Name: La eliminación rápida de fibroblastos de alta densidad Humanos culturas de células madre embrionarias (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-28T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Aprende a aislar colonias de células madre embrionarias humanas de cultivos de alta densidad con fibroblastos embrionarios de ratón mediante aspiración. Esta técnica preserva la pluripotencia y permite la expansión eficiente.

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Este trabajo fue financiado por una Nueva Facultad II Premio del Instituto de Medicina Regenerativa de California (RN2-00921-1), y un premio financiado por los NIH de Investigación Nacional (F32-HL104924)

1. Preparación de los Alimentadores de embriones de ratón <ol><li> El MEFs utilizado en el co-cultivo de hESCs debe ser previamente tratada por irradiación o mitomicina C para inhibir las células de sufriendo división. </li><li> Dos horas antes de la siembra MEF, bata de cada plasma de 60 mm placa de cultivo tratado con 2 ml de gelatina al 0,05%. </li><li> Descongelar un vial de MEFs tratada y placas a ~ 20.000 células / cm 2. </li><li> Permitir que las células se adhieran durante la noche. </li></ol> 2. Siembra Co-hESCs en MEFs <ol><li> Las nuevas colonias se puede iniciar a partir de cultivos crioconservados o pases culturas actuales sobre nuevos MEF platos recubiertos, como a continuación. </li><li> Lavar la placa que contiene las colonias hESC grandes para ser pasadas 1 hora con 3 ml de PBS 1x calentado. </li><li> Añadir 3 ml de colagenasa IV / solución de PBS (1 mg / ml), y se incuba durante 5-10 minutos a 37 ° C. (Nota: Las células no se harán distintos o balón como se ha visto con tripsina). </li><li> Mientras que las células están todavía en lacolagenasa, utilizar un borde de una punta de pipeta de 5 ml, crear un patrón de rejilla en las colonias, romper en pequeños grupos de células. </li><li> Con la punta de la punta de la pipeta (realizado de una manera perpendicular a la placa de cultivo) para raspar el fondo de la placa de cultivo, desplazando todas las células de la superficie. </li><li> Recoger las células en un tubo Falcon y giran a (1000 rpm) durante 5 min. </li><li> Después de la centrifugación, se aspira el medio, dejando el sedimento de células en el tubo Falcon. </li><li> Aspirar el medio desde el MEF MEFs chapado en el día antes. </li><li> Re-placa las células a una proporción de 1:3 de la placa original, y se alimentan con 3 ml de medio de hESC </li></ol> 3. Agotan MEFs de la Co-cultura Nota: Humanos culturas ESC debe ser a alta densidad, por lo general entre 10 y 14 días de cultivo. <ol><li> Colocar la punta de una pipeta de aspiración en el borde de la placa y permitir la succión para tirar suavemente hasta el borde de la hoja de MEF. </li><li> ReMove los medios de comunicación de la antena, y permita que la punta para coger la capa celular y mueva lentamente la punta de forma arqueada por encima de la placa. Nota: La hoja puede atascar en la punta de la pipeta, pero esto no es problemático ya que no debe impedir que el usuario manualmente tirando de la hoja de la superficie de la placa de cultivo. Si las células están pegados a la final del aspirador, puede usar la parte superior de la placa de cultivo para romper la lámina de células para la aspiración completa. </li><li> Reemplace inmediatamente hESC medio, y poner la placa en la incubadora. </li></ol> 4. Los resultados representativos El resultado final del proceso de eliminación MEF produce pequeñas colonias hESC inalteradas (Figura 1D) capaces de someterse a la expansión significativa en colonias muy grandes (Figura 2) mientras se mantiene la expresión de los fabricantes de pluripotencia SSEA-4, octubre ¾, y TRA 1-81 (figura 3). Figura 1. ESC morfología de las colonias antes y después de la extracción MEF. Humanos colonias de células madre embrionarias en un día) 1 y B) el día 2 después de la siembra en placas de cultivo. C) de alta densidad Humanos colonias de células madre embrionarias (H7), rodeada de MEFs. Las dos colonias hESC se describen en rayas rojas. D) Después de la eliminación MEF mediante la técnica de aspiración descrito, nos quedamos con una colonia de células madre aisladas con muy pocos MEFs que rodea la colonia intacta. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3951/3951fig2.jpg" /> Figura 2. Expansión ESC Colonia 10 días después de la extracción MEF. HESC La colonia original inmediatamente después de agotamiento MEF (izquierda) se le permite expandirse en una colonia muy grande (derecha) aproximadamente 800 micras, 10x. Tenga en cuenta que la colonia original se forma la imagen con el mismo aumento (10x) como la colonia compuesto. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3951/3951fig3.jpg" /> Figura 3. La inmunotinción de las colonias hESC MEF-agotado. Identificación por inmunofluorescencia de las colonias de hasta 10 días después del agotamiento MEF demuestra que las colonias de mantener su expresión de marcadores de pluripotencia como evidente por octubre ¾, SSEA-4, y la tinción de Tra-1-81. Además, estas colonias de células madre no muestran diferenciación hacia un destino mesodérmico, indicado por la ausencia de Flk-1. A, E, I, y M) son imágenes de transmisión de luz de las colonias immunoflouscently manchadas, 20, 10, 10 y 2x, . respectivamente B, F, J y N) mostrar los núcleos -. células teñidas con DAPI de las colonias immunofluorescently manchadas, 20, 10, 10 y 2x, respectivamente CD) muestran la expresión demarcador de células madre humanas SSEA-4 solamente, y la imagen compuesta, 20x. GH) muestran la expresión de células madre humano octubre marcador ¾ sólo, y la imagen compuesta, KL 10x.) muestran la expresión de marcadores de células madre humanas Tra 1-81 sólo y la imagen compuesta, 10x. MP) La última fila si las imágenes muestran una colonia retratar las fronteras típicas liso visto con este aumento, 2x, y estas colonias no expreso O) Flk-1, un marcador temprano de la diferenciación del mesodermo, ni que P) contiene fibroblastos como se muestra por la ausencia de tinción de DDR2. Vídeo Suplementario. Extracción de fibroblastos por aspiración de planos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3951/3951movie1.mp4" target="_blank">Haga clic aquí para ver la película</a> .

<ol><li>Bongso, A., Fong, C. Y., Ng, S. C., Ratnam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+inner+cell+mass+cells+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of inner cell mass cells from human blastocysts.</a> Hum. Reprod. 9, 2110-2117 (1994).</li>
<li>Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+from+human+blastocysts%3A+somatic+differentiation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro.</a> Nat. Biotechnol. 18, 399-404 (2000).</li>
<li>Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Thomas, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated%2C+scalable+culture+of+human+embryonic+stem+cells+in+feeder-free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Automated, scalable culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions.</a> Biotechnol Bioeng. 102, 1636-1644 (2009).</li>
<li>Kolhar, P., Kotamraju, V. R., Hikita, S. T., Clegg, D. O., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+surfaces+for+human+embryonic+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Synthetic surfaces for human embryonic stem cell culture.</a> J. Biotechnol. 146, 143-146 (2010).</li>
<li>Hovatta, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+culture+system+using+human+foreskin+fibroblasts+as+feeder+cells+allows+production+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells.</a> Hum. Reprod. 18, 1404-1409 (2003).</li>
<li>McKay, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+feeder+cell+line+for+derivation+and+culture+of+hESc%2FhiPSc%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Human feeder cell line for derivation and culture of hESc/hiPSc.</a> Stem Cell Res. 7, 154-162 (2011).</li>
<li>Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).</li>
<li>Stein, G. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStein%2C+GS+%22Thawing%2C+Seeding%2C+and+Changing+Medium+of+Human+Embryonic+Stem+Cells%22">Thawing, Seeding, and Changing Medium of Human Embryonic Stem Cells</a>. Shi, M. J., Stencel, K., Borowski, M. , John Wiley & Sons, Inc. (2010).</li>
<li>Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traditional+human+embryonic+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Traditional human embryonic stem cell culture.</a> Methods Mol. Biol. 767, 107-123 Forthcoming.</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El método presentado en este manuscrito ofrece una alternativa rápida y menos costosa para la eliminación de células alimentadoras de fibroblastos humanos de cultivos de células embrionarias. La eliminación exitosa de los fibroblastos es dependiente de la existencia de una monocapa confluente herméticamente de estas células que se desarrolla en más cultivos de células madre. Después de 7-10 días, las colonias que crecen hESC empujará los fibroblastos de conexión en una dirección hacia fuera, la generación de una monocap...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> DDR2 </td><td> Santa Cruz </td><td> 7555 </td><td> Fibroblastos Marker </td></tr><tr><td> Dapi </td><td> Calbiochem </td><td> 268298 </td><td> Núcleo Celular Marker </td></tr><tr><td> SSEA-4 </td><td> Millipore </td><td> MAB4304 </td><td> Human ESC Marker </td></tr><tr><td> Oct 3/4 </td><td> Santa Cruz </td><td> 9081 </td><td> Human ESC Marker </td></tr><tr><td> Flk-1 </td><td> BD Pharma </td><td> 555307 </td><td> Marcador de diferenciación temprana </td></tr><tr><td> Tra-1-81 </td><td> Acris </td><td> AM20377AF4-S </td><td> Human ESC Marker </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Tabla de razones específicascaballeros utilizada para la inmunotinción hESC.

la eliminación rápida de fibroblastos de alta densidad humanos culturas de células madre embrionarias

Rapid Fibroblast Removal from High Density Human Embryonic Stem Cell Cultures

Fibroblastos de embriones de ratón (MEFs) se utilizaron para establecer células madre embrionarias humanas (hESCs) los cultivos tras el aislamiento de blastocisto 1. Este sistema de alimentación mantiene hESCs de someterse a la diferenciación espontánea durante la expansión celular. Sin embargo, este método de co-cultivo es laborioso, requiere de personal altamente capacitado y pureza rendimientos hESC bajo 4. Muchos laboratorios han intentado reducir al mínimo el número de células de alimentación en cultivos de células madre (es decir, la incorporación de la matriz platos recubiertos o otros tipos de células alimentadoras 5-8). Estos sistemas de cultivos modificados han mostrado cierta promesa, pero no han suplantado el método estándar para el cultivo de hESCs con mitomicina C tratados con fibroblastos de ratón embrionaria, con el fin de retardar la diferenciación espontánea no deseada de los cultivos de células madre. Por lo tanto, las células de alimentación utilizados en la expansión de células madre debe ser removido durante experimentos de diferenciación. Aunque se dispone de varias técnicas para purificar el co hESClonies (FACS, Mac, o el uso de vectores resistentes a los fármacos) de los alimentadores, estas técnicas son mano de obra intensiva, costosa y / o contrarios a la hESC. El objetivo de este proyecto era inventar un método de purificación que permite la recolección de una población pura de hESCs. Hemos observado que en un cultivo confluente hESC, la población MEF se puede eliminar mediante una aspiración simple y rápido de la hoja de MEF. Esta eliminación es dependiente de varios factores, incluyendo lateral de célula a célula de unión de MEFs que tienen una menor afinidad de unión a la placa de cultivo de estireno, y la capacidad de las colonias de células madre para empujar los fibroblastos hacia el exterior durante la generación de su propio &quot; nicho &quot;. El hESC fueron examinados por SSEA-4, Oct3 / 4 y expresión Tra 1-81 hasta 10 días después de la eliminación del MEF para asegurar el mantenimiento de la pluripotencia. Por otra parte, las colonias de células madre fueron capaces de continuar creciendo en grandes formaciones de después de la eliminación MEF, que proporciona un nivel adicional de expansión hESC.

A pesar de los esfuerzos en curso a las culturas de transición a la alimentación libre de condiciones, la derivación y la cultura de células madre embrionarias humanas (hESC) siguen siendo en gran parte dependiente en co-cultivos con alimentadores de embriones de ratón (MEFs). A continuación, se muestra una nueva metodología para la rápida eliminación de los alimentadores a partir de cultivos celulares de grado terapéutico antes de la experimentación.

La eliminación rápida de fibroblastos de alta densidad Humanos culturas de células madre embrionarias

Se utilizaron fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) para establecer cultivos de células madre embrionarias humanas (hESC) tras el aislamiento del blastocisto1. Este sistema de células alimentadoras...

El objetivo general del siguiente experimento es aislar colonias de células madre humanas de forma rápida y eficiente. Esto se logra cultivando células embrionarias humanas sobre una capa densa de fibroblastos embrionarios de ratón. Con el tiempo, la expansión de la población de células madre aumenta el número de células madre humanas, pero también les permite formar colonias semejantes a islas en el mes.A continuación, se elimina la capa de met por aspiración, dejando atrás las colonias individuales de células madre embrionarias humanas. Los resultados de la tinción inmunohistoquímica para marcadores de células madre muestran que este es un método eficaz para eliminar las células alimentadoras y mantener la integridad de las colonias. Tuve la idea original de este método mientras cultivaba células en co-cultivo en nuestro laboratorio; quería salvar los cultivos de células madre de sistemas de cultivo sobreadyacentes.Por lo tanto, el problema que la mayoría de las personas experimentarán al utilizar este sistema es la falta de experiencia en el cultivo de células madre humanas. Hemos encontrado que esta técnica es particularmente útil cuando necesitamos aislar grandes cantidades de

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

En este artículo se describe un protocolo para el aislamiento y mantenimiento de cultivos primarios de fibroblastos de la piel y el tejido pulmonar de los roedores salvajes.

El establecimiento de cultivos primarios de fibroblastos de adultos de los roedores

El comportamiento de los fibroblastos subyace en un espectro de entidades clínicas, pero siguen estando mal caracterizadas, en gran parte debido a su heterogeneidad inherente. La investigación tradicional de fibroblastos se basa en la manipulación in vitro, enmascarando el comportamiento de los fibroblastos in vivo. Describimos un protocolo basado en FACS para el aislamiento de fibroblastos de piel de ratón que no requiere cultivo celular.

Murino fibroblastos dérmicos aislamiento por FACS

Se describe un procedimiento experimental sencillo y rápido para la generación de fibroblastos primarios de las orejas y la cola de los ratones. El procedimiento no requiere una formación especial de los animales y se puede utilizar para la generación de cultivos de fibroblastos de los oídos almacenados a temperatura ambiente durante hasta 10 días.

Culturas Generación de fibroblastos primarios de mouse de oreja y rabo tejidos

derivación robusta de las células inducido por el hombre pluripotentes madre (HIPS) se logró mediante el uso de no-integración de virus Sendai (SeV) vector reprogramación mediada de fibroblastos dérmicos. el mantenimiento de células caderas y la expansión clonal se realizó utilizando condiciones de cultivo libre de xeno y definidos químicamente con laminina humana recombinante 521 (LN-521) de matriz y esencial E8 (E8) Medium.

Integración Derivación Gratuita de Células Madre Pluripotentes Inducidas Humanas Usando Laminin 521 Matrix

Aquí describimos un método clínicamente relevante, alta eficiencia y libre de alimentador para reprogramar fibroblastos primarios humanos en células pluripotentes inducidas, usando modificado mRNAs que codifican factores de reprogramación y microRNA maduro-367/302 imita. También se incluyen métodos para evaluar la eficiencia de reprogramación, ampliar las colonias clonales iPSC y confirmar la expresión de los marcadores de pluripotencia TRA-1-60.

Basado en el ARN la reprogramación de fibroblastos primarios de humanos en células madre pluripotentes inducidas

Este manuscrito describe un protocolo basado en FACS para el aislamiento de fibroblastos papilares y reticulares de la piel humana. Elude la cultura in vitro que era inevitable con el protocolo de aislamiento de uso común a través de culturas explantes. Los subconjuntos de fibroblastos que emanan son funcionalmente distintos y muestran la expresión génica diferencial y la localización dentro de la dermis.

Aislamiento de fibroblastos papilares y reticulares de la piel humana mediante la clasificación celular activada por fluorescencia

Este protocolo describe un método rápido para generar simultáneamente cultivos de melanocitos y fibroblastos a partir de la piel de ratones de 0-4 días de edad. Estos cultivos primarios pueden ser mantenidos y manipulados in vitro para estudiar una variedad de procesos fisiológicamente relevantes, incluyendo biología celular de la piel, pigmentación, cicatrización de heridas y melanoma.

Generación rápida de cultivos primarios de melanocitos muritonos y fibroblastos

Presentamos un protocolo para aislar los fibroblastos adultos primarios de una manera fácil, rápida y confiable, realizable por principiantes (por ejemplo, estudiantes). El procedimiento combina la digestión del tejido enzimático y la agitación mecánica con ondas ultrasónicas para obtener fibroblastos primarios. El protocolo se puede adaptar fácilmente a requisitos experimentales específicos (por ejemplo, tejido humano).

Aislamiento de fibroblastos para adultos primarios aumentados por ultrasonidos

La reprogramación celular requiere la introducción de genes clave, que regulan y mantienen el estado celular pluripotente. El protocolo descrito permite la formación de colonias de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) a partir de fibroblastos dérmicos humanos sin métodos virales/integradores pero utilizando ARN no modificados (NM-RNA) combinados con factores de evasión inmune que reducen los mecanismos de defensa celular.

Aislamiento de fibroblastos dérmicos humanos adultos de la piel abdominal y generación de células madre pluripotentes inducidas utilizando un método no integrador

Aquí presentamos un método que combina el uso del borrado epigenético químico con señales relacionadas con la mecanodetección para generar eficientemente células pluripotentes de mamíferos, sin necesidad de transfección génica o vectores retrovirales. Esta estrategia es, por lo tanto, prometedora para la medicina traslacional y representa un avance notable en la tecnología de organoides de células madre.

Una estrategia de dos pasos que combina la modificación epigenética y las señales biomecánicas para generar células pluripotentes de mamíferos

Aquí se presenta un protocolo para generar tejidos conectivos diseñados para un cultivo paralelo de 48 tejidos en una placa de múltiples pocillos con polos dobles, adecuado para estudios mecanicistas, modelado de enfermedades y aplicaciones de detección. El protocolo es compatible con fibroblastos de diferentes órganos y especies y se ejemplifica aquí con fibroblastos cardíacos primarios humanos.

Tejido conectivo de ingeniería humana derivado de fibroblastos para aplicaciones de detección

Aprende a aislar colonias de células madre embrionarias humanas de cultivos de alta densidad con fibroblastos embrionarios de ratón mediante aspiración. Esta técnica preserva la pluripotencia y permite la expansión eficiente.

La eliminación rápida de fibroblastos de alta densidad Humanos culturas de células madre embrionarias

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