La detección de ARN viral por fluorescencia In situ La hibridación (FISH)

El objetivo general de este procedimiento es visualizar la ubicación del ARN viral en C dos dentro de las células. Para lograr esto primero, cultive las células que serán transfectadas o infectadas en cubreobjetos de vidrio. El segundo paso es fijar las células con aldehído paraformado al 4% después de una transfección o infección exitosa.

A continuación, incuba las células con una mezcla de hibridación que marque el ARN. Esto se hace colocando la celda deslizante de la cubierta hacia abajo sobre la mezcla de hibridación en un portaobjetos. El paso final de este procedimiento es utilizar anticuerpos para teñir las células para la etiqueta de ARN.

En última instancia, la localización del ARN marcado dentro de la célula se visualiza por fluorescencia en hibridación C dos o fish. La principal ventaja de esta técnica sobre otros métodos, como la obtención de imágenes de ARN y las células vivas mediante etiquetas, es que se puede detectar el ARN nativo en lugar del ARN modificado. Por lo general, las personas nuevas en esta técnica tendrán dificultades porque requiere pacientes en el cuidado y manejo de cubreobjetos, estandarización del método, así como un tiempo preciso.

Durante las incubaciones, el procedimiento específico para el cultivo de células para su fijación dependerá del tipo de células. En el caso de las células adherentes, inicialmente es importante sembrarlas en cubreobjetos de vidrio estéril sin tratar. Por lo tanto, la coincidencia final en la cosecha es de aproximadamente 70 a 80%: las células no adherentes deben cultivarse de la manera estándar hasta que estén listas para ser recolectadas.

A continuación, incubarlos con cubreobjetos que hayan sido tratados con poli L lisina para obtener una placa de cultivo de tejido de poliestireno típica de 12 pocillos, placa de 150.000 células por pocillo 24 horas antes de la infección o transfección. Incube las células en los labios de cubierta durante una hora a 37 grados centígrados para comenzar el procedimiento de fijación celular. Deseche el medio mediante una aspiración cuidadosa y agregue suavemente un agua preparada y doblemente destilada XPBS.

O DPBS lava las células durante un minuto. También se puede utilizar Dathyl pyro CARBATE o DEPC tratado con un XPBS. No use PBS sin tratar, ya que puede contener enzimas R nase.

Deseche el DPBS y agregue suavemente suficiente. 4%para formaldehído para cubrir completamente las células incube durante 15 a 20 minutos, después de eso, deseche el paraldehído y lave las células con DPBS durante un minuto. Deseche el DPBS y agregue glicina 0.1 molar incubado durante 10 minutos.

A continuación, deseche la glicina y lave las células con DPBS durante un minuto. Después de desechar el DPBS, agregue 0.2%Triton X 100, incube durante cinco a 10 minutos. Si la tinción de proteínas de la envoltura nucleolar o nuclear, perme con tritón X 100 durante no más de cinco minutos o la localización de la proteína se volverá difusa.

Deseche el tritón X 100 y lávese dos veces en DPBS durante un minuto cada vez antes de comenzar el procedimiento para los peces. Prepare los lados sobre los que incubar la cubierta Slips teniendo cuidado de limpiarlos y etiquetarlos bien. Para un cubreobjetos de 18 milímetros, agregue 50 microlitros de solución de ADN al portaobjetos.

El aspecto más difícil de este procedimiento es el manejo adecuado de los cubreobjetos. Es importante asegurarse de incubar el lado derecho del cubreobjetos y manipularlos con cuidado. Para evitar roturas, agregue el cubreobjetos al portaobjetos, asegurándose de colocarlo con la celda hacia abajo e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de 15 minutos, coloque los cubreobjetos con el lado de venta hacia arriba en una placa de cultivo con un X-D-P-B-S.

Lave los cubreobjetos durante un minuto. Esta mezcla contiene lo siguiente. 50% forma desionizada amida un miligramo por mililitro, TRNA dos X-S-S-P-E cinco X dnar RNAs sonda de salida y agua DEPC hasta un volumen final de 50 microlitros.

La sonda es una sonda de ARN marcada con dig genin diseñada para ser complementaria al ARN genómico viral. Lugar. Cada cubierta desliza la celda hacia abajo sobre la mezcla de hibridación en el portaobjetos. La incubación debe realizarse en una bandeja que contenga un 50% FIDE dos X-S-S-P-E.

Mezclar la incubación durante 16 a 18 horas a 42 grados centígrados. A continuación, incube la celda deslizante con la tapa hacia abajo en 50 microlitros de 50% fide durante 50 minutos a 42 grados centígrados. Lave los cubreobjetos dos veces en dos X-S-S-P-E incubándolos boca abajo en 50 microlitros de dos X-S-S-P-E durante cinco minutos cada uno a 42 grados centígrados.

Por último, lave los cubreobjetos en un X-D-P-P-S durante un minuto. Para comenzar este procedimiento, bloquee los cubreobjetos colocando el lado de la celda hacia abajo en 50 microlitros de una solución de bloqueo X Roche durante 30 minutos a temperatura ambiente cuando se complete el bloqueo, coloque cada cubreobjetos con el lado de la celda hacia abajo en 50 microlitros de una solución de anticuerpo primario que contenga todos los anticuerpos primarios para el experimento en sus concentraciones adecuadas. Incubar durante una hora a 37 grados centígrados después de una hora.

Coloque la celda de la cubierta con el lado hacia arriba en una placa de cultivo que contenga DPPS y lave las hojas de cubierta durante 10 minutos. A continuación, pipetee 50 microlitros de solución de anticuerpos secundarios en un portaobjetos para cada cubreobjetos. Los anticuerpos conjugados en el suelo de Alexa se pueden usar para generar una gama de colores y se usan en una dilución de uno a 500 en una solución de bloqueo x y una X-D-P-B-S Coloque cada celda de deslizamiento hacia abajo en la solución de anticuerpos secundaria e incube durante una hora a 37 grados.

Lave los cubreobjetos dos veces durante 10 minutos cada uno. En DPBS seco, la cubierta se desliza con el lado de la celda hacia arriba sobre un trozo de papel secante. Asegúrese de cubrir los cubreobjetos para evitar la exposición a la luz y el blanqueo.

Una vez que todo el líquido se haya evaporado, monte los cubreobjetos en portaobjetos nuevos. Usando ocho microlitros de montura inmunológica, golpee suavemente el cubreobjetos para eliminar las burbujas de aire, aplique esmalte de uñas en los bordes del cubreobjetos para asegurarlo en su lugar. La visualización de ARN y proteínas mediante técnicas de microscopía también es fundamental para el éxito de este procedimiento.

Los ajustes del microscopio utilizado pueden ayudar o dificultar la visualización. Por lo tanto, es clave que los ajustes del microscopio se establezcan correctamente y sean consistentes de una muestra a otra en un experimento determinado. En esta figura se ilustra un resultado representativo de la visualización del ARN viral por peces y de la localización de proteínas por inmunofluorescencia.

En este primer panel en el que las células hela se transfectan con el VIH uno, el ARN viral del VIH uno atraído en verde se ve en todo el citoplasma mostrado de forma difusa en su mayor parte, aunque no es raro que las pequeñas puntas citoplasmáticas sean infrecuentes, la especificidad se puede ver comparando las células positivas con las células circundantes que no muestran fluorescencia, como lo ilustra la imagen insertada en blanco y negro que representa solo la tinción de ARN viral. La tinción roja refleja la inmunofluorescencia de la proteína de unión de tres dominios Ross GA PSH o G tres pb, que marca principalmente el citoplasma cuando las células helo se transfectan con VIH uno que carece de la proteína rev reguladora. El ARN viral producido se retiene en el núcleo.

Esto se puede visualizar como una señal verde brillante en el núcleo y una falta de señal fluorescente de ARN en el citoplasma. La distribución del ARN viral del VIH también puede verse alterada por la sobreexpresión de ciertas proteínas celulares. Por ejemplo, la sobreexpresión de la proteína lisosomal que interactúa con RAB siete o proteína real A involucrada en el tráfico de vesículas endosomales conduce a la relocalización del ARN genómico viral rastreado en verde al centro de organización microtubárica.

Aquí, los endosomas se marcan con la lámpara uno y se tiñen de rojo. Por el contrario, la sobreexpresión de un amino delta N delecionado terminalmente que es incapaz de unirse a P uno 50 pegado del complejo motor dine dispersa los endosomas tardíos dentro del citoplasma y la sobreexpresión de P 50 dyin bloquea la subunidad grande del motor dine y libera endosomas tardíos, pero también el ARN genómico viral y las proteínas estructurales del VIH V uno a la periferia celular. Cuando el VIH uno se expresa en células helo y luego las células se recolectan y analizan en diferentes puntos de tiempo, el ARN viral aparece en la célula tan pronto como tres horas después de la transfección y la infección y se vuelve fácilmente observable por esta técnica de peces a las 12 horas.

Aquí, la expresión de ARN viral se rastrea en verde, mientras que la proteína celular H-N-R-N-P-A uno se tiñe en rojo Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 20 minutos el primer día y cuatro horas y media el segundo día si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe manipular los cubreobjetos con delicadeza para evitar romperlos y asegurarse de evitar la luz una vez que se haya aplicado el anticuerpo secundario. No olvide que cuando se trabaja con el VIH V uno y cualquier otro patógeno de nivel superior, es extremadamente peligroso antes de la fijación y siempre se deben tomar precauciones como la capacitación y la contención adecuadas mientras se realiza este procedimiento.