Solubilización y Bio-Corrector ortográfico y de los puntos cuánticos y Ensayos de toxicidad bacteriana por curva de crecimiento y Recuento

El objetivo general de este procedimiento es realizar un cribado de alto rendimiento de los efectos antibacterianos de nanopartículas con o sin conjugación a antibióticos. Aquí, se evalúan los efectos antibacterianos de los puntos cuánticos de telururo de cadmio conjugados con polimezcla y B para lograr este fin. Primero, los puntos cuánticos se solubilizan en ácido mercaptopropiónico.

A continuación, los puntos cuánticos se conjuntan con poli mezcla y B; las bacterias cultivadas con antibióticos luego se tratan con puntos cuánticos conjugados y no conjugados con antibióticos, y la mitad de las muestras se someten a una radiación con luz azul de 440 nanómetros durante 30 minutos, lo que provoca que los puntos cuánticos generen excitones y especies reactivas de oxígeno para evaluar el efecto de los tratamientos con puntos cuánticos sobre el crecimiento y la supervivencia bacteriana. Se toman lecturas de densidad óptica y se realizan conteos de colonias. Los datos resultantes indican que la aplicación de puntos cuánticos de telururo de cadmio conjugados con antibióticos, seguida de radiación I, produce los mayores efectos tidales entre las condiciones evaluadas.

Aunque este método puede proporcionar información sobre el efecto de los puntos cuánticos de telururo de cadmio y su conjugación con polix en B sobre el crecimiento de E. coli, también puede aplicarse a otros tipos de nanopartículas y antibióticos en diversas cepas bacterianas. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque cualquier exceso de MPA hará que los puntos cuánticos se agreguen, y si pipetean incluso una pequeña cantidad de toline, destruirán el filtro.

Aunque hoy demostraremos un método para evaluar los efectos antibacterianos de puntos cuánticos KE IDE conjugados con antibióticos, un método similar podría utilizarse con otros tipos de puntos cuánticos, como fosfato de indio, sulfato de zinc y sulfuro de cadmio sulfato de zinc. Comience este procedimiento preparando una solución de puntos cuánticos de telururo de cadmio o puntos cuánticos CDTE en tolueno a 15 micromolar en un vial de vidrio; mida la densidad óptica o DO mediante espectroscopía de absorción, transfiriendo con una pipeta 200 microlitros de esta solución patrón a un vial de vidrio.

No utilice plástico. A continuación, agregue 800 microlitros de tolueno, un mililitro de tampón borato 200 milimolar y dos microlitros de ácido mercaptopropiónico 11,5 molar o MPA, tape el vial y agítelo vigorosamente durante 30 a 60 segundos. Después de agitar, las fases acuosa y orgánica se separarán espontáneamente.

La fase acuosa adquirirá el color de los puntos cuánticos. Para evitar la capa de solapamiento, retírela, luego extraiga la fase de los puntos cuánticos y transfiera al tubo limpio. Para purificar los puntos cuánticos solubilizados, transfiera al filtro centrífugo de 500 microlitros.

Añada 100 microlitros de tampón bore ocho 50 milimolar y centrifugue a 3000 × g durante 13 minutos. Realice este lavado cuatro veces tras el lavado final. Suspenda los puntos cuánticos lavados en 500 microlitros de tampón bore y almacene a cuatro grados Celsius.

Se mantendrán estables durante una a dos semanas. Para estimar la concentración de los puntos cuánticos, mida los espectros de absorbancia y emisión. Esta figura muestra puntos cuánticos de CDTE bajo iluminación con lámpara UV y los espectros de emisión antes y después de la solubilización en agua, lo que demuestra un cambio despreciable en las propiedades ópticas tras el intercambio de ligandos.

Esta parte del protocolo es aplicable a cualquier nanopartícula solarizada en agua con carga negativa, incluyendo musgo, puntos cuánticos comerciales, partículas metálicas y más. En este ejemplo, el antibiótico polimixina B o PMB se conjugará a los puntos cuánticos en una relación molar de 30 a 1. La PMB tiene carga positiva y se autoensambla sin necesidad de conjugación. Reactivos: disolver PMB en agua.

A 60 micromolar. Para una placa de 96 pocillos con 0,3 mililitros de bacterias por pocillo en cuádruples duplicados, 0,5 mililitros del conjugado de 200 nanomolar es suficiente para preparar esto con 100 microlitros de puntos cuánticos de un micromolar en tampón bórico 50 milimolar en un tubo de microcentrífuga.

A continuación, agregue 50 microlitros de la solución de antibiótico PMB 10 x o 60 micromolar en agua al tubo de conjugado. Agregue 50 microlitros de agua al tubo de control. Ajuste el volumen a 0,5 mililitros con tampón ate 50 milimolar, proteja los tubos de la luz con papel de aluminio y colóquelos en un rotador durante una hora.

Si ocurre agregación, repita la conjugación con concentraciones más bajas de antibiótico. Titule la concentración hacia arriba hasta que las partículas no se agreguen, para lavar los conjugados. Pase las soluciones a través de un filtro con un límite de corte de peso molecular de 10,000, que funciona para la mayoría de los antibióticos pero no para proteínas ni anticuerpos.

Finalmente, estime el número de moléculas de antibiótico por punto cuántico mediante espectroscopía de absorción o fluorescencia, electroforesis en gel o espectroscopía infrarroja transformada de Fourier. Esta figura muestra los espectros típicos de absorción y emisión de los puntos cuánticos antes de la conjugación con PMB y la emisión después de la adición de 160 equivalentes molares de PMB.

Se muestra aquí la relación entre la proporción de PMB y la intensidad de emisión de puntos cuánticos indicada por los cuadrados, y la ubicación de la longitud de onda máxima indicada por los triángulos. A medida que aumenta la concentración de PMB, la intensidad de emisión de los puntos cuánticos disminuye, lo que provoca un desplazamiento en la longitud de onda de emisión máxima. La siguiente parte del protocolo se realiza para determinar la concentración inhibitoria media o IC 50 del antibiótico y la toxicidad cuántica dos días antes del experimento de conjugación, por la tarde.

Siembre 10 mililitros de medio LB a partir de una colonia fresca de e coli. Al día siguiente, una o dos horas antes del experimento, llene cada pocillo de una placa clara de 96 pocillos con medio de crecimiento. La placa de ensayo debe organizarse como se muestra aquí.

Las muestras deben sembrarse por triplicado y con concentraciones de antibióticos que abarquen un rango suficientemente amplio como para incluir una concentración que inhiba muy poco a las bacterias y otra que las mate completamente. También deben incluirse por triplicado pozos que contengan puntos cuánticos en las concentraciones que se utilizarán en los experimentos de conjugación. Utilizando una pipeta multicanal, añada a los pozos adecuados de uno a 50 microlitros de cultivo bacteriano.

La concentración dependerá de la velocidad de crecimiento de la cepa particular y será necesario calibrarla en consecuencia. Para monitorear el crecimiento, coloque la placa en un lector de placas y configúrelo para que lea cada 10 minutos durante dos horas a 600 nanómetros. Cuando todas las células alcancen una DO de 0.1 a 0.15, retire la placa del lector de placas y detenga el registro.

A continuación, agregue el PMB en puntos cuánticos a los pozos adecuados y cubra en triplicado la mitad de la placa con papel de aluminio. Luego, coloque la placa bajo una lámpara personalizada de 440 nanómetros hecha con LED de 2,4 milivatios durante 30 minutos para exponer el lado iluminado de la placa. Después de la exposición a la luz, coloque la placa en el lector de placas y registre la DO 600 cada 10 minutos durante cinco a 12 horas, dependiendo de la velocidad de crecimiento. Mantenga la temperatura por debajo de 32 grados Celsius si es posible, para evitar el secado de los cultivos utilizando el software.

Coloque las curvas de crecimiento en un punto de tiempo seleccionado frente al logaritmo de la concentración y determine la IC50 del antibiótico utilizando la ecuación de Hill mostrada en pantalla, donde H es el coeficiente de Hill, Ymáx es el punto más alto de crecimiento y Ymín es el punto cero, preferiblemente también en una meseta. Al final del período de registro, los pocillos claros indicarán muerte celular completa y debería observarse un gradiente de densidad celular a lo largo de concentraciones crecientes del fármaco.

Las bacterias deben mostrar curvas de crecimiento en forma de S como se muestra aquí. La ubicación del máximo meseta variará considerablemente de una cepa a otra y también depende de la temperatura. Puede elegirse un punto temporal determinado como representativo y los valores se grafican frente al logaritmo del antibiótico para obtener la IC 50 y evaluar los puntos cuánticos.

La supervivencia frente a la toxicidad versus el logaritmo de la concentración de puntos cuánticos también puede representarse gráficamente, pero lograr una eliminación bacteriana significativa únicamente con puntos cuánticos a la concentración utilizada es raro. Una vez que se ha determinado la toxicidad de los puntos cuánticos y de los antibióticos por separado, se puede aplicar el mismo protocolo para determinar la toxicidad del antibiótico. Puntos cuánticos conjugados mostrados.

A continuación se muestra un ejemplo de diseño para el ensayo. Tenga en cuenta que los conjugados se prueban en concentraciones crecientes en cuádruple réplica; se debe incluir una tira de control con solo bacterias, una tira con solo fármaco y pozos de muestra solo para puntos cuánticos. Las lecturas de DO 600 luego pueden utilizarse para generar curvas de crecimiento, y se determinan los valores CMI50 como antes.

Esta figura muestra un ejemplo de conjugados que son tan tóxicos como el antibiótico solo y un ejemplo de conjugados que son más tóxicos. Para determinar el número de unidades formadoras de colonias o UFC para cada condición, seleccione uno o más pocillos de la placa de 96 pocillos tratada que se utilizarán para realizar los recuentos en placa. Realice una dilución seriada de cada una de las muestras bacterianas seleccionadas con solución salina.

Para ello, pipete 180 microlitros de solución salina a las columnas adecuadas. Transfiera 20 microlitros de la solución bacteriana y dilúyalos con 180 microlitros de solución salina. Cambie la punta del pipeta, mezcle y transfiera 20 microlitros de la solución bacteriana diluida a 180 microlitros de solución salina.

Repita este proceso seis veces. A continuación, tome 10 microlitros de cada una de las últimas seis diluciones y siembre por punción en una placa rectangular con medio auger. Se pueden sembrar 36 punciones en una placa rectangular.

Deje que la placa se seque durante 15 minutos sobre la bancada; después de 15 minutos, incube la placa a 37 grados Celsius durante 16 horas tras la incubación. Cuente las colonias para determinar las unidades formadoras de colonias por mililitro. Multiplique el número de colonias por el factor de dilución y divida entre el volumen sembrado para determinar el efecto de los tratamientos sobre el crecimiento bacteriano.

La densidad celular de E. coli se midió a una DO 600. Aquí se muestran curvas representativas de crecimiento bacteriano con diferentes concentraciones del fármaco, desde cero hasta la muerte celular completa. Los símbolos abiertos corresponden solo a PMB, con las concentraciones indicadas.

Los símbolos sólidos corresponden a C-D-T-E-P-M-B sin irradiación y los símbolos semillenos corresponden a C-D-T-E-P-M-B con irradiación. La irradiación no tuvo efecto en las muestras de PMB únicamente, por lo que estas curvas se omitieron para mayor claridad. A continuación se muestran gráficos de los valores de la curva de crecimiento a los 200 minutos frente al log PMB y los ajustes a esta ecuación para determinar los valores de IC 50, con el fin de controlar los efectos de la luz.

Se realiza una curva solo con antibiótico y 30 minutos de exposición a la luz. Esta figura indica la supervivencia bacteriana a los 200 minutos frente a la concentración de puntos cuánticos utilizando puntos cuánticos de CDTE. Se observa cierta toxicidad con la exposición a la luz, pero demasiado baja como para determinar un valor de IC 50.

Esto indica que la toxicidad del CDTE por sí solo, a las concentraciones utilizadas en el experimento de conjugación, es despreciable. Para comparar los efectos de los diferentes tratamientos sobre el crecimiento celular, se representaron los valores de la curva de crecimiento a los 200 minutos y se ajustaron a la ecuación mostrada anteriormente, como se observa aquí. Los conjugados C-D-T-E-P-M-B resultaron más tóxicos que el PMB por sí solo. En comparación, los conjugados de nanopartículas doradas A-U-P-M-B no muestran una toxicidad aumentada respecto al PMB solo, para determinar el efecto de los tratamientos sobre la supervivencia bacteriana.

Se determinó el número de unidades formadoras de colonias para E. coli sembradas en una placa de 96 pocillos tratada con P-M-B-Q-D-P-M-B o QD solo, con o sin radiación I durante 30 minutos, seguido de incubación a 32 grados Celsius durante cuatro horas. Se realizaron diluciones seriadas de cada muestra bacteriana con solución salina y se sembraron 10 microlitros de soluciones desde 100 x hasta 10 a la séptima X en placas de auger. Las placas se incubaron a 37 grados Celsius y las colonias se contaron tras 16 horas.

En este ejemplo, las columnas A a C de la placa contienen bacterias tratadas con concentraciones crecientes de CDTE. Los conjugados sin irradiación y las columnas D a F contienen bacterias tratadas con concentraciones crecientes de conjugados. Junto con 30 minutos de irradiación, las diluciones se muestran a lo largo de las filas.

Los datos indican que tras la irradiación, los conjugados presentan una mayor inhibición del crecimiento bacteriano en comparación con los conjugados sin irradiación. No olvide que los reactivos ca son extremadamente tóxicos y que siempre se deben tomar precauciones, como el uso de guantes, batas de laboratorio y gafas de protección, al realizar este procedimiento. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar un cribado de alto rendimiento del efecto antibacteriano de nanopartículas con o sin conjugación a antibióticos.