Name: La detección de ARN viral por fluorescencia In situ La hibridación (FISH) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Aprende a detectar ARN viral mediante hibridación in situ por fluorescencia (FISH) en células infectadas. Este protocolo permite visualizar la localización del ARN genómico viral y comprender mejor los mecanismos de infección.

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Los autores agradecen a los miembros anteriores y actuales del laboratorio para las contribuciones al desarrollo de la metodología descrita aquí y Alan Cochrane para el consejo. LA es un receptor de un Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR) Becas de Doctorado y AJM con el apoyo de un premio a la Trayectoria Fraser, Monat y MacPherson. Este trabajo es apoyado por una beca de la CIHR (subvención # RP-56974).

1. Preparación de la sonda <ol><li> Compendio 1 ug del vector en la transcripción in vitro, pKS (+) pol 236nt 9 con Kpn1 enzima a 37 ° C durante 1 hora y ejecutar el producto de ADN linealizado en un gel de agarosa. El fragmento debe ser de aproximadamente 2500 pb. </li><li> Cortar el fragmento del gel y se purifica mediante la Roche Micro Eluir kit de extracción de gel (todos los reactivos utilizados se enumeran en la Tabla 1). Lleve a cabo la elución final en 30 l de tampón de elución. Ejecutar 5 l del producto en un gel de agarosa para comprobar la purificación. </li><li> Mezcle una reacción de transcripción in vitro (ver receta a continuación) utilizando la Roche DIG RNA kit de etiquetado y se incuba a 37 ° C durante 2 horas. </li></ol> En la reacción de transcripción in vitro: <table border="1"><tbody><tr><td> Linealizado ADN </td><td> 23 l </td></tr><tr><td> 1X DIG RNA etiquetado mezcla (Roche) </td><td> 4 l </td></tr><tr><td> 1X Transcription tampón </td><td> 8 l </td></tr><tr><td> 20U RNasa OUT </td><td> 1 l </td></tr><tr><td> 80U T7 ARN polimerasa </td><td> 4 l </td></tr><tr><td> Total </td><td> 40 l </td></tr></tbody></table><ol start="4"><li> Añadir 228 U de DNasa I y se incuba a 37 ° C durante 15 min. </li><li> Se detiene la reacción por adición de EDTA pH 8,0 a una concentración final de 20 mM. </li><li> Purificar la reacción mediante el uso de las columnas vuelta rápida de Roche como se especifica por el fabricante. </li><li> Purificar la sonda por precipitación con tratada con DEPC 1/10 volúmenes de pH 3M de NaOAc 5,2 y 2,5 volúmenes de etanol helado 95%. Mezclar e incubar a -80 ° C durante 30 min a una noche. </li><li> Centrifugar la sonda durante 15 min a 4 ° C a 15.000 x g. </li><li> Eliminar el sobrenadante y lavar el precipitado en etanol helado al 70%. Se centrifuga de nuevo durante 5 min a 4 ° C a 15.000 x g. </li><li> Eliminar el sobrenadante y secar el precipitado. Resuspender el precipitado en 50 ul water (DNasa / RNasa libre) que contiene 10 U RNasa Invitrogen OUT. </li><li> Calcular la concentración de la sonda por espectrofotometría (ARN miden a 260 nm), y se diluye hasta una concentración de ng / l 5. Almacenar en alícuotas a -20 ° C para uso a corto plazo, o de -80 ° C para almacenamiento a largo plazo. Se recomienda llevar a cabo las comparaciones inter-ensayo para la conservación de una parte alícuota de este. </li></ol> 2. La fijación de la célula <ol><li> Es importante inicialmente a las células adherentes de semillas sin tratar, sobre cubreobjetos de vidrio estériles para la confluencia final sobre la cosecha es de aproximadamente 70-80%. Para las células no adherentes, crecen de forma normal y cuando esté listo para recoger, los incuban con cubreobjetos que han sido tratados con w / v 0,01% de poli-L-lisina (Sigma-Aldrich, Inc.) durante 1 hora. Para un típico 12-así placa de poliestireno de cultivo de tejidos (3,8 cm 2), 150.000 células HeLa (por ejemplo) se sembraron en placas a 24 horas antes de la transfección. Las células no adherentes pueden ser infectadas o transfectadas como es habitual y se dejó anuncioaquí para cubreobjetos de vidrio antes de la fijación 3. </li><li> Desechar los medios de comunicación y lavar las células con solución salina tamponada con fosfato 1X preparada en agua doblemente destilada (DPBS) durante 1 min. Dietilpirocarbonato (DEPC, Sigma-Aldrich, Inc.)-tratado 1X PBS también se pueden utilizar, sin embargo no tratada PBS no puede ya que puede contener enzimas RNasa. </li><li> Descartar el PBS y añadir un 4% de paraformaldehído, suficiente para cubrir completamente las células. Incubar durante 15-20 min. </li><li> Deseche el paraformaldeyhyde y lavar las células con 1X DPBS durante 1 min. </li><li> Desechar los DPBS y añadir 0,1 M glicina (disuelto en 1X DPBS). Incubar durante 10 min. </li><li> Deseche la glicina y lavar las células con 1X DPBS durante 1 min. </li><li> Deseche los DPBS y añadir 0,2% de Triton-X (disuelto en 1X DPBS). Incubar durante 5-10 minutos. Si la tinción de proteínas de la envoltura nucleolares o nuclear, permeabilizar con Triton X-100 por no más de 5 min o la localización de la proteína se convertirá difusa. </li><li> Desechar Triton X-100 y se lava una vez en1X DPBS durante 1 min. </li><li> Para almacenamiento a largo plazo, sustituir PBS con 70% de etanol y se almacena a 4 ° C durante un máximo de cuatro meses. Por otra parte, se lava una vez más con 1X DPBS y proceder a pescar. </li></ol> 3. Hibridación in situ fluorescente (FISH) <ol><li> Si los cubreobjetos fueron almacenadas en etanol, sustituir el etanol con 1X DPBS y permitir que las células para rehidratar durante 30 min. La rehidratación se puede hacer durante la noche si los cubreobjetos se almacenan a 4 ° C. </li><li> Lavar los cubres con 1x DPBS durante 1 min. </li><li> Prepare las diapositivas para la incubación de los cubreobjetos, teniendo cuidado de limpiar y marcar bien. </li><li> Para un cubreobjetos de 18 mm, se añaden 50 l de solución de DNasa (25 unidades cubreobjetos, comercialmente disponibles) a la diapositiva. Añadir el cubreobjetos, asegurándose de poner de lado las células hacia abajo, y se incuba durante 15 min a temperatura ambiente. </li><li> Lavar los cubres con 1x DPBS durante 1 min. </li><li> Añadir 50 l de mezcla de hibridación (ver receta a continuación) por cubreobjetos enun portaobjetos y se incuba el lado de células cubreobjetos fuera de servicio por 16-18 horas a 42 ° C. La incubación se debe realizar en una bandeja que contiene un 50% formamida, 2X SSPE mezcla (12,5 ml de formamida desionizada, 2,5 ml de 20X SSPE, 10 ml de agua). </li></ol> Mezcla de hibridación (para un cubreobjetos, 50 l): <table border="1"><tbody><tr><td> Cantidad de material </td><td> El material (a una concentración final) </td></tr><tr><td> 25 l </td><td> Formamida,% 50 (desionizada; cualquier fuente) </td></tr><tr><td> 5 l (de 10 mg / ml) </td><td> ARNt, 1 mg / ml (Sigma-Aldrich, Inc.) </td></tr><tr><td> 5 l (de 20X) </td><td> SSPE, 2X </td></tr><tr><td> 5 l (de 50X) </td><td> Denharts, 5X </td></tr><tr><td> 0,125 l (de 5 unidades) </td><td> RNasa OUT </td></tr><tr><td> 5 l (25 ng de 5 ng / l) </td><td> Sonda </td></tr><tr><td> 5 l </td><td> H 2 O DEPC, a la finalvolumen de 50 l </td></tr></tbody></table><ol start="7"><li> Incubar cubreobjetos lado de células en 50 l de formamida al 50% (diluida en 1X DPBS) durante 15 min a 42 ° C. </li><li> Lavar dos veces los cubreobjetos en 2X SSPE, mediante su incubación lado celda hacia abajo en 50 l SSPE 2X (20X SSPE diluida en 1X DPBS) durante 5 minutos cada uno a 42 ° C. </li><li> Lavar los cubreobjetos en 1X DPBS durante 1 min. </li></ol> 4. La tinción de inmunofluorescencia <ol><li> Bloque los cubreobjetos colocándolos lado de células en 50 l solución 1X Roche bloqueo (10X solución Roche bloqueo diluida en 1X DPBS) durante 30 min. </li><li> Incubar el lado de células cubreobjetos en 50 l solución anticuerpo primario durante 1 hora a 37 ° C. Anti-DIG anticuerpos debe diluirse de acuerdo a la dirección del fabricante en 1X solución de bloqueo. Si otros anticuerpos se utilizan para teñir las proteínas, se pueden añadir a la concentración correcta siempre que todos los anticuerpos utilizados se derivan de especificación host diferenteIES. </li><li> Lavar los cubreobjetos durante 10 minutos en 1X DPBS. </li><li> Incubar el lado de células cubreobjetos en 50 l solución anticuerpo secundario durante 1 hora a 37 ° C. Alexa Fluor-anticuerpos conjugados (Invitrogen) se puede utilizar para generar una gama de colores y se utilizan en 1:500 en 1X solución de bloqueo, DPBS 1X. </li><li> Lavar los cubreobjetos dos veces durante 10 minutos cada uno en DPBS 1X. </li><li> Seque el lado de la célula cubreobjetos en papel Whatman. Asegúrese de cubrir los cubreobjetos para evitar la exposición a la luz y la decoloración. </li><li> Una vez que todo el líquido se evapora, montar los cubreobjetos sobre portaobjetos utilizando frescos 8 ImmunoMount l (Thermo Scientific, Inc.). Golpee suavemente el cubreobjetos abajo para eliminar cualquier burbuja de aire. </li><li> Aplicar esmalte de uñas a los bordes del cubreobjetos para asegurarla en su lugar. </li><li> La visualización de ARN y proteínas por técnicas de microscopía es también crítica para el éxito de esta técnica. Ajustes en el microscopio usado pueden ayudar o dificultar la visualización por lo que es clave que elajustes en el microscopio se establece correctamente y ser coherente con una muestra a otra en un experimento dado. Para los ajustes detallados de microscopía, la óptica y las combinaciones de anticuerpos por favor, vea las referencias 1,10. </li></ol> 5. Los resultados representativos Un ejemplo de virus ARN de tinción se puede ver en la Figura 2. El ARN viral del VIH-1 se ve en todo el citoplasma muestra difusamente en su mayor parte, aunque punctae citoplasmática pequeña no son infrecuentes. La especificidad puede verse comparando las células positivas a las células circundantes que muestran ninguna fluorescencia. Como se mencionó en la introducción, el VIH-1 que carece de la proteína reguladora Rev produce ARN que se mantengan en el núcleo: esto puede ser visualizado como una señal luminosa en el núcleo, y una falta de ARN señal de fluorescencia en el citoplasma. La sobreexpresión de proteínas celulares también es capaz de cambiar la distribución de los ARN virales de VIH-1. En la Figura 2 </strong&gt;, la sobreexpresión de las proteínas implicadas en el tráfico de vesículas endosomal (por ejemplo, la interacción Rab7-lisosomal de proteínas (RILP) 11 o N-terminal suprimido RILP (RILPN) 11, y las proteínas que interfieren con la función motora dineína [por ejemplo, p50/dynamitin 1, 12], interferir con la normal de estado estacionario localización del RNA genómico viral como se determina por análisis de FISH expresión RILP conduce a re-localización del RNA genómico viral a los microtúbulos organización central (COMT) 13;. RILPN dispersa tarde endosomas dentro del citoplasma debido a la incapacidad para unirse a p150 encolada del complejo dineína motor 14 y los bloques p50/dynamitin la subunidad grande de dineína motor y comunicados finales endosomas sino también el RNA genómico viral del VIH-1 y proteínas estructurales de la periferia de la célula 1 (Figura 2). La manipulación de la localización de estado estable del RNA genómico viral, un elemento clave para la capacidad de infección departículas del virus, sería la clave para el futuro desarrollo de la terapéutica. En nuestras manos, el ARN viral aparece en la celda tan pronto como 3 horas después de la transfección y la infección 10 y se convierte fácilmente observable por esta técnica de FISH por 12 horas. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4002/4002fig1.jpg" /> Figura 1. Diagrama de flujo del protocolo de FISH / si los compañeros de análisis. Las células se cultivaron en cubreobjetos y se fijaron con paraformaldehído. Los tratamientos de glicina y Triton X-se realizan antes de que las células son o bien utilizarse para FISH / SI o almacenado en etanol al 70% para el almacenamiento. Las células deshidratadas para el almacenamiento se rehidratan en 1X DPBS (tratada con DEPC PBS) antes de continuar con FISH / SI. Las células son tratadas con DNasa I y dejó durante la noche para hibridar con la sonda. Una vez que la hibridación es completa, las células se lavan con formamida, así como con SSPE, y un enjuague final de 1X DPBS. Solución de bloqueo se aplica a las células, seguido de incubación conlos anticuerpos primarios. Después del lavado, los anticuerpos secundarios se aplican. Dos lavados finales en 1X DPBS completar el procedimiento de tinción, donde a los cubreobjetos se secan y se montaron en portaobjetos para la imagen. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4002/4002fig2.jpg" /> Figura 2. Los resultados representativos mediante FISH / SI co-análisis. A) del VIH-1 se transfectaron en células HeLa y en algunos casos con construcciones que causan la sobreexpresión de proteínas celulares (RILP, p50/Dynamitin y RILPΔN (una supresión amino-terminal mutante)) . PESCADO / si los compañeros de análisis se llevó a cabo: el ARN se identifica en verde, ya sea con o G3BP LÁMPARA1 (rojo) para diferenciar. B) El VIH-1 se expresa en células HeLa y se recoge en diferentes puntos temporales. La expresión del ARN viral se sigue en verde, mientras que la proteína celular, hnRNP A1, se tiñe de rojo. Barras de tamaño son 10 micras. Imágenes modificadas de las referencias 1 (figuras selectas de grupo A; RILP, p50/Dynamitin y deltana RILP)y 17 (panel B).

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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

PESCADO / si los compañeros de análisis es un método confiable para visualizar el ARN viral en las células que ahora se ha ido perfeccionando 9,15,16. En el transcurso de varios años, hemos desarrollado un método perfeccionado de la tinción de ARN. Esta técnica se puede utilizar en una amplia gama de tipos de células siempre que la sonda es específica para la diana de ARN 17. En el etiquetado de la sonda con DIG, somos capaces de visualizar el ARN mediante tinción simple. Cuando la tinción de ARN y las proteínas se combinan otras, FISH / si los compañeros de los análisis de convertirse en una poderosa herramienta para observar las estructuras celulares y localización de la proteína / RNA. La especificidad de la detección de RNA es bastante alta. Esto se ilustra en la Figura 2. En algunas de la obra original que se centró en la localización del ARN genómico viral, FISH estableció que la falta de Rev atrapado ARN viral en el núcleo 18. Dado esto, la información abundante nuevo en genómica localización del ARN viral se ha obtenido mediante el Technique indica aquí. Por sobreexpresan proteínas celulares, las poblaciones de específicas y no todo-del ARN viral puede ser obligado a localizar a las diferentes regiones de la célula. Sobreexpresión RILP, que se asemeja al fenotipo obtenido cuando hnRNP A2 se agote por siRNA en VIH-1-células que expresan 13, hace que el ARN para acumular visiblemente en el COMT. El RNA genómico viral puede ser empujada a la periferia de la célula mediante la desactivación de la proteína motora menos extremo, dineína: la sobreexpresión p50/Dynamitin o una caída de las cadenas pesadas de dineína 1 da como resultado la liberación de ARN genómico del virus de dominios intracelulares a la periferia celular ( Figura 2). Un mutante de RILP, RILPΔN, que ya no se une el motor dineína, se dispersa endosomas (marcados por LÁMPARA1) en el citoplasma, ya que ya no se activa localizada en dominios juxtanuclear. Estos resultados apuntan a la noción de una población de plástico de VIH-1 RNA genómico y, en particular, de que grupos diferentes de VIH-1 genómicoARN existen con roles a veces identificables en el ciclo de replicación viral. Estas mismas ideas ya han sido identificados para la proteína codificada por este ARNm, Gag 19. Existen limitaciones en los usos de FISH / si los compañeros de los análisis que están relacionados con la elección de anticuerpos y disponibilidad. La optimización de la mejor combinación de anticuerpos primarios y secundarios, y sus concentraciones, se necesitará tiempo para optimizar (ver Tabla 1 y 2). Anticuerpos producidos a partir de hibridomas o producidos por las grandes empresas pueden tener concentraciones que varían según el lugar de 1:2 a 1:2000, pero asegúrese de seguir las directrices proporcionadas por el fabricante para obtener mejores resultados. El huésped en la que se produce el anticuerpo también debe tomarse en consideración. Ovejas de mezcla con anticuerpos de cabra también se debe evitar en anticuerpos primarios y secundarios en esta combinación resulta en un fondo elevado debido a la cruzada de especies de reconocimiento (datos no mostrados). Para Alexa-Fluor secondary anticuerpos, la concentración puede ser utilizado en 1:500 para casi cualquier anticuerpo en el conjunto. El otro inconveniente con FISH / si los compañeros de análisis como se describe en este informe es que captura el ARN en su ubicación en el estado estacionario, después que las células han sido fijados con paraformaldehído y permeabilized y detergente (figura 1). Sin embargo, el ARN de imágenes en células vivas que se ha logrado a través de una variedad de medios de 20 a 22, en su mayoría utilizando variaciones de genomas virales de ARN que son marcadas por las proteínas fluorescentes, tales como las buenas prácticas agrarias. Sin embargo, medios adicionales para identificar la localización del ARN en células vivas siguen a la superficie. Estos nuevos métodos implican el ARN marcado por medio de la espinaca 23, 24, o SNAP mTrip 2. Estas técnicas también sufren de algunos inconvenientes, incluyendo el requisito para permeabilizar las células antes de la adición de sustratos o un resto que debe ser diseñado para etiquetar el ARNm con el fin de detectar el ARNm por microscopía. De hecho, la mayor Advantage de análisis FISH descritas en este informe reside en el hecho de que el ARN es inalterado nativo que conduce a los resultados más fisiológicamente relevantes.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Cubreobjetos de 18 mm </td><td> VWR </td><td> 48380 046 </td><td></td></tr><tr><td> 16% de paraformaldehído </td><td> JT Baker </td><td> S898-07 </td><td> Para hacer 4%: disolver 20 g en 500 ml 1XDPBS a 60 ° C con 5 gotas de NaOH. el pH a 7,2 el calor y almacenar a -20 ° C. No exceder los 70 ° C! </td></tr><tr><td> Triton X- </td><td> OmniPur </td><td> 9400 </td><td></td></tr><tr><td> Micro Eluir Gel Extraction Kit </td><td> Roche </td><td> D6294-02 </td><td></td></tr><tr><td> DIG RNA Etiquetado Mix </td><td> Roche </td><td> 11277073910 </td><td></td></tr><tr><td> Transcripción T7 ARN polimerasa </td><td> Invitrogen </td><td> 18033-019 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Columnas Un paseo rápido </td><td> Roche </td><td> 11814427001 </td><td></td></tr><tr><td> DNasa I </td><td> Invitrogen </td><td> 18047-019 </td><td></td></tr><tr><td> 1X DPBS </td><td> Gibco </td><td> 14190-250 </td><td></td></tr><tr><td> Formamida </td><td> EMD </td><td> FX0420-8 </td><td></td></tr><tr><td> tRNA </td><td> Invitrogen </td><td> 15401-021 </td><td></td></tr><tr><td> RNasa OUT </td><td> Invitrogen </td><td> 10777-019 </td><td></td></tr><tr><td> Anticuerpos fluorescentes Enhancer Set para la detección DIG # 4 (solución de bloqueo) </td><td> Roche </td><td> 1768506 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor secundaria de anticuerpos </td><td> Invitrogen </td><td> Ver Tabla 2 </td><td></td></tr><tr><td> Horno de hibridación </td><td> Boekel Cienciacientífica </td><td> Modelo 24100 </td><td></td></tr><tr><td> Portaobjetos </td><td> VWR </td><td> 48300-047 </td><td></td></tr><tr><td> Immunomount </td><td> Thermoscientific </td><td> 9990402 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 1. Identificación de los reactivos específicos y equipos <table border="1"><tbody><tr><td> Las especies de anticuerpos anti-DIG (dilución, empresa, número de catálogo) </td><td> Colores </td><td> Alexa Fluor usada (1:500) </td></tr><tr><td rowspan="3"> Ratón (1:500; Sigma, B7405) </td><td> verde </td><td> Alexa Fluor 488 burro anti-ratón (Invitrogen, A21202) </td></tr><tr><td> rojo </td><td> Alexa Fluor 594 burro anti-ratón (Invitrogen, A21203) </td></tr><tr><td> azul </td><td> Alexa Fluor 647 burro anti-ratón (Invitrogen, A31571) </td></tr><tr><td rowspan="3"> Ovejas (1:200; Roche, 11376623) </td><td> verde </td><td> Alexa Fluor 488 burro anti-oveja (Invitrogen, A11015) </td></tr><tr><td> rojo </td><td> Alexa Fluor 594 burro anti-oveja (Invitrogen, A11016) </td></tr><tr><td> azul </td><td> Alexa Fluor 647 burro anti-oveja (Invitrogen, A21448) </td></tr></tbody></table> Combinaciones Tabla 2. De secundaria de anticuerpos y anti-DIG lista con números de catálogo y de las concentraciones.

la detección de arn viral por fluorescencia<em&gt; in situ</em&gt; la hibridación (fish)

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Los virus que infectan a las células provocan cambios específicos en las funciones celulares normales que sirven para desviar la energía y los recursos para la replicación viral. Muchos aspectos de la función de la célula huésped se comandado por virus, por lo general por la expresión de productos génicos virales que reclutan proteínas de la célula huésped y maquinarias. Por otra parte, los virus orgánulos de membrana específicos de ingeniería o una etiqueta en que las vesículas celulares y las proteínas motoras para apuntar las regiones de la célula (durante la infección de novo, virus cooptar las proteínas motoras moleculares para atacar el núcleo, más tarde, durante el ensamblaje del virus, se secuestran celulares mecanismos que ayuden en el montaje de los virus). Menos aún se entiende sobre cómo los virus, en particular los que tienen genomas de ARN, coordinar el tráfico intracelular de proteínas y componentes de ARN y cómo lograr el montaje de partículas infecciosas en loci específicos en la célula. El estudio de la localización del ARN se inició en el trabajo anterior. El desarrollo de bajos em eucariotasbryos y las células neuronales proporcionan información biológica importante, y también subrayó la importancia de la localización del ARN en la programación de las cascadas de expresión génica. El estudio en otros organismos y sistemas celulares ha generado información importante similar. Los virus son parásitos obligados y deben utilizar sus células huésped para replicarse. Así, es crítico para comprender cómo los virus de ARN dirigir sus genomas de ARN a partir del núcleo, a través del poro nuclear, a través del citoplasma y en uno de sus destinos finales, en partículas de virus progenie 1. FISH sirve como una herramienta útil para identificar los cambios en el estado de equilibrio de localización del ARN viral. Cuando se combina con inmunofluorescencia (IF) el análisis de 22 de FISH / si los compañeros de análisis proporcionará información sobre la co-localización de las proteínas con el ARN viral 3. Este análisis proporciona por tanto un buen punto de partida para poner a prueba para las interacciones proteína-ARN por bioquímicos o biofísicos4,5, ya que las pruebas de co-localización por sí sola no es suficiente evidencia para estar seguro de una interacción. En el estudio de localización del ARN viral utilizando un método como este, abundante información ha sido obtenida en los dos eventos de tráfico de ARN virales y celulares 6. Por ejemplo, el VIH-1 produce ARN en el núcleo de las células infectadas pero el ARN se traduce sólo en el citoplasma. Cuando una proteína viral clave falta (Ap) 7, FISH del ARN viral, ha revelado que el bloque de la replicación viral se debe a la retención de los VIH-1 RNA genómico en el núcleo 8. A continuación, presentamos el método para el análisis visual de ARN genómico del virus in situ. El método hace uso de una sonda marcada con ARN. Esta sonda está diseñado para ser complementario al ARN genómico viral. Durante la síntesis in vitro de la sonda de ARN antisentido, la ribonucleótido que se modifica con digoxigenina (DIG) está incluido en un in vitro transcription reacción. Una vez que la sonda ha hibridado con el objetivo de ARNm en las células, las etapas subsiguientes de etiquetado de anticuerpos (Figura 1) revelará la localización del mRNA, así como proteínas de interés cuando se realiza PESCADO / SI.

Un fluorescencia<em&gt; In situ</emLa hibridación&gt; (FISH) método fue desarrollado para detectar visualmente ARN genómico del virus utilizando microscopía de fluorescencia. Una sonda se hace con especificidad para el ARN viral que luego pueden ser identificados utilizando una combinación de hibridación y técnicas de inmunofluorescencia. Esta técnica ofrece la ventaja de identificar la localización del ARN viral o ADN en estado estacionario, el suministro de información sobre el control de eventos intracelulares de virus trata de personas.

La detección de ARN viral por fluorescencia<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación (FISH)

Los virus que infectan las células provocan cambios específicos en las funciones celulares normales, los cuales sirven para desviar la energía y los recursos hacia la replicación viral. Muchos...

El objetivo general de este procedimiento es visualizar la ubicación del ARN viral en C dos dentro de las células. Para lograrlo, primero cultive las células que serán transfectadas o infectadas sobre cubreobjetos de vidrio. El segundo paso consiste en fijar las células con paraformaldehído al 4 % tras una transfección o infección exitosa.A continuación, incube las células con una mezcla de hibridación que marque el ARN. Esto se realiza colocando la cubreobjetos con el lado celular hacia abajo sobre la mezcla de hibridación en un portaobjetos. El paso final en este procedimiento consiste en utilizar anticuerpos para teñir las células y detectar la marca del ARN.Finalmente, la localización del ARN marcado dentro de la célula se visualiza mediante hibridación fluorescente in situ o FISH. La principal ventaja de esta técnica frente a otros métodos, como la visualización de ARN en células vivas utilizando etiquetas, es que se puede detectar ARN nativo en lugar de ARN modificado. En general, las personas nuevas en esta técnica tendrán dificultades porque requiere paciencia y cuidado en el manejo de las laminillas, la estandarización del método, así como un control preciso del tiempo.Durante las incubaciones, el procedimiento específico para el cultivo de células destinadas a fijación dependerá del tipo de células. Para células adherentes, es inicialmente importante sembrarlas sobre laminillas de vidrio estériles no tratadas, de modo que la confluencia final al momento de la recolección sea aproximadamente del 70 al 80 %. Las células no adherentes deben cultivarse de la manera convencional hasta que estén listas para ser recolectadas.Luego, incúbelos con laminillas que hayan sido tratadas con poli-L-lisina para una placa típica de cultivo de tejidos de poliestireno de 12 pocillos, con 150.000 células por pocillo, 24 horas antes de la infección o transfección. Incube las células sobre las laminillas durante una hora a 37 grados Celsius para comenzar el procedimiento de fijación celular. Deseche el medio mediante aspiración cuidadosa y agregue suavemente una XPBS preparada en agua doblemente destilada.O lave las células con DPBS durante un minuto. También se puede usar piro CARBATO de dathyl o XPBS tratado con DEPC. No use PBS sin tratar, ya que puede contener enzimas de R nasa.Deseche el DPBS y agregue suavemente suficiente paraformaldehído al 4 % para cubrir completamente las células; incube durante 15 a 20 minutos. Luego, deseche el paraformaldehído y lave las células con DPBS durante un minuto. Deseche el DPBS y agregue glicina 0,1 molar; incube durante 10 minutos.A continuación, deseche la glicina y lave las células con DPBS durante un minuto. Después de desechar el DPBS, añada Triton X 100 al 0,2 % e incube de cinco a 10 minutos. Si va a teñir proteínas del nucléolo o de la envoltura nuclear, realice la permeabilización con Triton X 100 durante no más de cinco minutos, ya que de lo contrario la localización de la proteína se volverá difusa.Deseche el Triton X-100 y lave dos veces con DPBS durante un minuto cada vez antes de comenzar el procedimiento para el pez. Prepare las superficies sobre las cuales incubar las laminillas, asegurándose de limpiarlas y etiquetarlas adecuadamente. Para una laminilla de 18 milímetros, agregue 50 microlitros de solución de ADN al portaobjetos.El aspecto más difícil de este procedimiento es el manejo adecuado de las laminillas. Es importante asegurarse de incubar el lado correcto de la laminilla y manipularlas con cuidado. Para evitar roturas, añada la laminilla a la portaobjetos, asegurándose de colocarla con el lado de las células hacia abajo e incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de 15 minutos, coloque las laminillas con el lado de las células hacia arriba en una placa de cultivo con un X-D-P-B-S.Lave los cubreobjetos durante un minuto. Esta mezcla contiene lo siguiente: 50 % de formamida desionizada, una miligramo por mililitro, TRNA, dos X-S-S-P-E, cinco X dnar ARN mensajero y agua DEPC hasta un volumen final de 50 microlitros.La sonda es una sonda de ARN marcada con digoxigenina diseñada para ser complementaria al ARN genómico viral. Coloque cada cubreobjetos con la cara de las células hacia abajo sobre la mezcla de hibridación en el portaobjetos. La incubación debe realizarse en una bandeja que contenga una FIDE al 50 % dos X-S-S-P-E.Mezcle e incube durante 16 a 18 horas a 42 grados Celsius. A continuación, incube la laminilla con la cara celular hacia abajo en 50 microlitros de 50 %fide durante 50 minutos a 42 grados Celsius. Lave las laminillas dos veces en dos X-S-S-P-E incubándolas con la cara hacia abajo en 50 microlitros de dos X-S-S-P-E durante cinco minutos cada una a 42 grados Celsius.Finalmente, lave las laminillas en una X-D-P-P-S durante un minuto. Para comenzar este procedimiento, bloquee las laminillas colocando el lado celular hacia abajo en 50 microlitros de solución bloqueadora Roche al 1X durante 30 minutos a temperatura ambiente. Cuando finalice el bloqueo, coloque cada laminilla con el lado celular hacia abajo en 50 microlitros de una solución de anticuerpos primarios que contenga todos los anticuerpos primarios del experimento en sus concentraciones adecuadas. Incube durante una hora a 37 grados Celsius tras transcurrida una hora.Coloque el cubreobjetos con la cara celular hacia arriba en una placa de cultivo que contenga DPPS y lave los cubreobjetos durante 10 minutos. A continuación, pipetee 50 microlitros de solución de anticuerpo secundario sobre un portaobjetos por cada cubreobjetos. Pueden utilizarse anticuerpos conjugados con Alexa Fluor para obtener una variedad de colores, y se usan en una dilución de uno a 500 en solución bloqueante 1x y D-P-B-S 1x. Coloque cada cubreobjetos con la cara celular hacia abajo en la solución de anticuerpo secundario e incube durante una hora a 37 grados.Lave los cubreobjetos dos veces durante 10 minutos cada vez. En DPBS, seque los cubreobjetos con la cara celular hacia arriba sobre un trozo de papel absorbente. Asegúrese de cubrir los cubreobjetos para evitar la exposición a la luz y el blanqueo.Una vez que todo el líquido haya evaporado, monte las laminillas sobre portaobjetos nuevos. Utilizando ocho microlitros de inmuno monte, toque suavemente la laminilla para eliminar cualquier burbuja de aire y aplique esmalte de uñas en los bordes de la laminilla para fijarla en su lugar. La visualización de ARN y proteínas mediante técnicas de microscopía también es fundamental para el éxito de este procedimiento.La configuración del microscopio utilizado puede facilitar u obstaculizar la visualización. Por lo tanto, es fundamental que la configuración del microscopio se establezca correctamente y sea consistente de una muestra a otra dentro de un mismo experimento. En esta figura se ilustra un resultado representativo de la visualización de ARN viral mediante hibridación in situ fluorescente y de la localización de proteínas mediante inmunofluorescencia.En este primer panel, donde las células HeLa están transfectadas con el VIH-1, el ARN viral del VIH-1 marcado en verde se observa distribuido por todo el citoplasma, mostrando en su mayor parte una señal difusa, aunque pequeños puntos citoplasmáticos no son infrecuentes. La especificidad puede observarse comparando las células positivas con las células circundantes que no muestran fluorescencia, como se ilustra en la imagen insertada en blanco y negro que representa únicamente la tinción del ARN viral. La tinción roja refleja la inmunofluorescencia de la proteína de unión al dominio Ross GA PSH tres o G3BP, que marca principalmente el citoplasma. Cuando las células HeLa están transfectadas con el VIH-1 que carece de la proteína reguladora Rev, el ARN viral producido se retiene en el núcleo.Esto puede visualizarse como una señal verde brillante en el núcleo y la ausencia de señal fluorescente de ARN en el citoplasma. La distribución del ARN viral de un solo genoma de VIH también puede alterarse mediante la sobreexpresión de ciertas proteínas celulares. Por ejemplo, la sobreexpresión de la proteína lisosomal interactiva con RAB7 o real, una proteína implicada en el tráfico de vesículas endosomales, provoca la relocalización del ARN genómico viral marcado en verde hacia el centro de organización de microtúbulos.Aquí los endosomas están marcados por lamp1 y teñidos en rojo. En contraste, la sobreexpresión de un delta N con deleción en el extremo amino que no puede unirse a la subunidad p150 del complejo motor dine dispersa los endosomas tardíos en el citoplasma. La sobreexpresión de p150 dine bloquea la subunidad grande del motor dine y libera los endosomas tardíos, así como el ARN genómico viral y las proteínas estructurales V1 del VIH, hacia la periferia celular. Cuando se expresa el VIH-1 en células helo y luego se recolectan y analizan en diferentes puntos temporales, el ARN viral aparece en la célula tan temprano como tres horas posteriores a la transfección e infección y se vuelve fácilmente observable mediante esta técnica de hibridación in situ fluorescente a las 12 horas.Aquí la expresión del ARN viral se rastrea en verde, mientras que la proteína celular H-N-R-N-P-A1 se tiñe en rojo. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en 20 minutos el día uno y cuatro horas y media el día dos, si se realiza adecuadamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar manipular las laminillas con delicadeza para evitar romperlas y asegurarse de evitar la luz una vez que se haya aplicado el anticuerpo secundario. No olvide que al trabajar con VIH V1 y cualquier otro patógeno de nivel superior, es extremadamente peligroso antes de la fijación, y se deben tomar siempre precauciones como una formación adecuada y contención mientras se realiza este procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

En este vídeo, las células infectadas con viriones MCPyV fueron sometidas a una reacción en cadena de hibridación in situ para detectar genomas específicos de MCPyV. Además, la técnica de ADN-HCR se combinó con FISH para visualizar el ADN MCPyV en células de piel humana infectadas.

HCR-DNA FISH: Una técnica de hibridación fluorescente in situ para detectar ADN viral en células infectadas

Este video demuestra la aplicación de la Reacción en Cadena de Hibridación (HCR)-Hibridación In Situ de Fluorescencia (FISH) para visualizar la distribución espacial del ARN subgenómico del SARS-CoV-2. La combinación de HCR con técnicas de inmunofluorescencia tiene el potencial de proporcionar información sobre las interacciones huésped-virus a nivel de una sola célula.

Uso de la hibridación in situ de fluorescencia de inmunoARN para visualizar el SARS-CoV-2

Aquí se describe un fluorescente de todo el...

Todo el monte ARN fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación de<em&gt; Drosophila</em&gt; Los embriones

Hemos establecido un fluorescente en el protocolo de hibridación in situ para la detección de un genoma del virus de ADN persistente dentro de las secciones de tejido de modelos animales. Este protocolo permite el estudio de proceso de infección por codetection del genoma viral, sus productos de ARN, y proteínas virales o celulares dentro de las células individuales.

Detección del genoma y transcripciones de un virus ADN persistente en los tejidos neuronales por Fluorescente In situ La hibridación Combinado con inmunotinción

La hibridación fluorescente in situ (FISH) permite la detección de ácidos nucleicos en su ambiente nativo dentro de las células. Se describen un protocolo para el combinado, la detección simultánea de ARN y ADN por medio de pescado, que se puede utilizar para estudiar inactivación del cromosoma X en las células madre embrionarias de ratón.

ADN-ARN combinado fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación (FISH) para el Estudio de inactivación del cromosoma X en las células madre embrionarias de ratón Diferenciada Mujer

El RNA se describe en situ hibridación protocolo permite la detección de RNA en todo Drosophila embriones o tejidos disecados. Utilizando placas de microtitulación de 96 pocillos y amplificación de la señal tyramide, transcripciones pueden ser detectadas en el rendimiento, sensibilidad y alta resolución y a un costo relativamente bajo.

Alta resolución fluorescente In Situ hibridación en embriones de Drosophila y tejidos utilizando amplificación de la señal de Tyramide

Aquí se presenta un protocolo para un enfoque de imágenes de fluorescencia, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA y protein (MICDDRP), un método capaz de la visualización simultánea de fluorescencia unicelular de proteínas virales y ácidos nucleicos de diferente tipo y varamiento. Este enfoque se puede aplicar a una amplia gama de sistemas.

Imágenes de fluorescencia multiplexada de una sola célula para visualizar ácidos nucleicos y proteínas virales y monitorear el VIH, el HTLV, el VHB, el VHC, el virus del Zika y la infección por influenza

Aquí, describimos un método simple que combina el hibridación in situ de la fluorescencia del ARN (RNA-PESCADO) con la inmunofluorescencia para visualizar el ARN agudo severo del coronavirus 2 del coronavirus del síndrome respiratorio (SARS-CoV-2). Este protocolo puede aumentar la comprensión de las características moleculares de las interacciones ARN-huésped SARS-CoV-2 a nivel unicelular.

Visualización Del SARS-CoV-2 Usando Inmuno ARN-Fluorescencia Hibridación In Situ

Los microbios intestinales, incluidas las bacterias extracelulares y los patógenos intracelulares como el virus de Orsay y los microsporidios (hongos), a menudo se asocian con nematodos Caenorhabditis silvestres. Este artículo presenta un protocolo para detectar y cuantificar microbios que colonizan y/o infectan nematodos de C. elegans , y para medir la carga de patógenos después de infecciones controladas en el laboratorio.

Hibridación in situ de fluorescencia de ARN (FISH) para visualizar la colonización microbiana y la infección en los intestinos de Caenorhabditis elegans

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Fluorescencia In situ</emHibridación> (FISH) Protocolo en el esperma humano

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