores de células madre humanas SSEA-4, TRA-1-60 y TRA-1-81. Obsérvese que las imágenes muestran una colonia con bordes típicamente lisos. No expresan FLK-1, un marcador temprano de diferenciación mesodérmica, ni contienen fibroblastos, tal como se evidencia por la ausencia de tinción para DDR2.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar colonias de células madre humanas utilizando técnicas de cultivo para manipular entornos naturales. Después de dominar esta técnica, esto puede realizarse en segundos. Además, no olvide no dejar secar sus cultivos al eliminar el medio y las capas de desecho.