En electroporación in vitro del labio inferior rómbico mitad de la gestación de embriones de ratón

El objetivo general de este procedimiento consiste en manipular la expresión génica en progenitores del rombencéfalo embrionario mediante la introducción de ADN plasmídico por electrotransferencia en etapas tempranas del período de gestación. Esto se logra primero aislado embriones a los 11,5 días de gestación y colocándolos con la cara dorsal hacia arriba en solución salina tamponada con fosfatos estéril. El segundo paso consiste en inyectar aproximadamente 50 microlitros del plásmido de expresión en 0,01 % de verde rápido.

En una inyección exitosa, todo el sistema ventricular se llenará con la mezcla de ADN y verde rápido. A continuación, el embrión se somete a un impulso eléctrico. El lado del embrión más cercano al electrodo cargado positivamente incorporará el ADN plasmídico.

El otro lado servirá como control negativo interno. El paso final consiste en colocar los embriones en cultivo de tejidos durante al menos 24 horas. Finalmente, el gen electroporado se expresará tras 24 horas de cultivo y podrá evaluarse mediante inmunohistoquímica.

La ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes es que permite la manipulación de progenitores del encéfalo posterior embrionario en puntos temporales más tempranos de la gestación. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo, como la forma en que diferentes genes ural pueden influir en el destino de los progenitores embrionarios. Comience este procedimiento esterilizando las herramientas de disección y la cabina de flujo laminar de acuerdo con el manuscrito adjunto.

Para recolectar los embriones, coloque un ratón hembra sacrificado que esté preñado con crías en el día gestacional E 11.5 sobre la bandeja de disección en la campana. A continuación, rocíe el abdomen del ratón con etanol al 70 %. Abra la cavidad peritoneal y sujete las paredes a la bandeja de disección.

Luego extraiga los cuernos uterinos para que queden dentro de la cavidad peritoneal. Utilizando pinzas, abra cuidadosamente la pared del cuerno uterino. Use una cuchara de 20 milímetros para retirar suavemente los embriones dentro del saco vitelino de la placenta.

Después de eso, coloque los embriones en una placa de cultivo de tejidos de 100 milímetros. Precargada con 10 mililitros de PBS estéril y precalentado al 1×. En este paso, transfiera el primer embrión a una nueva placa de 100 milímetros precargada con 10 mililitros de PBS estéril al 1× que se precalentó a 37 grados Celsius.

A continuación, retire con cuidado y deseche la vesícula vitelina. Luego, coloque el embrión de modo que su lado dorsal quede hacia arriba. Sujete suavemente el embrión con las paletas de electrodo de siete milímetros bajo un microscopio de disección.

Coloque los electrodos uno a cada lado del tubo neural al nivel del cuarto ventrículo del rombencéfalo. A continuación, use una jeringa de un cc para aspirar la mezcla de ADN plasmídico y Fast Green al 0,01 %; en general, 500 microlitros de la mezcla deberían ser suficientes para la electroforesis de al menos ocho a diez embriones. Después, perfore suavemente la lámina superior que recubre el cuarto ventrículo con una aguja tuberculínica de calibre 25 y cinco octavos, conectada a la jeringa de un cc.

Luego, inyecte aproximadamente 50 microlitros de la mezcla de ADN DI en el ventrículo. Las inyecciones exitosas se caracterizan porque la mezcla de ADN DI llena todo el sistema ventricular. Un método alternativo para administrar la mezcla de ADN DI consiste en acceder al sistema ventricular perforando el velo, ubicado sobre el mesencéfalo, encender el generador de pulsos y luego aplicar cinco pulsos cuadrados mediante un generador de pulsos eléctricos y paletas de electrodo de siete milímetros, colocadas lo más cerca posible del tejido adyacente al electrodo positivo.

A continuación, al tomar el plásmido en una cabina de flujo laminar, rellene los pocillos úlceras de un plato de cultivo de 12 pocillos con dos mililitros de medio DME MF 12 suplementado con 10% de suero bovino fetal, 5% de suero equino, 1% de glutamina, 1% de penicilina-estreptomicina que se ha precalentado a 37 grados Celsius. Luego, pellizque el embrión en la sección media con un par de pinzas. Posteriormente, retire la porción posterior del embrión y coloque la porción anterior en uno de los pocillos llenos del plato de cultivo.

Repita el procedimiento para todos los embriones y llene únicamente los pocillos exteriores de la placa de 12 pocillos. Para evitar la contaminación de los cultivos, incube los embriones en un incubador a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante 24 horas para permitir la expresión del plásmido electroporado. Si se desea un tiempo de cultivo más prolongado, llene los pocillos periféricos de un nuevo plato de 12 pocillos con dos mililitros del medio D-M-E-M-F 12.

Transfiera los embriones con una cuchara esterilizada a los pocillos de una placa nueva. Luego, colóquelos de nuevo en el incubador a 37 grados Celsius y cultívelos durante hasta 48 horas para fijar los embriones para su análisis. Llene una placa de 12 pocillos con PBS al uno por uno, luego transfiera los embriones y enjuáguelos a cuatro grados Celsius durante cinco minutos.

A continuación, fije los embriones en paraformaldehído al 2% en PBS 1X durante dos horas a cuatro grados Celsius. Luego, enjuáguelos tres veces en PBS 1X a cuatro grados Celsius durante cinco minutos. Nuevamente, después de llenar una nueva placa de 12 pocillos con sacarosa al 30% en PBS 1X.

Transfiera los embriones a esos pocillos y equilibre durante la noche a cuatro grados Celsius. Luego, incluya los embriones en el compuesto de temperatura óptima para corte utilizando un baño de etanol con hielo seco o almacénelos a menos 20 grados Celsius. Finalmente, seccione los embriones en cortes de 30 micrones con un criostato.

Móntelos en portaobjetos y almacénelos a menos 20 grados Celsius desde uni Histochemical. Los estudios mostrados aquí son los resultados representativos de la inmunohistoquímica para GFP en secciones transversales de un embrión electroporado de E 11.5 después de 24 horas de cultivo. Las flechas que se observan aquí indican la lámina dorsal que atrapa el anticuerpo secundario.

Los resultados muestran que el área electroporada del labio ROIC inferior fue restringida y no se extendió a todo el eje anterior-posterior del tubo neural. Aquí se muestran los resultados de dos de las proteínas analizadas: MASH1 y Math1. Observamos que la mayoría de los embriones conservan niveles normales de expresión tras la electroporación y el cultivo, en comparación con los embriones control a las 11,5. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en una a dos horas si se realiza adecuadamente.

Después de ver este video, ahora debería tener una buena comprensión de cómo utilizar el ensayo de electroforesis in vitro para manipular la expresión génica en los progenitores de la membrana embrionaria del ratón.