Rata Exteriorización Mesenterio: un modelo para investigar la dinámica celulares implicados en la angiogénesis

El objetivo del siguiente experimento es identificar la dinámica celular espacial y temporal implicada en la angiogénesis, definida como el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos a partir de los ya existentes. Mediante un modelo sencillo y reproducible, primero se estimula la angiogénesis mediante la exteriorización breve del mesenterio de rata y se obtienen tejidos mesentéricos en diferentes momentos tras la estimulación. A continuación, se etiquetan inmunológicamente secciones de tejido.

Por ejemplo, utilice un marcador de células endoteliales para visualizar toda la vasculatura en remodelación dentro de un tejido y crear una visualización bidimensional esencial de redes microvasculares en crecimiento. Este modelo es atractivo porque produce un aumento dramático en múltiples métricas angiogénicas en conjunto durante un período de tiempo relativamente corto. La visualización de redes a nivel de célula individual y la correlación de estas métricas con etiquetado multicelular ha demostrado ser extremadamente útil para identificar fenotipos celulares novedosos que involucran la brotación capilar.

Este método podría ayudar a responder preguntas clave sobre la dinámica celular implicada en el crecimiento de redes microvasculares. Estas incluyen el cuándo y el dónde están presentes células específicas durante el proceso de brotamiento capilar. Las principales ventajas de este método son su simplicidad, el requerimiento de una intervención quirúrgica mínima y la producción de una respuesta angiogénica robusta en un período de tiempo relativamente corto.

Además, aprovecha el mesenterio de rata, que es un tejido que permite la observación de una red intacta hasta el nivel de la célula individual. En nuestra experiencia, es muy fácil de aprender y, por consiguiente, reproducible de un investigador a otro al demostrar el procedimiento. Hoy será Peter Stapler, un estudiante de posgrado en nuestro laboratorio, quien se preparará para la cirugía según se describe en el texto adjunto.

Después de afeitar la zona abdominal de la rata, coloque a la rata anestesiada boca arriba sobre una almohadilla calefactora para mantener la temperatura corporal, limpie el área abdominal con toallitas alternadas de GRE estériles empapadas en alcohol al 70 % y yodo; aproximadamente una pulgada por debajo del esternón, realice una pequeña incisión longitudinal a lo largo de la piel y luego en la línea alba. Coloque el campo quirúrgico precortado sobre la sección abdominal de modo que la abertura coincida con la incisión. Aplique suavemente presión alrededor de la incisión para exponer el intestino delgado. Con aplicadores de algodón, extraiga suavemente una sección del intestino delgado colocando el mesenterio sobre la platina de plástico que contiene solución salina estéril y localice el íleon.

Identifique seis a ocho ventanas mesentéricas vascularizadas, la delgada membrana translúcida situada entre los pares de arterias y venas, que irrigan el intestino delgado. Registre la hora de inicio de la exposición y configure un temporizador de 20 minutos. Marque las dos ventanas mesentéricas ubicadas centralmente con sutura estéril de calibre 7-0 en la zona grasa cercana al intestino.

Reponga intermitentemente la solución salina en la placa de Petri utilizando una jeringa estéril de cinco mililitros para asegurar que el tejido permanezca sumergido y húmedo. Después del período de exteriorización, devuelva el mesenterio a la cavidad abdominal. Cierre el músculo abdominal con sutura monofilamento número cinco cero en un patrón interrumpido.

Luego, cierre la piel con cuatro puntos de sutura monofilamento cero en un patrón interrumpido, limpie el área de la sutura con toallitas alternadas utilizando gasa estéril remojada en alcohol al 70 %, yodine para extender, gel lubricante en ambos ojos de la rata y devuélvala a su jaula para la recuperación. En el día de interés, tras la estimulación, anestesie y eutanase a la rata según las directrices institucionales. A continuación, vuelva a abrir la cavidad abdominal y cubra el área abdominal con un trozo de film plástico. Ahora, extraiga suavemente el intestino delgado y localice las dos ventanas marcadas utilizando pinzas y tijeras microquirúrgicas.

Corte cada una de las ventanas mesentéricas exteriorizadas, incluyendo un borde de tejido adiposo. Intente evitar cortar a través de los pares arteria-vena dentro del borde adiposo de las ventanas para minimizar el posible llenado sanguíneo de las mismas. También minimice el corte del intestino que resulte en la salida de contenido intestinal.

Al manipular las ventanas, sumérjalas inmediatamente en PBS. Luego, use pinzas para extender los tejidos sobre un portaobjetos cargado positivamente. Monte dos tejidos por portaobjetos. Una vez que los tejidos se hayan secado parcialmente, retire la grasa excesiva con una hoja de bisturí.

Fije las muestras en metanol durante 30 minutos a menos 20 grados Celsius colocándolas en el congelador. Seque las laminillas al vacío para eliminar la solución de tampón en exceso. Además, delinee los tejidos con un lápiz de cera para evitar el flujo descontrolado de las soluciones de anticuerpos fuera del tejido.

Ahora, agregue aproximadamente 200 microlitros de la solución diluida del anticuerpo primario para cubrir todo el tejido. Incube durante una hora a temperatura ambiente y lave los tejidos con PBS más 0.1% sapin con tres cambios de tampón. A continuación, añada la solución del anticuerpo secundario peroxidasa de estreptavidina e incube a temperatura ambiente durante una hora; tras tres lavados, incube las muestras en vector nova red durante 15 minutos.

Lave con agua para montar las laminillas. Sumerja en etanol al 95 % diez veces, seguido de pasos sucesivos de deshidratación. Deje secar las laminillas, cubra los tejidos con una capa delgada, ajuste la cantidad y posición de las cubreobjetos tras el secado al vacío y la marcación.

Los portaobjetos. Cubra las muestras de tejido con la solución diluida del anticuerpo primario. Incube durante una hora a temperatura ambiente.

Lave tres veces con PBS más 0,1 % de saponina durante 10 minutos cada lavado. A continuación, agregue el anticuerpo secundario e incube durante una hora. Realice los lavados en PBS más 0,1 % de saponina, monte las laminillas en PBS con glicerol y selle con esmalte de uñas.

Aquí detallamos la modificación de una placa de Petri común para su uso como plataforma quirúrgica. Se utilizó arcilla de modelar amarilla para proporcionar una superficie lisa a través de la cual se puede extraer el mesenterio por el orificio previamente cortado. Nuevamente, las ventanas mesentéricas mostradas aquí en la plataforma durante el período de exteriorización se definen como las membranas delgadas y translúcidas entre los pares arteria-vena que irrigan el intestino en esta zona.

La etiquetación con PCAM identifica todos los tipos de vasos a lo largo de la jerarquía de redes microvasculares en remodelación en puntos temporales específicos tras la externalización. Estas imágenes pueden utilizarse para cuantificar métricas angiogénicas en puntos temporales específicos. Tras la estimulación.

La etiqueta PCAM permite determinar las arterias frente a las venas. Tenga en cuenta que las arterias de aporte suelen presentar diámetros más pequeños y una morfología alargada de las células endoteliales en comparación con las venas emparejadas. Las características típicas de las redes en remodelación incluyen el área vascularizada, la formación de brotes capilares y la densidad de vasos.

La cuantificación de estas diversas métricas angiogénicas caracteriza el curso temporal del crecimiento de la red. La brotación capilar a partir de vasos preexistentes alcanza su punto máximo entre el día tres y el día cinco y vuelve al nivel no estimulado para el día 10. Este aumento transitorio en la brotación va seguido de aumentos en el área vascularizada y en la densidad vascular en nuestro laboratorio.

Este sistema de modelo se ha utilizado para identificar nuevos cambios fenotípicos celulares en puntos temporales específicos durante este proceso de remodelación. La tinción de inmunofluorescencia con PCA marca las células endoteliales en rojo, mientras que la marcación con beta tubulina clase tres marca en verde los nervios y parásitos a lo largo de los vasos angiogénicos. Curiosamente, en tejidos no estimulados, la expresión de la beta tubulina clase tres es específica de los nervios.

En contraste, durante el pico de brotación capilar, las células perivasculares expresan la tubulina beta de clase tres. Este tipo de resultado resalta la utilidad de este modelo angiogénico sencillo y robusto para identificar nuevos tipos celulares implicados en el proceso angiogénico. Al día 10, el patrón de expresión de la tubulina beta de clase tres comienza a regresar al escenario no estimulado.

Este modelo también podría utilizarse potencialmente para estudios de linaje celular. La viabilidad de la incorporación celular en el tejido mesentérico en remodelación queda respaldada por estos estudios preliminares, en los que se superpusieron células de la médula ósea previamente marcadas o células madre mesenquimales sobre ventanas mesentéricas durante el período de exteriorización de 20 minutos. Tras ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar nuestro modelo de interiorización del mesenterio de rata para investigar la dinámica celular implicada en el crecimiento de redes microvasculares.

Esta técnica sencilla puede realizarse en aproximadamente 45 minutos a una hora. Recuerde que es fundamental manipular con delicadeza el mesenterio y evitar perforar cualquier vaso después de un procedimiento quirúrgico. Se puede realizar una marcación inmunológica para identificar múltiples tipos celulares a lo largo de los vasos sanguíneos.

También puede marcarse los vasos linfáticos y los nervios. Esto nos permite investigar no solo los cambios fenotípicos celulares implicados en la angiogénesis, sino también la coordinación entre la angiogénesis, la neurogénesis y la linfangiogénesis.