Un sistema para la Ex vivo Cultivo de páncreas embrionario

El objetivo general de este procedimiento es diseccionar y cultivar yemas pancreáticas embrionarias de ratón, ex vivo, lo que permite la visualización directa del páncreas en desarrollo. Esto se logra diseccionando primero embriones de ratón del día embrionario 11,5 o 12,5 y extirpando la parte superior del cuerpo y la región de la cola para aislar la mitad del cuerpo del embrión. El segundo paso es exponer la región del duodeno y el estómago para su localización, y luego la disección de la yema pancreática dorsal.

A continuación, el cogollo se transfiere al micropocillo de una placa MacTech y se cultiva durante un máximo de una semana. Por último, el explan se puede analizar para la obtención de imágenes de células vivas, o el explan puede ser fijo, teñido de montaje completo y analizado mediante imágenes de inmunofluorescencia. En última instancia, se puede evaluar la diferenciación de las células pancreáticas, la organización del citoesqueleto y la polaridad celular y la morfogénesis ramificada.

El cultivo ex vivo de explantes de páncreas puede ayudar a responder preguntas clave en la organogénesis del páncreas, como la morfogénesis ramificada. ¿Cómo tiene lugar en el páncreas en desarrollo y cómo este evento está conectado con el crecimiento y la diferenciación? El día antes del experimento, cubra los micropocillos de 20 milímetros de diámetro con fondo de vidrio de placas de Petri MacTech de 35 milímetros con aproximadamente 150 microlitros de fibronectina que cubran toda la superficie de vidrio.

Luego coloque los platos en un refrigerador de cuatro grados centígrados para la incubación durante la noche. El día de la disección, aspirar la fibronectina. Enjuague los micropocillos con agua apta para cultivos celulares y agregue un volumen mínimo de 150 microlitros de medio de disección a cada pocillo.

Para asegurar el éxito de la disección, es fundamental conocer bien la estructura anatómica del embrión y poder localizar la yema pancreática dorsal bajo un microscopio estereoscópico con iluminación desde arriba. Utilice pinzas de Dumont para separar el útero en segmentos individuales del embrión. A continuación, retire suavemente el músculo del útero y extraiga los embriones individuales que están rodeados por la decidua.

Usando técnicas estándar de disección de embriones, exponga los embriones y retire el saco vitelino y el amnios. Posteriormente, se extirpa la región de la cola y la parte superior del cuerpo del embrión por encima del hígado. Ahora, usando solo iluminación trans desde abajo, use fórceps para hacer suavemente una incisión lateral para abrir la mitad del cuerpo del embrión, facilitando la exposición de los órganos internos.

Localiza el estómago y el bazo. La yema pancreática dorsal está unida lateralmente a la región posterior del estómago. Con pinzas de Dumont, diseccione la yema pancreática dorsal lejos del estómago y el bazo, pero deje algo de mesénquima alrededor del epitelio como para la yema pancreática que se muestra en esta figura.

Finalmente, use una pipeta de pasto de vidrio para transferir el brote aislado a una placa de Petri de 35 milímetros que contenga medio de cultivo en frío. Después de precalentar el medio de cultivo, reemplace el medio de disección en los platos de tecnología mate recubiertos de fibra nin con aproximadamente 150 microlitros del medio de cultivo. En una campana de flujo laminar estéril, es importante colocar el exponente pancreático con cuidado en el centro de la placa mate para asegurar la unión y propagación de las células.

A continuación, utilice una pipeta de vidrio para pastos para transferir con cuidado un explan pancreático a cada uno de los platos de tecnología mate recubiertos. Para asegurar la propagación durante el cultivo, rasgue parcialmente los mesénquimas que rodean el explana con una aguja fina. Ahora coloque suavemente el explan en una incubadora de cultivo de tejidos durante unas horas para que se adhiera al fondo de vidrio de los micropocillos.

Una vez que se haya colocado el plan, llene los platos de mat tech con 1,5 a dos mililitros de medio de cultivo precalentado. Cambie el medio de cultivo cada dos días durante cinco días hasta una semana. Comience aspirando el medio de cultivo y lave el explan una vez con dos mililitros de PBS.

A continuación, retire el PBS y fije los implantes X con dos mililitros de formaldehído al 4% de acero helado, y coloque la placa de tecnología mate en hielo durante 20 minutos, agitando la placa suavemente de vez en cuando. A continuación, retire el aldehído de la paraforma y lave el explan tres veces con dos mililitros de PBS durante 10 minutos cada uno a temperatura ambiente. Después del lavado bloquee con dos mililitros de solución de bloqueo durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente. Ahora transfiera las placas mat tech a la cámara frigorífica y colóquelas dentro de una cámara húmeda.

Para evitar la evaporación, agregue un mínimo de 150 microlitros del anticuerpo primario diluido en solución de bloqueo directamente en el centro del micropocillo de 20 milímetros. Depresión de las placas mat tech que cubren toda la superficie explanada para la incubación nocturna a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, retire la solución de anticuerpos y lave cualquier anticuerpo no unido tres veces con dos mililitros de PBS más tween 20 durante 30 minutos cada uno a temperatura ambiente.

Después del lavado, retire el PBT y cubra todo el plan con un mínimo de 150 microlitros del anticuerpo secundario delirante e incube el extracto durante una o dos horas a temperatura ambiente en la oscuridad después de teñir con el anticuerpo secundario. Lavar el explan tres veces con dos mililitros de PBS plus tween. 20 durante 30 minutos cada uno a temperatura ambiente y luego una vez con PBS solo para quitar el tween 20.

Finalmente, retire el PBS y agregue medio de montaje acuoso con antidecoloración gota a gota en el micro pocillo de 20 milímetros de las placas mat tech. Y luego cubra suavemente el explan con un cubreobjetos de vidrio evitando burbujas de aire Después de que el explan pancreático se haya adherido firmemente al plato con fondo de vidrio, ensamble y encienda la caja del calentador al menos una hora antes de la obtención de imágenes mientras el equipo se calienta, aspire y reemplace el medio explan con medio de cultivo fresco dentro de una campana de flujo laminar. A continuación, transfiera suavemente los implantes a la sala del microscopio y coloque la placa de tecnología de estera en el portamuestras del microscopio confocal.

Agregue medio de agua al objetivo. Cierre la cámara ambiental y luego concéntrese en la región de interés en el explan. Después de dos días de cultivo, los explantes pancreáticos experimentan un crecimiento significativo y comienzan a organizarse en estructuras epiteliales ramificadas.

Observe el área donde se ha iniciado la bifurcación. Demarcada en la imagen de la derecha por la línea de puntos roja, esta reconstrucción 3D representativa de la tinción inmunológica de montaje completo en el tercer día de cultivo pancreático demuestra cómo los explantes exhiben túbulos de células PDX one positivas que se someten a una ramificación extensa a las 48 horas de cultivo. Los explantes en el cuarto día de cultivo experimentan la segregación típica de la punta y el tronco del epitelio. La tinción para EC Ahern en rojo y fosfohistona en azul aparece en las células progenitoras en las puntas de las ramas epiteliales, que también están demarcadas por las líneas discontinuas. En este día representativo, la tinción inmunológica de tres montajes enteros para marcadores de linaje endocrino en pancreas explan, la tinción de insulina está representada en verde, el glucagón aparece en azul y la herrina eca está en rojo, con las flechas amarillas que indican grupos de células positivas para insulina y glucagón.

En el recuadro, uno de los grupos endocrinos se magnifica. Además, el epitelio pancreático en cultivos ex vivo muestra una adecuada organización del citoesqueleto y polaridad celular con localización apical de la actina F, que aparece aquí en verde y la integrina beta uno en las membranas basales que aparece aquí en rojo. Obsérvese que las células mesenquimales indicadas por el asterisco intercaladas entre las células epiteliales P pdx one positivas.

En esta figura se muestran fotogramas representativos tomados cada 12 minutos durante un total de 15 horas de una película de lapso de tiempo de explantes de membrana, tomate y páncreas cultivados. Las líneas discontinuas indican la punta de las ramas y el borde entre el epitelio y el mesénquima. Tenga en cuenta que después de un experimento de lapso de tiempo de 12 horas, la señal fluorescente del tomate de membrana sigue siendo viable y detectable aunque su intensidad se reduzca.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo diseccionar y cultivar yemas pancreáticas, y esto lo ayudará a estudiar varios aspectos del desarrollo pancreático, incluido el crecimiento y la diferenciación de la morfogénesis.