Name: Oct4GiP reportero de ensayo para estudiar los genes que regulan la de embriones de ratón con células madre de mantenimiento y auto-renovación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Aprende a utilizar el ensayo reportero Oct4GiP para estudiar genes que regulan el mantenimiento y auto-renovación de células madre embrionarias de ratón mediante silenciamiento génico y citometría de flujo.

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Damos las gracias a Brad Lackford para la lectura y edición del manuscrito. Esta investigación fue apoyada por el Instituto Nacional de Ciencias de Salud Ambiental, Institutos Nacionales de Salud, Programa de Investigación Intramural Z01ES102745 (GH).

1. Oct4GiP madre embrionarias de ratón de mantenimiento de la célula Oct4GiP células fueron amablemente proporcionados por el Dr. Austin Smith. Se deriva de los ratones portadores 129/Ola un transgén Oct4-GFPiresPac 4,5. Ellos se mantienen en gelatina placas recubiertas de cultivo de tejidos en el medio ESGRO grado completa más clonal (Millipore), o en el medio M15: DMEM (Invitrogen) suplementado con FBS al 15%, 1000 U / ml ESGRO (Millipore), 1x para no- aminoácidos esenciales (Invitrogen), 1x Nucleasides EmbryoMax (Millipore), y 10 mM mercaptoetanol β-. <ol><li> Coat con placas% de gelatina 0,1 (Sigma) a temperatura ambiente durante 30 minutos (0,1 ml de solución de gelatina / cm 2). </li><li> Células de la placa Oct4GiP en gelatina revestida de placas de 2 x 10 ~ 4 / cm 2. </li><li> Dividir las celdas de cada dos días con 0,05% de tripsina. </li></ol> 2. siRNA transfección en células Oct4GiP El ensayo reportero Oct4GiP es más convenientemente lleva a cabo en gelatina recubierto con fondo plano 96 - o placas 384-pocillos (Corning o BD) en el medio M15. El procedimiento general se esboza en la Figura 1. <ol><li> siRNA-lípidos complejos de montaje: <ol><li> Para la transfección en placas de 96 pocillos, ensamble de lípidos complejos de siRNA en fondo en U placas de 96 pocillos. </li><li> En cada pocillo, mezclar 10 l OptiMEM (Invitrogen) y 0,3 l Lipofectamine 2000 (Invitrogen) y se incuba a temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Añadir 5 pmol ARNsi a la mezcla de lípidos OptiMEM e incubar durante otros 15 minutos. El siRNA: relación de los lípidos es de 100 pmol: 6ul. </li><li> Transferir los complejos de lípidos siRNA en OptiMEM de la placa de fondo en U a la revestida con gelatina de fondo plano placa con una pipeta de canales múltiples. </li><li> Para la transfección en placas de 384 pocillos, preparar los complejos de lípidos siRNA con 0,1 l Lipofectamine 2000 y 2 siRNA pmol en 10 OptiMEM l. </li></ol></li></ol> Nota: La concentración final de siRNAlas transfecciones es 50 nM. Llevar a cabo biológica 3-4 repeticiones para cada transfección de siRNA. Establecer las mezclas maestras de los complejos de lípidos siRNA en la placa de fondo en U y la alícuota en el fondo plano de gelatina recubierto de placas. <ol start="2"><li> Oct4GiP chapado de células y transfección: <ol><li> Para la transfección en placas de 96 pocillos, recoger las células Oct4GiP y resuspender en medio de frescas M15 a 9 x 10 4 células / ml. </li><li> Añadir 100 l de la suspensión de células en cada pocillo utilizando una pipeta de canales múltiples. </li><li> Mezclar la suspensión de células con los pre-alícuotas lípidos siRNA-complejos en el pozo por pipetear arriba y hacia abajo 3-5 veces. Cambiar las puntas de siRNA transfections diferentes. </li><li> Para la transfección en placas de 384-pozos, Resuspender las células Oct4GiP a 6 x 10 4 células / ml y 30 alícuota suspensión celular l a cada pocillo. </li></ol></li></ol> Nota: La densidad de célula de recubrimiento óptimo es generalmente de 3 x 10 5 células / cm 2, pero may requieren una mayor optimización de siRNAs que afectan drásticamente el crecimiento de células o la viabilidad. Baja densidad de placas dará lugar a la supervivencia celular deficiente durante la transfección. Densidad de placas de alta dará lugar a un fondo elevado debido a la diferenciación de alta confluencia celular inducida. Si es necesario, prueba de densidad de placas entre 2-4 x 10 5 células / cm 2. <ol start="3"><li> Cambio de medio: <ol><li> Eliminar el medio de edad con múltiples canales de aspiración (Corning) o el vacío varita (VP-científico). Tenga cuidado de no dañar las células en la parte inferior de las placas. </li><li> Alimentar a las células con un nuevo medio de células ES (100 l para la placa de 96 pozos y 30 l de 384 y placa) con pipeta multicanal todos los días. </li></ol></li></ol> 3. Análisis FACS <ol><li> Disociación celular: <ol><li> Cuatro días después de la transfección, eliminar el medio usando multi-canal de aspiración (Corning) o el vacío varita (VP-científico). </li><li> Para placas de 96 pocillos, lavar las células una vez con 100μl de PBS. </li><li> Añadir 25 l de tripsina 0,25% a cada pocillo utilizando una pipeta multicanal. </li><li> Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos con agitación ocasional, y una inspección visual para asegurar desprendimiento completo de las células. </li><li> Añadir 90 l de PBS con FBS al 10% para inactivar la tripsina y disociar las células en una suspensión de células individuales por pipeteado repetido. </li><li> Para placas de 384 pocillos, disociar las células con 10 l de tripsina y enfriamiento con 30 ul PBS con 10% de FBS. </li></ol></li><li> FACS análisis: <ol><li> Analizar la fluorescencia de GFP en el analizador BD LSRII FACS equipado con la unidad HTS u otro similar equipado analizador FACS (como Accuri o Intellicyt). </li><li> Utilice el modo de alto rendimiento en el HTS y analizar los 10 l de suspensión celular. Establecer el umbral de recuento de 1,0 x 10 4 células. </li><li> Ajuste la tensión de la PMT y el umbral para capturar las células en la trama hacia adelante frente a dispersión lateral. Puerta de la población de células vivas en la dwnARD vs lado gráfico de dispersión. </li><li> Crear un histograma para el canal de las buenas prácticas agrarias. Ajuste de la puerta en el canal de GFP de modo que ~ 10% de las células parecen ser GFP-negativo en las células transfectadas simuladas o control siRNA. </li><li> Determinar% negativas GFP-células de cada tratamiento: las células diferenciadas% =% de células GFP-negativos. Comparar las células diferenciadas% entre experimentales y de control de siRNA-transfecciones con dos colas t-test, y anotar los golpes positivos con los valores de p &lt;0.01. </li></ol></li></ol> 4. Los resultados representativos Oct4, Nanog, y Sox2 son tres genes que desempeñan papeles cruciales en el mantenimiento de células ES de auto-renovación 6,7,9-11. Figura 2 muestra que el reportero de ensayo Oct4GiP puede detectar fácilmente la diferenciación causada por el silenciamiento de estos factores en el Oct4GiP células madre embrionarias. La figura 2A muestra las células ES son Oct4GiP GFP-positivo cuando se mantiene como ES<html> células. Figura 2B muestra el diagrama de dispersión hacia adelante contra lado y el histograma del canal GFP de las células transfectadas con el Oct4GiP control o Oct4 siRNAs. Es necesario puerta para las células vivas en el gráfico de dispersión hacia adelante contra lado, como las células muertas y los desechos son GFP-negativo y aumentará fondo. Por otro lado, doblete discriminación para excluir posibles grumos de células no es siempre necesaria. En las células de control siRNA-transfectadas, la gran mayoría de las células debe ser GFP-positivo. Si evidentes las buenas prácticas agrarias-negativos poblaciones están presentes en los pozos de control de siRNA-transfectadas, las células Oct4GiP de partida o el procedimiento de transfección puede estar comprometida y el resultado no puede ser interpretable. La figura 2C muestra el gráfico de barras de las células diferenciadas% (células diferenciadas% =% GFP-negativos células) de control, Oct4, Nanog, y Sox2 siRNA-transfectadas las células. <html> d/3987/3987fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Esquema del reportero de ensayo Oct4GiP. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3987/3987fig2.jpg" /> Figura 2. Ensayo de Oct4GiP reportero puede detectar la diferenciación de células ES causada por Nanog, Oct4, Sox2 o el silenciamiento. A) E14Tg2a (de tipo salvaje, la línea de negro) y las células Oct4GiP (línea verde) se analizaron por FACS. Histograma de la GFP canales muestra que las células son las buenas prácticas agrarias Oct4GiP positivo. B) Las células fueron transfectadas Oct4GiP en placas de 96 pocillos con el control o Oct4 siRNA y FACS analizaron 4 días después de la transfección. Adelante vs gráficos de dispersión y los histogramas laterales de la GFP-canal de las células transfectadas se muestran. C) Las células Oct4GiP fueron transfectadas con el control, Nanog, Oct4, Sox2, o siRNA. Las células diferenciadas% se determinó a partir de la GFP% negativo células 4 días después de la transfección, y se representan como media + / - error estándar de la media (n = 4).f = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/3987/3987fig2large.jpg&quot; target = &quot;_blank&quot;&gt; Haga clic aquí para ver más grande figura.

<ol><li>Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+differentiation%3A+emergence+of+a+new+era+in+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell differentiation: emergence of a new era in biology and medicine.</a> Genes Dev. 19, 1129-1155 (2005).</li>
<li>Murry, C. E., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+embryonic+stem+cells+to+clinically+relevant+populations%3A+lessons+from+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development.</a> Cell. 132, 661-680 (2008).</li>
<li>Hu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+RNAi+screen+identifies+a+new+transcriptional+module+required+for+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A genome-wide RNAi screen identifies a new transcriptional module required for self-renewal.</a> Genes Dev. 23, 837-848 (2009).</li>
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<li>Ying, Q. L., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defined+conditions+for+neural+commitment+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Defined conditions for neural commitment and differentiation.</a> Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).</li>
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<li>Niwa, H., Miyazaki, J., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+expression+of+Oct-3%2F4+defines+differentiation%2C+dedifferentiation+or+self-renewal+of+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells.</a> Nat. Genet. 24, 372-376 (2000).</li>
<li>Ding, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-scale+RNAi+screen+for+Oct4+modulators+defines+a+role+of+the+Paf1+complex+for+embryonic+stem+cell+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A genome-scale RNAi screen for Oct4 modulators defines a role of the Paf1 complex for embryonic stem cell identity.</a> Cell Stem Cell. 4, 403-415 (2009).</li>
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<li>Masui, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotency+governed+by+Sox2+via+regulation+of+Oct3%2F4+expression+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Pluripotency governed by Sox2 via regulation of Oct3/4 expression in mouse embryonic stem cells.</a> Nat. Cell Biol. 9, 625-635 (2007).</li>
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<li>Fazzio, T. G., Huff, J. T., Panning, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNAi+screen+of+chromatin+proteins+identifies+Tip60-p400+as+a+regulator+of+embryonic+stem+cell+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An RNAi screen of chromatin proteins identifies Tip60-p400 as a regulator of embryonic stem cell identity.</a> Cell. 134, 162-174 (2008).</li>
<li>Pease, S., Braghetta, P., Gearing, D., Grail, D., Williams, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+embryonic+stem+%28ES%29+cells+in+media+supplemented+with+recombinant+leukemia+inhibitory+factor%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Isolation of embryonic stem (ES) cells in media supplemented with recombinant leukemia inhibitory factor.</a> 141, 344-352 (1990).</li>
<li>Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+the+embryonic+stem+cell+state%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Control of the embryonic stem cell state.</a> Cell. 144, 940-954 (2011).</li>
<li>Chambers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanog+safeguards+pluripotency+and+mediates+germline+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development.</a> Nature. 450, 1230-1234 (2007).</li>
<li>Maherali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directly+reprogrammed+fibroblasts+show+global+epigenetic+remodeling+and+widespread+tissue+contribution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution.</a> Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).</li>
<li>Rodda, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+nanog+by+OCT4+and+SOX2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of nanog by OCT4 and SOX2.</a> J. Biol. Chem. 280, 24731-24737 (2005).</li>
<li>Schaniel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+short+hairpin+RNAs--triggers+of+gene+silencing--into+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Delivery of short hairpin RNAs--triggers of gene silencing--into mouse embryonic stem cells.</a> Nat. Methods. 3, 397-400 (2006).</li>
<li>Toyooka, Y., Shimosato, D., Murakami, K., Takahashi, K., Niwa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+subpopulations+in+undifferentiated+ES+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of subpopulations in undifferentiated ES cell culture.</a> Development. 135, 909-918 (2008).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El reportero de ensayo Oct4GiP que describimos arriba cuantitativamente se puede medir el grado de auto-renovación frente a la diferenciación. En comparación con otros métodos disponibles, tales como la morfología 12 basada en la proliferación y / ensayos de viabilidad basado, que ofrece una mayor sensibilidad y el rendimiento, así como una medición más directa del estado de células ES. Por tanto, se adapta bien a gran escala pantallas y análisis epistasis genética. De hecho, nosotros y otros han utilizado co...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> ESGRO de grado medio, y además de clonal </td><td> Millipore </td><td> SF001-500P </td></tr><tr><td> DMEM (glucosa alta 1X) </td><td> Invitrogen </td><td> 11965 </td></tr><tr><td> 0,25% de tripsina-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25200 </td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 1001817 </td></tr><tr><td> OPTI-MEM (reducir medio de suero) </td><td> Invitrogen </td><td> 31985 </td></tr><tr><td> ESGRO primer fondo (10 7 units/1ml) </td><td> Millipore </td><td> DAM1776540 </td></tr><tr><td> MEM AANE (no aminoácidos esenciales) </td><td> Invitrogen </td><td> 11140 </td></tr><tr><td> Nucleósidos 100X para células ES </td><td> Millipore </td><td> 10620-1 </td&gt; </tr><tr><td> 2-mercaptoetanol </td><td> Sigma </td><td> M7522-100 ml </td></tr><tr><td> ES-calificado de suero fetal bovino </td><td> Invitrogen </td><td> 10437 </td></tr><tr><td> Nanog siRNA </td><td> Invitrogen </td><td> MSS231181 </td></tr><tr><td> Oct4 siRNA </td><td> Dharmacon </td><td> D-046256-02 </td></tr><tr><td> Sox2 siRNA </td><td> Dharmacon </td><td> M-058.489-01 </td></tr></tbody></table> El control de siRNA: dúplex siRNA dirigidos a la luciferasa de luciérnaga (5&#39;-CGTACGCGGAATACTTCGA) sintetizados por Dharamcon.

oct4gip reportero de ensayo para estudiar los genes que regulan la de embriones de ratón con células madre de mantenimiento y auto-renovación

Oct4GiP Reporter Assay to Study Genes that Regulate Mouse Embryonic Stem Cell Maintenance and Self-renewal

Pluripotencia y auto-renovación son dos características que definen a las células madre embrionarias (células ES). Entender el mecanismo molecular subyacente facilitará en gran medida el uso de células madre embrionarias para los estudios de biología del desarrollo, modelos de enfermedades, descubrimiento de fármacos y Medicina Regenerativa (revisado en 1,2). Para agilizar la identificación y caracterización de nuevos reguladores de mantenimiento de células ES y auto-renovación, hemos desarrollado un reportero de fluorescencia de base de ensayo para medir cuantitativamente el estado de auto-renovación en células madre embrionarias de ratón usando las células Oct4GiP 3. Las células Oct4GiP expresar la proteína verde fluorescente (GFP) bajo el control de la región promotora del gen Oct4 4,5. Oct4 se requiere para células ES de auto-renovación, y es altamente expresado en células madre embrionarias y rápidamente regulado a la baja durante la diferenciación 6,7. Como resultado, la expresión de GFP y fluorescencia en las células informadoras se correlaciona fielmentecon la identidad de células ES 5, y activado por fluorescencia de células de clasificación (FACS) el análisis se puede utilizar para controlar estrechamente el estado de auto-renovación de las células en el nivel de células individuales 3,8. Junto con ARNi, el ensayo reportero Oct4GiP se puede utilizar para identificar rápidamente y estudiar los reguladores de mantenimiento de células ES y autorrenovación 3,8. En comparación con otros métodos para el ensayo de auto-renovación, es más conveniente, sensible, cuantitativa, y de menor coste. Puede llevarse a cabo en 96 - o placas de 384-bien para estudios a gran escala, tales como pantallas de alto rendimiento o de análisis de epistasis genética. Finalmente, mediante el uso de otros linaje específico reportero líneas de células ES, el ensayo se describe aquí también se puede modificar para estudiar especificación destino durante la diferenciación de células ES.

Se describe un reportero de ensayo de fluorescencia para identificar rápidamente y caracterizar los genes que regulan el mantenimiento de embriones de ratón con células madre y auto-renovación.

Oct4GiP reportero de ensayo para estudiar los genes que regulan la de embriones de ratón con células madre de mantenimiento y auto-renovación

La pluripotencia y la autorrenovación son dos características definitorias de las células madre embrionarias (células ES). Comprender el mecanismo molecular subyacente permitirá...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en determinar rápidamente el papel del gen de interés en el mantenimiento de la autorrenovación de las células madre embrionarias de ratón o células ES. Esto se logra primero ensamblando la mezcla maestra de transfección que se utilizará para silenciar los genes de interés. Como segundo paso.Se transfiere la mezcla maestra de transfección a una placa recubierta con gelatina y se añaden las células T 4G IP. Luego, las células se cultivan en condiciones normales de cultivo de células ES, permitiendo que se manifieste el efecto del silenciamiento génico. Tras cuatro días de cultivo, las células se desprenden de la placa y su estado de autorrenovación se determina mediante citometría de flujo. Finalmente, las diferencias en el porcentaje de células negativas para GFP entre las células T 4G IP transfectadas con siRNA de control y experimental pueden evaluarse mediante facts.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como el análisis de la morfología celular o de marcadores de linaje, es que ofrece una mayor sensibilidad y capacidad de procesamiento, por lo que resulta más adecuada para análisis genéticos a escala media o grande o para el análisis de epistasia genética. Este método puede facilitar en gran medida el estudio del gen importante para el mantenimiento y la autorrenovación del ESL. Asimismo, puede adaptarse a los eventos de especificación espontánea que ocurren durante la diferenciación del ESL.Las células T 4G IP se mantienen en placas recubiertas con gelatina. Se siembran a una densidad de aproximadamente dos veces 10 a la cuarta por centímetro cuadrado y se pasan cada dos o tres días para la transfección. En placas de 96 pocillos con fondo plano, comience por recubrir la placa con gelatina al 0,1 %, luego prepare la mezcla maestra de Optum y Lipectomy 2000 y reparta alícuotas en una placa de 96 pocillos con fondo redondo.Incube la placa durante cinco minutos a temperatura ambiente, luego agregue cinco picomoles de I a a la mezcla óptima de lípidos e incube durante otros 15 minutos. A continuación, elimine la gelatina de la placa de 96 pocillos con fondo plano y use una pipeta multicanal para transferir los complejos de lípidos i a en óptimo desde la placa de fondo redondo a las placas de fondo plano. Ahora, recoja las células OC 4G IP y resuspenda en medio M 15 fresco hasta alcanzar nueve veces 10 a la cuarta células por mililitro.Luego, utilice una pipeta multicanal para agregar 100 microlitros de la suspensión celular a cada pocillo de una placa de fondo plano de 96 pocillos; pipetee hacia arriba y hacia abajo de tres a cinco veces para mezclar la suspensión celular con el pre Eloqua. Sir, complejos de lípidos cambiando las puntas para diferentes sir a transfectar, luego coloque las placas en un incubador con 5% de dióxido de carbono a 37 grados Celsius y cultive las células durante cuatro días. Cada día del cultivo, utilice un aspirador multicanal para eliminar el medio viejo, teniendo cuidado de no rayar las células en el fondo de las placas.Luego, utilice una pipeta multicanal para alimentar las células con 100 microlitros de medio fresco para células ES cuatro días después de la transfección. Retire el medio utilizando un aspirador multicanal y enjuague las células una vez con 100 microlitros de PBS. A continuación, use una pipeta multicanal para añadir 25 microlitros de tripsina al 0,25 % a cada una.Incube bien las células durante cinco minutos a temperatura ambiente con agitación ocasional. Luego inspeccione visualmente la placa para asegurar la completa disociación de las células una vez que estas se hayan desprendido. Añada 90 microlitros de PBS con 10 %FBS para inactivar la tripsina, y aspire la solución celular hacia arriba y hacia abajo varias veces para disociar las células en una suspensión individual.Finalmente, utilice el modo de alto rendimiento en la unidad HTS de un analizador de fax para analizar 10 microlitros de la suspensión celular. Establezca el umbral de conteo en 1,0 veces 10 a la cuarta células y ajuste el voltaje del PMT para capturar las células en el gráfico de dispersión hacia adelante frente a dispersión lateral. Inicie la compuerta de análisis para la población de células viables en el gráfico de dispersión hacia adelante frente a dispersión lateral y luego cree un gráfico de histograma para el canal GFP.Configurar la compuerta en el canal GFP de manera que aproximadamente el 10 % de las células aparezcan como GFP negativas en las células transfectadas con SINA control o simuladas para determinar el porcentaje de células diferenciadas basado en el porcentaje de células GFP negativas. Para cada tratamiento, comparar el porcentaje de células diferenciadas entre los experimentales y los controles transfectados con irna.Esta primera figura muestra que las células de tipo silvestre E 14 TG 2A, representadas por el histograma negro, son negativas para GFP, mientras que las células T 4G IP, representadas por el histograma verde, son positivas para GFP cuando se mantienen como células ES en las siguientes dos figuras. En los gráficos de dispersión, se muestran los diagramas de dispersión hacia adelante frente a dispersión lateral y los histogramas del canal GFP de las células T 4G IP cuatro días después de la transfección con siARN de control o siARN T 4. Primero, se seleccionan las células vivas en el gráfico de dispersión hacia adelante frente a dispersión lateral, ya que las células muertas y los restos celulares son negativos para GFP y presentan un fondo aumentado, como se observa en los datos del histograma; en las células transfectadas con irna de control, la gran mayoría de las células son positivas para GFP.Estos gráficos de barras muestran el porcentaje de células diferenciadas a partir de nano OCT cuatro y SOX dos de control, células OCT 4G IP transfectadas con siRNA, cuatro días después de la transfección. En todos los casos, como se esperaba, las células transfectadas con siRNA mostraron niveles más altos de diferenciación que los controles. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse con una hora de trabajo manual por cada placa de 96 pocillos.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar el ensayo con el reportero GIP de Oxford para determinar rápidamente el papel de su gen de interés en el mantenimiento del ESL en ratón.

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Investigación

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Biology

Biología

Este video muestra el procedimiento para generar células madre pluripotentes inducidas mediante lentivirus inducible que expresan Oct4, Sox2, c-Myc y Klf4.

La generación de células iPS a partir de MEFs través de la expresión forzada de Sox-2, Oct-4, c-Myc y Klf4

El Inducible Stemgent Dox ratón TF Set Lentivirus puede reprogramar fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) de células madre pluripotentes inducidas (iPS) a las células. Aquí se demuestra el protocolo para la expresión de DOX-inducible de los factores de la transcripción del ratón reprogramación Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc para generar iPS colonias que expresan marcadores comunes MES pluripotencia.

Generación de células madre pluripotentes inducidas por reprogramación de fibroblastos embrionarios de ratón con un factor de transcripción Cuatro, doxiciclina inducible sistema de transducción de lentivirales

SC1 funciones a través de la inhibición dual de Ras-GAP y ERK1. Pusimos a prueba la función de SC1 en el apoyo de células ES de ratón de auto-renovación en la ausencia de LIF y demostró que SC1 es capaz de mantener la auto-renovación de los cultivos celulares de ratón ES.

El uso de SC1 (Pluripotin) para apoyar MESC auto-renovación en la ausencia de LIF

Este video muestra una técnica para evaluar la actividad del ácido retinoico en embriones de ratón. Al aislar las células de los embriones de ratón, las células se cocultivan con células reporteras de ácido retinoico (AR). Las células embrionarias producen AR, que induce la expresión de beta-galactosidasa en las células reporteras, lo que indica actividad de AR en las células embrionarias.

Empleo de células reporteras en un cocultivo para estudiar la producción de ácido retinoico por células embrionarias de ratón

Se necesita ensayo de expresión de un solo gen celular para comprender las heterogeneidades de células madre.

Perfiles de Células Madre Embrionarias Humanas individual por RT-PCR cuantitativa

En este estudio, generamos células madre pluripotentes inducidas a partir de células de líquido amniótico de ratón, utilizando un sistema de transposones no viral.

La producción de células madre pluripotentes a partir de células de ratón amniótico líquido mediante un sistema de transposón

Aquí, presentamos un protocolo cuantitativo y escalable para llevar a cabo pantallas de moléculas pequeñas dirigidas para los reguladores de quinasa de la transición pluripotente primitiva.

Un método simple para identificar quinasas que regulan la pluripotencia de las células madre embrionarias mediante la detección de inhibidores de alto rendimiento

Describimos en detalle dos protocolos basados en químicos para el cultivo de células madre embrionarias de ratón. Este nuevo método utiliza mecanismos sinérgicos de promover oxidación mediada por Tet (vitamina C) y reprimiendo la síntesis de novo de la 5-METILCITOSINA (por PD0325901) para mantener el hypomethylation de la DNA y pluripotencia de células madre embrionarias de ratón.

Un método de cultura alternativa para mantener la hipometilación genómica de células madre embrionarias del ratón usando MEK inhibidor PD0325901 y vitamina C

Este protocolo mide cuantitativamente la estabilidad y la vida media de ARN potenciadores intergénicos e intragénicos en células madre embrionarias de ratón mediante tratamiento con Actinomicina D, RT-qPCR y análisis de regresión no lineal. Se incorporan estrategias de normalización específicas por posición para modelar con precisión la dinámica de desintegración del ARNe de manera dependiente del contexto.

Evaluación cuantitativa optimizada de la estabilidad del ARN potenciador en células madre embrionarias de ratón

Este protocolo proporciona una canalización computacional optimizada para cuantificar las transcripciones de potenciadores nacientes. Al integrar la accesibilidad de la cromatina, la característica de la cromatina y los datos transcripcionales, permite una detección precisa y un análisis específico de la actividad potenciadora de la hebra en regiones intragénicas complejas, sin dejar de ser accesible para los investigadores sin una amplia formación en bioinformática.

Una canalización computacional para la cuantificación de ARN potenciador intergénico / intragénico en células madre embrionarias de ratón

Aprende a utilizar el ensayo reportero Oct4GiP para estudiar genes que regulan el mantenimiento y auto-renovación de células madre embrionarias de ratón mediante silenciamiento génico y citometría de flujo.

Oct4GiP reportero de ensayo para estudiar los genes que regulan la de embriones de ratón con células madre de mantenimiento y auto-renovación (Video) | JoVE Journal

Oct4GiP reportero de ensayo para estudiar los genes que regulan la de embriones de ratón con células madre de mantenimiento y auto-renovación

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