Name: Solubilización y Bio-Corrector ortográfico y de los puntos cuánticos y Ensayos de toxicidad bacteriana por curva de crecimiento y Recuento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: Aprende a solubilizar puntos cuánticos de CdTe y evaluar su efecto antibacteriano conjugados con antibióticos mediante curvas de crecimiento y recuento de colonias. Este método permite desarrollar nuevos agentes antimicrobianos.

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Este trabajo fue financiado por el programa Discovery NSERC individual, el NSERC / CIHR Programa Colaborativo de Investigación en Salud (CHRP), y el NSERC CREATE Canadiense Programa de Entrenamiento de Astrobiología (CATP).

1. QD Solubilización Este es un método apropiado para CdTe. Métodos similares se pueden utilizar con otros tipos de puntos cuánticos tales como InP / ZnS 20 y CdSe o ZnS 21. <ol><li> Preparar una solución de puntos cuánticos de CdTe en tolueno a 15 micras (densidad óptica = 2,5 en el pico del excitón primero). </li><li> Transfiera 200 l de esta población en un vial de vidrio. No use plástico! </li><li> Añadir 800 l de tolueno, 1 ml de tampón borato 200 mM (pH 9) y 2 l de 11,5 M de ácido mercaptopropiónico (AMP). </li><li> Tapar el frasco y agitar enérgicamente durante 30-60 segundos. </li><li> Las fases acuosa y orgánica disolvente se separa espontáneamente. La fase acuosa se convertirá en el color de los puntos cuánticos. Para evitar que la capa de tolueno, retírelo y deséchelo. Luego transferir la fase acuosa en un vial limpio. </li><li> Purificar los puntos cuánticos solubilizados mediante el lavado / filtrado de cuatro veces utilizando una l 500, 10000 de corte de peso molecular del filtro centrífugo. Los filtros deben sercentrifugó a 3000 xg durante 13 minutos. Por lo menos los últimos dos lavados, se lava con el tampón final deseado. </li><li> Después del lavado final, suspender los puntos cuánticos lavados en tampón de borato 50 mM a pH deseado y almacenar a 4 ° C. Ellos serán estables durante 1-2 semanas. </li><li> Mida espectros de absorción y de emisión para estimar la concentración basada en fórmulas publicadas 22. </li></ol> Los resultados representativos: Figura 1 muestra una imagen de puntos cuánticos de CdTe bajo iluminación de la lámpara UV, y espectros de emisión antes y después de la solubilización de agua, que muestra el cambio insignificante desde el intercambio tapa. Los valores de tamaño son el diámetro del núcleo medida por microscopía electrónica. 2. Conjugación QD a los antibióticos Esta parte del protocolo es aplicable a cualquier carga negativa en agua solubilizada nanopartículas, incluyendo puntos cuánticos más comerciales, las partículas metálicas, y 19 más. <ol><li> Cualquier molécula que funciona eithER autoensambla a los puntos cuánticos cargados negativamente solubilizados, o que tiene un grupo reactivo que puede ser conjugado, tal como una amina primaria. En este ejemplo, se está utilizando polimixina B (PMB), que está cargado positivamente y auto-ensambla sin necesidad de reactivos conjugación. Disolver el PMB en H 2 O a 60 micras. (Si el antibiótico elegido no es soluble en H 2 O, se disuelven en DMSO o etanol a una concentración de 0,1-1 mM). Esto será una solución 10x (en H 2 O) o una solución 100x (en disolvente). </li><li> Calcular la cantidad de solución de QD será necesario para los experimentos de toxicidad de la bacteria. Para una placa de 96 pocillos con 0,3 ml por pocillo en quadruplicates, 0,5 ml de conjugado nM 200 que se necesita. Preparar dos tubos que contienen 100 L de 1 uM puntos cuánticos en tampón de borato 50 mM. </li><li> Si el acoplamiento a una amina primaria, preparar una mg 19 / ml (100 mM) solución de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] carbodiimida (EDC) en H 2 O. EDC en la solución no es estable; El uso inmediatamente y desechar el resto. </li><li> Añadir 50 l de la solución 10x antibiótico (en H 2 O) o 5 l de la solución 100x (en disolvente) al tubo de conjugado. Para PMB: conjugación de CdTe en una proporción molar de 30:1, se añaden 50 l de PMB mM 60. Añadir H 2 O o disolvente para el tubo de control sólo QD. </li><li> Si es necesario, añadir 1 l de la solución madre de EDC para el tubo de conjugado. </li><li> Llevar el volumen conjugado a 0,5 ml con el tampón adecuado (tampón borato o PBS; no tampones que contienen amina, tales como Tris, ya que inhiben la EDC). </li><li> Tubos de protegerlo de la luz con papel de aluminio, y el lugar en un nutator o una mecedora durante 1 hora. Si la agregación se produce, repita la conjugación con bajas concentraciones de antibióticos. Valorar hacia arriba de concentración hasta que las partículas no se agregan. </li><li> Lavar los conjugados pasando a través de un filtro apropiado. 10000 corte de peso molecular que funciona para la mayoría de los antibióticos, pero no para las proteínas o anticuerpos. </li&gt; <li> Dependiendo de la molécula, los diferentes métodos se puede utilizar para estimar el número de moléculas de antibióticos por QD: espectroscopía de fluorescencia o absorbancia, electroforesis en gel, o la transformada de Fourier de infrarrojos (FTIR). </li></ol> Los resultados representativos. En este ejemplo, la conjugación de PMB se caracteriza por los cambios en el espectro de emisión QD. Figura 2 muestra el espectro de puntos cuánticos de CdTe con la adición de PMB. 3. Preparación de las bacterias para la pantalla de 96 pocillos, Determinación de antibióticos IC 50 Esto es aplicable a casi cualquier cepa bacteriana crecido en el medio apropiado 18. La longitud exacta de tiempo las grabaciones deben seguir depende de la tasa de crecimiento bacteriano. En nuestro ejemplo, podemos utilizar Escherichia coli cultivadas en caldo de lisogenia (LB). <ol><li> Con el fin de elegir las concentraciones apropiadas QD conjugadas, es importante conocer laIC 50 del antibiótico para ser conjugado y si los puntos cuánticos solos son tóxicos. Esto debe ser comenzado 2 días antes del experimento de conjugación. Por la noche, las semillas de 10 ml de medio de crecimiento bacteriano a partir de una colonia fresca, usando la técnica correcta estéril y seguridad de la biotecnología. </li><li> Al día siguiente, 1-2 horas antes del experimento, llenar cada uno de los pocillos de una clara de fondo 96-pocillos con una cantidad casi-máxima de medio de crecimiento. Con una pipeta multicanal de semillas, cada uno con 1-50 l de cultivo bacteriano (la concentración dependerá de la rapidez con la cepa en particular crece y se necesita ser calibrado por el laboratorio). </li><li> Colocar la placa en el lector de placas y la puso a leer cada 10 minutos durante 2 horas a una determinada longitud de onda (600 nm por lo general). Vigilar la placa de modo que las bacterias no crecen demasiado densos con demasiada rapidez. </li><li> Cuando las células de todo llegar a OD = 0.1-0.15, retire la placa del lector de la placa y detener la grabación. </li><li> Añadir fármacos solos y solas en puntos cuánticosconcentraciones diferentes en al menos triplicado. Utilizar un lado de la placa como un &quot;oscuro&quot; control y un medio para ser iluminada. Una disposición sugerida se da en la Figura 3. Las concentraciones debería abarcar una gama lo suficientemente amplia como para incluir una concentración que inhibe las bacterias muy poco, y uno que mata a todos. </li><li> Proteger el lado &quot;oscuro&quot; de la placa con papel de aluminio. Expone el otro lado a una lámpara en la longitud de onda deseada. Usamos una medida de 96 pozos, 440-nm lámpara hecha de 2,4 mW LED (Figura 4) e irradiar por 30-60 minutos. Las placas negras con fondos claros ayudan a proteger a las bacterias no expuestas a la luz parásita. Una columna de vacío también puede ser utilizado entre los lados expuestos y de las Naciones Unidas expuestos. </li><li> Después de exposición a la luz, poner la placa en el lector de placas y registro de OD 600 cada 10 minutos durante 5-12 horas, dependiendo de la tasa de crecimiento. Mantenga la temperatura &lt;32 ° C si es posible, para evitar la desecación de los cultivos. </li><li> Trazar las curvas de crecimientoen un punto de tiempo seleccionado frente a log [de concentración] y determinar la IC 50 del antibiótico utilizando la ecuación de Hill: </li></ol><img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/3969/3969eq1.jpg" /> donde H es el coeficiente de Hill, y el máximo es el punto más alto de crecimiento (idealmente en una meseta), y minutos y es el punto cero, también es ideal en una meseta. Es poco probable que los puntos cuánticos solamente se muestran toxicidad mucho a las células a las concentraciones utilizadas, por lo que un valor no será determinada. Los resultados representativos. Al final del período de registro, pozos claras indicará la muerte celular completa, y un gradiente de densidad celular debe aparecer a lo largo de concentraciones crecientes del fármaco. Las bacterias se muestran en forma de S curvas de crecimiento (Figura 5 A), la ubicación de la meseta máxima variará en gran medida a partir de una cepa a otra y también depende de la temperatura. Un punto de tiempo dado puede serelegido como representante y representado los valores frente a log [antibióticos] para dar el CI 50 (Figura 5 B). Para evaluar la toxicidad QD, la supervivencia frente a log [QD] también se puede dibujar, pero el logro de muerte bacteriana significativa con puntos cuánticos es el único raro (Figura 5 C). 4. Preparación de las bacterias para la pantalla de 96 pocillos con antibióticos o puntos cuánticos <ol><li> El día antes del experimento, las semillas de 10 ml de la cultura de una colonia fresca en el medio rico en su caso, usando la técnica correcta estéril y seguridad de la biotecnología. El conjugado QD-antibiótico debe estar preparado en este día, a menos que sea muy inestable. </li><li> 1-2 horas antes del experimento, llenar cada uno de los pocillos de una clara de fondo 96-pocillos con una cantidad casi-máxima de medio de crecimiento. Utilizando una pipeta multicanal de semillas, cada pocillo con 1-50 l de cultivo bacteriano. </li><li> Colocar la placa en el lector de placas y la puso a leer cada 10 minutos durante 2 horas en la misma longitud de onda en la parte 3.</li><li> Cuando las células de todo llegar a OD = 0.1-0.15, retire la placa del lector de la placa y detener la grabación. </li><li> Añadir conjugados QD a diferentes concentraciones en al menos cuadruplicado. Utilizar un lado de la placa como un &quot;oscuro&quot; control y un medio para ser iluminada. Una disposición sugerida se da en la Figura 6. Una tira de control de las bacterias solo se debe incluir siempre en caso de problemas con la cultura, la temperatura, etc afectar a las condiciones de crecimiento. Una sola tira de la única droga y QD sólo debería incluirse también para asegurarse de que coincida con la placa de control realizado con anterioridad. El resto de los pocillos están dedicados a conjugados con el fin de permitir una buena estadística. </li><li> Proteger el lado &quot;oscuro&quot; de la placa con papel de aluminio. Expone el otro lado a una lámpara en la longitud de onda deseada. </li><li> Después de exposición a la luz, poner la placa en el lector de placas y registro de OD 600 cada 10 minutos durante 5-12 horas. Mantenga la temperatura &lt;32 ° C si es posible, para evitar que el Dr.ying de las culturas. </li></ol> Los resultados representativos. La combinación de puntos cuánticos y los antibióticos pueden ser menos tóxicos que los antibióticos solo, igualmente tóxicos, tóxicos o más. Esto puede ser cuantificado mediante las curvas de crecimiento y CI 50 mediciones. La figura 7 muestra un ejemplo de conjugados que igualmente tóxicos como antibióticos solos, y un ejemplo de conjugados que son más tóxicos. 5. Placa de Conde <ol><li> Elija uno o más pozos de los tratados con placas de 96 pocillos que se utilizarán para diluciones seriadas y conteo de colonias. </li><li> Hacer una serie de dilución de cada una de las muestras seleccionadas de bacterias con solución de PBS o solución salina (0,9% de NaCl). Transferir 20 l de la solución bacteriana y se diluye con 180 ml de solución salina, cambiar la punta de la pipeta, mezclar y transferir 20 l de solución diluida bacteriana a 180 ml de solución salina. Repetir 6 veces. </li><li> Tomar 10 l de cada dilución y la placa en un apropiado<html> los medios de comunicación placa sólida. Todas las concentraciones de 8 una muestra puede ser chapada en un plato redondo de 10 cm de Petri, aunque platos rectangulares son los preferidos ya que es más fácil para alinear las cosas. </li><li> Deje que se seque en el banquillo durante 15 minutos. a continuación, se incuba a la temperatura apropiada para sus bacterias durante 16 horas. </li><li> Contar las colonias y calcular unidades formadoras de colonias (ufc) de acuerdo con (n º de colonias x factor de dilución) / volumen plateado = UFC / mL. </li></ol> La figura 8 muestra una placa de UFC ejemplo. 6. Los resultados representativos <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig1.jpg" /> Figura 1. Puntos cuánticos de CdTe. (A) Ocho puntos cuánticos de CdTe los preparativos de iluminación con una varita UV (365 nm). (B) Absorbancia y espectros de emisión de los cinco tamaños seleccionados antes y después de la solubilización de agua. Las líneas discontinuas son espectros en tolueno, las líneas continuas son en agua. files/ftp_upload/3969/3969fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. El análisis espectral y el gel de QD-PMB conjugados. Naranja emisores de puntos cuánticos de CdTe se utilizaron para este ejemplo, los efectos sobre otros tipos de puntos cuánticos tendrá que ser evaluado para cada experimento. (A) absorbancia Típica (línea gris) y espectros de emisión (en negro) de los puntos cuánticos antes de la conjugación de la PMB y la emisión (línea discontinua) después de la adición de 160 equivalentes molares de PMB. (B) Relación entre la proporción de PMB y la intensidad de emisión QD (cuadrados) y el pico de ubicación de longitud de onda (triángulos). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig3.jpg" /> Figura 3. Sugerido disposición de la placa de la placa de control de crecimiento. Una amplia gama de concentraciones de PMB y QD está representado. La mitad de la placa se irradia (resaltado en azul), y una media idéntica está protegido de la luz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3969/3969fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí</a>para ampliar la figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig4.jpg" /> Figura 4. Custom 96-Lámpara LED para la irradiación de la placa de uniforme, que muestra el aspecto apagado y encendido. Un típico de mano lámpara UV también se puede usar, pero no cubre toda la placa de manera uniforme. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig5.jpg" /> Figura 5. Ejemplo de resultados de la placa de control de crecimiento. (A) representativos curvas de crecimiento de bacterias con diferentes concentraciones del fármaco, de 0 a completar la muerte celular. Los símbolos abiertos son PMB sólo con concentraciones dado; los símbolos son sólidos CdTe-PMB sin irradiación, y los símbolos medio llenas son CdTe-PMB con irradiación. La irradiación no tuvo ningún efecto sobre las muestras de PMB-solamente, por lo que estas curvas se omite para mayor claridad. Todos los conjugados de PMB-CdTe son 30:1 PMB: proporciones QD. (B) Las representaciones de los valores de la curva de crecimiento en 200 minutos frente a log [PMB] y se ajusta a la ecuación. (1). Para contROL para los efectos de la luz, una curva que se hace con antibióticos sólo con 30 minutos de exposición a la luz. (C) la supervivencia bacteriana en 200 minutos frente a la concentración QD, utilizando puntos cuánticos de CdTe. Algo de la toxicidad se ve con exposición a la luz, pero demasiado poco para determinar un valor de IC 50. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3969/3969fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig6.jpg" /> Figura 6. Sugerido para el diseño de la placa de prueba conjugado. La mitad azul-puso de relieve de la placa debe ser expuesto a la luz, y la mitad sin resaltar está protegida. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3969/3969fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig7.jpg" /> Figura 7. Ejemplo de los resultados de la placa de prueba conjugado. Los valores de crecimiento de la curva en 200 min fueron plotted y un ajuste a la ecuación. (1). (A) CdTe-PMB conjugados muestran un aumento de la toxicidad sobre PMB solo. (B) el oro de nanopartículas de Au-PMB conjugados no muestran ningún aumento de la toxicidad sobre PMB solo. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig8.jpg" /> Figura 8. Ejemplo de una placa de UFC. E. E. sembradas en una placa de 96 pocillos se trató con QD-PMB con o sin irradiación durante 30 min. a continuación, se incubó a 32 ° C durante 4 horas. Diluciones seriadas de cada muestra bacteriana se hizo con solución salina, y 10 l de 100 X 10 X 7 diluciones se cultivaron sobre placas de agar. Las placas se incuban a 37 ° C y se contaron las colonias después de 16 horas. La placa muestra las diluciones a lo largo de las filas como se indica, las columnas son: (A) 0,06 mM de PMB + 2 nM CdTe, (B) 0,12 mM de PMB + 4 nM CdTe (C) 0,2 mM + 6,7 nM PMB CdTe, (D) 0,06 uM PMB + 2 nM CdTe irradiado, (E) 0,12 mM de PMB + 4 nM CdTe irradiado, (F) 0,2 mM + 6,7 nM PMB CdTe IRRAmediado.

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<li>Narayanaswamy, A., Feiner, L. F., Meijerink, A., Zaag, P. J. vander <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+temperature+and+dot+size+on+the+spectral+properties+of+colloidal+InP%2FZnS+core-shell+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Acs+Nano%22%5BJournal%5D)">The effect of temperature and dot size on the spectral properties of colloidal InP/ZnS core-shell quantum dots.</a> Acs Nano. 3, 2539-2546 (2009).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Las nanopartículas representan un enfoque prometedor para la creación de nuevos agentes antimicrobianos. Análisis de la curva de crecimiento es una forma de monitorear la densidad de células bacterianas que distingue a las células activamente de cultivo de células de crecimiento inhibido. Cuando se combina con el conteo de placas, permite un análisis exhaustivo del potencial de los antibióticos de un conjugado. El formato de 96 pocillos permite variaciones relativamente de alto rendimiento de la concentración y otras co...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> Borato componente tampón # 1 </td><td> Pescador </td><td> El ácido bórico A-74-1 </td><td></td></tr><tr><td> Borato componente tampón # 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Tetraborato de sodio B9876 </td><td></td></tr><tr><td> MPA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M5801 </td><td></td></tr><tr><td> Vivaspin 500 </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9322 </td><td> Varios MWCO disponibles </td></tr><tr><td> Viales de vidrio </td><td> Pescador </td><td> 03-338C </td><td></td></tr><tr><td> EDC </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E6383 </td><td></td></tr><tr><td> Polimixina B </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P1004 </td><td></td></tr><tr><td> Gr bacterianaowth medio (LB) Componente # 1 </td><td> Pescador </td><td> NaCl S271 </td><td></td></tr><tr><td> Medio de crecimiento bacteriano (LB) Componente # 2 </td><td> BD </td><td> Triptona 211705 </td><td></td></tr><tr><td> Medio de crecimiento bacteriano (LB) Componente # 3 </td><td> BD </td><td> Extracto de Levadura 211929 </td><td></td></tr><tr><td> Lámpara de exposición a la luz </td><td> Costumbre </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Borrar de fondo placas de 96 pocillos </td><td> Pescador </td><td> 07-200-567 o 07-200-730 </td><td></td></tr><tr><td> Espectrómetro de fluorescencia </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Absorbancia lector de placas </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bactoagar para medios sólidos </td><td> Bioshop </td><td> AGR001.1 </td><td></td></tr><tr><td> Placas de Petri redondear </td><td> Pescador </td><td> 08-75-12 </td><td></td></tr><tr><td> Petri platos rectangulares </td><td> Pescador </td><td> 08 a 757-11A </td><td></td></tr></tbody></table>

solubilización y bio-corrector ortográfico y de los puntos cuánticos y ensayos de toxicidad bacteriana por curva de crecimiento y recuento

Solubilization and Bio-conjugation of Quantum Dots and Bacterial Toxicity Assays by Growth Curve and Plate Count

Los puntos cuánticos (puntos cuánticos) son semiconductores de nanopartículas fluorescentes con tamaño que dependen de los espectros de emisión que pueden ser excitados por una amplia selección de longitudes de onda. Puntos cuánticos han atraído un gran interés para la imagen, el diagnóstico y la terapia debido a su fluorescencia brillante, estable 1,2 3,4,5. Cuánticos pueden conjugarse con una variedad de moléculas bio-activas para la unión a las bacterias y células de mamíferos 6. Puntos cuánticos también están siendo ampliamente investigados como agentes citotóxicos para el asesinato selectivo de las bacterias. La aparición de multiplicar cepas de bacterias resistentes está convirtiendo rápidamente en una crisis de salud pública, especialmente en el caso de los agentes patógenos Gram negativos 7. Debido al efecto antimicrobiano conocido algunos de los nanomateriales, especialmente Ag, hay cientos de estudios que examinan la toxicidad de las nanopartículas a las bacterias 8. Estudios bacterianas se han realizado con otros tipos de nanopartículas semiconductoras, así, especially TiO2 9,10-11, pero también ZnO 12 y otros, incluyendo CuO 13. Algunas comparaciones de las cepas bacterianas se han realizado en estos estudios, por lo general la comparación de una cepa Gram negativas con un Gram positivos. Con todas estas partículas, mecanismos de toxicidad se atribuyen a la oxidación: o bien la fotogeneración de especies de oxígeno reactivas (ROS) por las partículas o la liberación directa de los iones metálicos que pueden causar toxicidad oxidativa. Incluso con estos materiales, los resultados de diferentes estudios varían mucho. En algunos estudios, la cepa de prueba Gram positivas se informa, más sensible que el negativo de 10 gramos, en otros es todo lo contrario 14. Estos estudios han sido bien revisado 15. En todos los estudios de nanopartículas, la composición de las partículas, el tamaño, la química de superficie, muestra el envejecimiento / degradación, y longitud de onda, potencia y duración de la exposición a la luz todos pueden afectar dramáticamente los resultados. Además, Synthesisubproductos s y disolventes deben ser considerados 16 17. Técnicas de alto rendimiento de detección son necesarios para poder desarrollar nuevos agentes eficaces de la nanomedicina. Puntos cuánticos de CdTe tiene efectos antimicrobianos sólo 18 o en combinación con antibióticos. En un estudio anterior, hemos demostrado que el acoplamiento de los antibióticos para CdTe puede aumentar la toxicidad de las bacterias, pero disminuir la toxicidad en células de mamíferos, debido a la disminución en la producción de especies reactivas del oxígeno de los conjugados 19. Aunque no es probable que contengan cadmio-compuestos serán aprobados para uso en seres humanos, tales preparaciones podrían ser utilizados para la desinfección de superficies o la esterilización de agua. En este protocolo, le damos un enfoque directo a la solubilización de los puntos cuánticos de CdTe con ácido mercaptopropiónico (MPA). Los puntos cuánticos están listos para usar en una hora. A continuación demuestran el acoplamiento a un agente antimicrobiano. La segunda parte del protocolodemuestra un ensayo de inhibición de 96-así bacteriana usando los puntos cuánticos conjugados y no conjugados. La densidad óptica se leyó durante muchas horas, permitiendo que los efectos de la adición QD y exposición a la luz para ser evaluada de inmediato así como después de un periodo de recuperación. Se ilustra un recuento de colonias para la cuantificación de la supervivencia bacteriana.

Las nanopartículas tales como puntos cuánticos semiconductores (puntos cuánticos) se puede utilizar para crear agentes fotoactivables para aplicaciones anti-microbianos o anti-cáncer. Esta técnica muestra cómo el agua solubilizar teluro de cadmio (CdTe) QDs, conjugado a un antibiótico, y le realizará un ensayo de inhibición bacteriana basada en las curvas de crecimiento y recuento en placa.

Solubilización y Bio-Corrector ortográfico y de los puntos cuánticos y Ensayos de toxicidad bacteriana por curva de crecimiento y Recuento

Los puntos cuánticos (QDs, por sus siglas en inglés) son nanopartículas semiconductoras fluorescentes con espectros de emisión dependientes del tamaño que pueden excitarse mediante una amplia variedad de longitudes de onda. ...

El objetivo general de este procedimiento es realizar un cribado de alto rendimiento de los efectos antibacterianos de nanopartículas con o sin conjugación a antibióticos. Aquí, se evalúan los efectos antibacterianos de los puntos cuánticos de telururo de cadmio conjugados con polimezcla y B para lograr este fin. Primero, los puntos cuánticos se solubilizan en ácido mercapto-propiónico.A continuación, los puntos cuánticos se conjugan con poli mezcla y B; las bacterias sembradas en antibióticos se tratan entonces con puntos cuánticos conjugados y no conjugados con antibióticos, y la mitad de las muestras se somete a una radiación con luz azul de 440 nanómetros durante 30 minutos, lo que provoca que los puntos cuánticos generen excitones y especies reactivas de oxígeno, para evaluar el efecto de los tratamientos con puntos cuánticos sobre el crecimiento y la supervivencia bacteriana. Se toman lecturas de densidad óptica y se realizan recuentos de colonias. Los datos resultantes indican que la aplicación de puntos cuánticos de telururo de cadmio conjugados con antibióticos, seguida de radiación I, produce los mayores efectos tidales entre las condiciones evaluadas.Aunque este método puede proporcionar información sobre el efecto de los puntos cuánticos de telururo de cadmio y su conjugación con polix en B sobre el crecimiento de E. coli, también puede aplicarse a otros tipos de nanopartículas y antibióticos en diversas cepas bacterianas. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque cualquier exceso de MPA hará que los puntos cuánticos se agreguen, y si pipetean incluso una pequeña cantidad de toline, destruirán el filtro.Aunque hoy demostraremos un método para evaluar los efectos antibacterianos de puntos cuánticos KE IDE conjugados con antibióticos, un método similar podría utilizarse con otros tipos de puntos cuánticos, como fosfato de indio, sulfato de zinc y sulfuro de cadmio sulfato de zinc. Comience este procedimiento preparando una solución de puntos cuánticos de telururo de cadmio o puntos cuánticos CDTE en tolueno a 15 micromolar en un vial de vidrio; mida la densidad óptica o DO mediante espectroscopía de absorción, transfiriendo con una pipeta 200 microlitros de esta solución stock a un vial de vidrio.No utilice plástico. A continuación, añada 800 microlitros de tolueno, un mililitro de tampón borato 200 milimolar y dos microlitros de ácido mercaptopropiónico 11,5 molar o MPA, tape el vial y agítelo enérgicamente durante 30 a 60 segundos. Tras la agitación, las fases acuosa y de disolvente orgánico se separarán espontáneamente.La fase acuosa adquirirá el color de los puntos cuánticos. Para evitar la capa de mosaico, retírela, luego extraiga la fase de puntos cuánticos y transfiérala a un vial limpio. Para purificar los puntos cuánticos solubilizados, transfiéralos a un filtro centrífugo de 500 microlitros.Añada 100 microlitros de tampón Bore ocho 50 milimolar y centrifugue a 3000 ×g durante 13 minutos. Realice este lavado cuatro veces tras el lavado final. Suspenda los puntos cuánticos lavados en 500 microlitros de tampón Bore y almacene a cuatro grados Celsius.Permanecerán estables durante una o dos semanas. Para estimar la concentración de los puntos cuánticos, mida los espectros de absorbancia y emisión. Esta figura muestra puntos cuánticos de CDTE bajo iluminación con lámpara UV y los espectros de emisión antes y después de la solubilización en agua, lo que demuestra un cambio despreciable en las propiedades ópticas tras el intercambio de ligandos.Esta parte del protocolo es aplicable a cualquier nanopartícula solarizada en agua con carga negativa, incluyendo musgo, puntos cuánticos comerciales, partículas metálicas y más. En este ejemplo, el antibiótico polimixina B o PMB será conjugado con los puntos cuánticos a una proporción molar de 30 a 1. El PMB tiene carga positiva y se autoensambla sin necesidad de conjugación. Reactivos: disolver PMB y agua.A 60 micromolar. Para una placa de 96 pocillos con 0,3 mililitros de bacterias por pocillo en cuádruples réplicas. Son suficientes 0,5 mililitros de conjugado de 200 nanomolar para preparar esto con 100 microlitros de puntos cuánticos de un micromolar en tampón bórico 50 milimolar en un tubo de microcentrífuga.A continuación, agregue 50 microlitros de la solución de antibiótico PMB 10 x o 60 micromolar en agua al tubo de conjugado. Agregue 50 microlitros de agua al tubo de control. Ajuste el volumen a 0,5 mililitros con tampón de 50 milimolar, proteja los tubos de la luz con papel de aluminio y colóquelos en un rotador durante una hora.Si ocurre agregación, repita la conjugación con concentraciones más bajas de antibiótico. Titule la concentración hacia arriba hasta que las partículas no se agreguen, para lavar los conjugados. Pase las soluciones a través de un filtro con un límite de corte de peso molecular de 10,000, lo cual funciona para la mayoría de los antibióticos pero no para proteínas ni anticuerpos.Finalmente, estime el número de moléculas de antibiótico por quantum mediante espectroscopía de absorción o fluorescencia, electroforesis en gel o espectroscopía infrarroja transformada. Esta figura muestra los espectros típicos de absorción y emisión de los puntos cuánticos antes de la conjugación con PMB y la emisión después de la adición de 160 equivalentes molares de PMB.La relación entre la proporción de PMB y la intensidad de emisión del punto cuántico indicada por los cuadrados y la ubicación de la longitud de onda máxima indicada por los triángulos se muestra aquí. A medida que aumenta la concentración de PMB, la intensidad de emisión del punto cuántico disminuye, lo que provoca un desplazamiento en la longitud de onda de emisión máxima. La siguiente parte del protocolo se realiza para determinar la concentración inhibitoria media máxima o IC 50 del antibiótico y la toxicidad cuántica la tarde del segundo día antes del experimento de conjugación.Siembre 10 mililitros de medio LB a partir de una colonia fresca de e coli. Al día siguiente, una o dos horas antes del experimento, llene cada uno de los pocillos de una placa transparente de 96 pocillos con medio de crecimiento. La placa para el ensayo debe organizarse como se muestra aquí.Las muestras deben sembrarse por triplicado y las concentraciones de antibióticos deben abarcar un rango suficientemente amplio para incluir una concentración que inhiba muy poco a las bacterias y otra que las elimine por completo. También deben incluirse por triplicado los pozos que contienen puntos cuánticos en las concentraciones que se utilizarán en los experimentos con conjugados. Utilizando una pipeta multicanal, añada a los pozos adecuados de uno a 50 microlitros de cultivo bacteriano.La concentración dependerá de la velocidad con la que crezca la cepa particular y será necesario calibrarla en consecuencia. Para monitorear el crecimiento, coloque la placa en un lector de placas y configúrelo para que lea cada 10 minutos durante dos horas a 600 nanómetros. Cuando todas las células alcancen una DO de 0.1 a 0.15, retire la placa del lector de placas y detenga la grabación.A continuación, agregue el PMB en puntos cuánticos a los pozos adecuados y duplique la mitad de la placa con papel de aluminio en triplicado. Luego coloque la placa bajo una lámpara personalizada de 440 nanómetros hecha con LED de 2,4 milivatios durante 30 minutos para exponer el lado iluminado de la placa. Tras la exposición a la luz, coloque la placa en el lector de placas y registre la DO 600 cada 10 minutos durante cinco a doce horas, dependiendo de la velocidad de crecimiento. Mantenga la temperatura por debajo de 32 grados Celsius si es posible, para evitar el secado de los cultivos, utilizando el software.Coloque las curvas de crecimiento en un punto de tiempo seleccionado frente al logaritmo de la concentración y determine la IC50 del antibiótico utilizando la ecuación de Hill mostrada en pantalla, donde H es el coeficiente de Hill, Ymáx es el punto más alto de crecimiento y Ymín es el punto cero, preferiblemente situado también en una meseta. Al final del período de registro, los pocillos claros indicarán muerte celular completa y debería observarse un gradiente de densidad celular a lo largo de concentraciones crecientes del fármaco.Las bacterias deben mostrar curvas de crecimiento en forma de S como se muestra aquí. La ubicación del máximo plateau variará considerablemente de una cepa a otra y también depende de la temperatura. Se puede elegir un punto temporal determinado como representativo y graficar los valores frente al logaritmo del antibiótico para obtener la IC 50 y evaluar así los puntos cuánticos.La supervivencia frente a la toxicidad en función del logaritmo de la concentración de puntos cuánticos también puede representarse gráficamente, pero lograr una eliminación bacteriana significativa únicamente con puntos cuánticos a la concentración utilizada es raro. Una vez que se ha determinado la toxicidad de los puntos cuánticos y de los antibióticos por separado, se puede aplicar el mismo protocolo para determinar la toxicidad del antibiótico. Puntos cuánticos conjugados mostrados.A continuación se muestra un ejemplo de diseño para el ensayo. Téngase en cuenta que los conjugados se ensayan en concentraciones crecientes en cuádruple réplica; se debe incluir una tira control solo con bacterias, una tira solo con fármaco y pozos de muestra solo con puntos cuánticos. Las lecturas de DO 600 luego pueden utilizarse para generar curvas de crecimiento, y los valores de CI 50 se determinan como antes.Esta figura muestra un ejemplo de conjugados que son tan tóxicos como el antibiótico solo y un ejemplo de conjugados que son más tóxicos. Para determinar el número de unidades formadoras de colonias o UFC para cada condición, seleccione uno o más pocillos de la placa de 96 pocillos tratada que se utilizarán para realizar los conteos en placa. Realice una dilución seriada de cada una de las muestras bacterianas seleccionadas con solución salina.Para ello, pipete 180 microlitros de solución salina a las columnas adecuadas. Transfiera 20 microlitros de la solución bacteriana y dilúyalos con 180 microlitros de solución salina. Cambie la punta del pipeta, mezcle y transfiera 20 microlitros de la solución bacteriana diluida a 180 microlitros de solución salina.Repita este proceso seis veces. A continuación, tome 10 microlitros de cada una de las últimas seis diluciones y aplíquelos en forma de manchas sobre una placa rectangular de auga. Se pueden colocar 36 manchas sobre una placa rectangular.Deje secar la placa durante 15 minutos sobre la bancada; transcurridos 15 minutos, incube la placa a 37 grados Celsius durante 16 horas tras la incubación. Cuente las colonias para determinar las unidades formadoras de colonias por mililitro. Multiplique el número de colonias por el factor de dilución y divida entre el volumen sembrado para determinar el efecto de los tratamientos sobre el crecimiento bacteriano.La densidad celular de E. coli se midió a una DO 600. Aquí se muestran curvas representativas de crecimiento bacteriano con diferentes concentraciones del fármaco, desde cero hasta la muerte celular completa. Los símbolos abiertos corresponden solo a PMB con las concentraciones indicadas.Los símbolos sólidos corresponden a C-D-T-E-P-M-B sin irradiación y los símbolos medio llenos corresponden a C-D-T-E-P-M-B con irradiación. La irradiación no tuvo efecto sobre las muestras con solo PMB, por lo que estas curvas se omitieron para mayor claridad. A continuación se muestran gráficos de los valores de la curva de crecimiento a los 200 minutos frente al log PMB y los ajustes a esta ecuación para determinar los valores de IC 50, con el fin de controlar los efectos de la luz.Se realiza una curva solo con antibiótico y 30 minutos de exposición a la luz. Esta figura indica la supervivencia bacteriana a los 200 minutos frente a la concentración de puntos cuánticos utilizando puntos cuánticos de CDTE. Se observa algo de toxicidad con la exposición a la luz, pero demasiado poca como para determinar un valor de IC 50.Esto indica que la toxicidad del CDTE solo en las concentraciones utilizadas en el experimento de conjugación es despreciable. Para comparar los efectos de los diferentes tratamientos sobre el crecimiento celular, se representaron los valores de la curva de crecimiento a los 200 minutos y se ajustaron a la ecuación mostrada anteriormente, como se muestra aquí. Los conjugados C-D-T-E-P-M-B fueron más tóxicos que el PMB solo. En comparación, los conjugados de nanopartículas de oro A-U-P-M-B no muestran una toxicidad aumentada respecto al PMB solo, para determinar el efecto de los tratamientos sobre la supervivencia bacteriana.Se determinó el número de unidades formadoras de colonias para E. coli sembradas en una placa de 96 pocillos tratada con P-M-B-Q-D-P-M-B o QD solo, con o sin radiación I durante 30 minutos, seguido de incubación a 32 grados Celsius durante cuatro horas. Se realizaron diluciones seriadas de cada muestra bacteriana con solución salina y se sembraron 10 microlitros de soluciones desde 100 x hasta 10 a la séptima X en placas de auger. Las placas se incubaron a 37 grados Celsius y las colonias se contaron tras 16 horas.En este ejemplo, las columnas A a C de la placa contienen bacterias tratadas con concentraciones crecientes de CDTE. Los conjugados sin irradiación y las columnas D a F contienen bacterias tratadas con concentraciones crecientes de conjugados. Junto con 30 minutos de irradiación, las diluciones se muestran a lo largo de las filas.Los datos indican que, tras la irradiación, los conjugados presentan una mayor inhibición del crecimiento bacteriano en comparación con los conjugados sin irradiación. No olvide que los reactivos ca son extremadamente tóxicos y que siempre se deben tomar precauciones, como el uso de guantes, batas de laboratorio y gafas de protección, al realizar este procedimiento. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar cribados de alto rendimiento del efecto antibacteriano de nanopartículas con o sin conjugación a antibióticos.

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Solubilización y Bio-Corrector ortográfico y de los puntos cuánticos y Ensayos de toxicidad bacteriana por curva de crecimiento y Recuento (Video) | JoVE Journal

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