Cargando retrógrada de los nervios, panfletos, y las raíces espinales con tintes fluorescentes
19 de abril de 2012
Se describe una técnica sencilla y de bajo costo para la introducción de alta concentración de colorantes fluorescentes y sensible de calcio en las neuronas o cualquier aparato neuronal con una pipeta de succión de polietileno.
El objetivo general de este procedimiento es introducir una concentración elevada de colorante fluorescente o sensible a iones en neuronas o en cualquier trayecto neuronal mediante una técnica sencilla y de bajo costo. Esto se logra primero produciendo dos tipos de pipetas, tipo uno y tipo dos. Luego, se conecta un tubo elastómero flexible a la pipeta tipo uno y se aplica presión positiva para aspirar el trayecto neuronal objetivo dentro de la pipeta tipo uno, verificando que se forme un buen sello.
A continuación, inserte la pipeta tipo dos dentro de la pipeta tipo uno y utilice la pipeta tipo dos para aspirar el LCR A residual de la pipeta tipo uno. Luego, introduzca el colorante, pero sin burbujas de aire, en la pipeta tipo uno. El paso final consiste en incubar las neuronas a oscuras entre seis y 20 horas.
Finalmente, tras la eliminación de la pipeta tipo uno, el preparado está listo para estudios in vitro, electrofisiológicos o morfológicos. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la aplicación por baño, la inyección BOS y la electroporación, es que el D se entrega a una población neuronal definida. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, tales como la actividad, conectividad, morfología y distribución de neuronas definidas.
Por lo general, la técnica requiere práctica, especialmente para asegurar que el colorante no se diluya dentro de la pipeta tipo uno y que no se introduzcan burbujas de aire en ella. Comience este procedimiento colocando el tubo de polietileno sobre la llama de una lámpara de alcohol para producir dos pipetas cortas con puntas cónicas. Primero, estire una pipeta corta tipo uno con una punta pequeña que pueda sujetar firmemente la raíz o vía objetivo.
A continuación, prepare una pipeta tipo dos con un vástago más largo y delgado y una punta muy fina que pueda insertarse en la pipeta tipo uno hasta su punta. Posteriormente, conecte la pipeta tipo dos a una aguja EC de calibre 19 con el extremo recortado. Luego, coloque la médula espinal aislada en un baño.
Súper fusiónelo con A CSF frío durante todo el proceso de carga. Después, coloque la pipeta tipo uno en un porta-electrodos de manera que su abertura posterior pueda conectarse fácilmente a una jeringa mediante un tubo flexible. En este procedimiento, primero aspire el CSF dentro de la pipeta tipo uno utilizando una jeringa.
A continuación, dibuje el tracto axonal o raíz que se va a llenar. Luego retire el tubo flexible de la abertura trasera. Después de eso, conecte la pipeta tipo dos a otra jeringa.
Insértelo en la pipeta tipo uno, que está sosteniendo un tracto axonal o raíz neuronal bajo el microscopio. Utilice la jeringa conectada a la pipeta tipo dos para aspirar el LCR de modo que el LCR residual apenas cubra el tracto axonal. Luego retire la pipeta tipo dos de la pipeta tipo uno.
Monitoree el nivel de LCS A durante unos minutos para verificar un buen sello en el tracto axonal o en los nervios. Posteriormente, disuelva el colorante en LCS A o en Triton X-100 al 0,2 % en agua doblemente destilada. Aspírelo hacia la pipeta tipo dos aplicando una presión negativa débil a la jeringa conectada, teniendo cuidado de no aspirar burbujas de aire.
Luego, inserte la pipeta tipo dos que contiene el colorante en la solución residual de LCR A en la pipeta tipo uno y libere lentamente el colorante en el LCR A, aplicando una presión positiva suave al émbolo. Asegúrese de no introducir burbujas de aire ni de desplazar el tejido objetivo desde el interior de la punta. Si se introduce una burbuja de aire en la pipeta tipo uno durante la inyección del colorante, extraiga la burbuja acercando la punta de la pipeta tipo dos hasta la burbuja y aplicando suavemente una presión negativa débil mediante el émbolo acoplado.
Después de que se haya liberado una cantidad suficiente de colorante, retire la pipeta de tipo dos. A continuación, incube el tejido a oscuras durante seis a 20 horas, según el tipo de experimento. Una vez transcurrido el tiempo suficiente para la impregnación, retire suavemente el electrodo del tejido.
Luego, el tejido está listo para la obtención de imágenes o histología. A continuación se muestra un diagrama esquemático que ilustra la carga simultánea de tres dextranos fluorescentes conjugados diferentes en neuronas motoras, aferentes sensoriales y neuronas intercaladas espinales; las neuronas motoras y los aferentes sensoriales sacros fueron rellenados retrógradamente con Dextrano azul Cascade y Dextrano rojo Texas a través de las raíces ventrales y dorsales, respectivamente. Se cargó dextrano verde fluorescente en neuronas intercaladas espinales cuyos axones ascienden a través del funículo ventral.
Se muestra aquí una imagen confocal de una sección de la médula espinal sacra en la que las neuronas han sido marcadas retrogradamente. Obsérvese que las aferentes sensoriales marcadas son principalmente ipsilaterales. Con algunas proyecciones contralaterales, las neuronas motoras marcadas son ipsilaterales a la raíz ventral rellenada, mientras que las interneuronas marcadas son contralaterales a ella, como indica la punta de flecha.
Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar métodos adicionales para responder preguntas clave, como la conectividad funcional, el inhibidor excitatorio, el tipo de seno, la distribución y la producción de neurotransmisores en las neuronas del campo DI. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurofisiología de la médula espinal y el bulbo raquídeo emitieran poblaciones neuronales específicas utilizando colorantes sensibles a iones. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aplicar colorantes fluorescentes y/o sensibles a iones en neuronas y fibras sensoriales en la médula espinal aislada.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Resumen
Este artículo describe una técnica sencilla y de bajo costo para introducir altas concentraciones de colorantes fluorescentes y sensibles al calcio en neuronas o trayectos neuronales. El método utiliza una pipeta de succión de polietileno para lograr una introducción eficaz del colorante.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Imagen fluorescente
Antecedentes
- Los colorantes fluorescentes y sensibles al calcio son esenciales para estudiar la actividad neuronal.
- Los métodos tradicionales pueden ser costosos o complejos.
- Esta técnica tiene como objetivo simplificar el proceso.
- El uso de una pipeta de succión de polietileno mejora el acceso para los investigadores.
Objetivo del estudio
- Introducir eficazmente altas concentraciones de colorantes en neuronas.
- Proporcionar una alternativa rentable frente a los métodos existentes.
- Facilitar una mejor visualización de la actividad neuronal.
Métodos Utilizados
- Producción de dos tipos de pipetas para el procedimiento.
- Aplicación de presión positiva para atraer el trayecto neuronal objetivo hacia la pipeta.
- Uso de una segunda pipeta para aspirar el LCR residual.
- Introducción del colorante sin burbujas de aire, seguida de incubación en la oscuridad.
Resultados principales
- La técnica permite una introducción eficaz del colorante en las neuronas.
- Se pueden alcanzar altas concentraciones de colorantes con un costo mínimo.
- El tiempo de incubación varía entre seis y veinte horas para obtener resultados óptimos.
- El método es reproducible y accesible para los investigadores.
Conclusiones
- Este método proporciona una manera confiable de introducir colorantes en sistemas neuronales.
- Mejora la capacidad para estudiar la dinámica y las funciones neuronales.
- El enfoque es beneficioso tanto para fines de investigación como educativos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Esta técnica permite la administración precisa de colorantes fluorescentes y sensibles a iones a poblaciones neuronales definidas, apoyando la reducción de riesgos mecanicistas en la validación de dianas y el análisis de vías. Al mantener una alta concentración de colorante durante toda la carga, mejora la fiabilidad de la señal en ensayos funcionales y morfológicos posteriores. El enfoque de bajo costo y reproducible mejora la estandarización y escalabilidad de los ensayos en flujos de trabajo de descubrimiento temprano.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biofármacos
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la interrogación de trayectos neuronales específicos para aclarar hipótesis sobre conectividad y función.
- Valor operativo: Proporciona una población neuronal definida para estudios consistentes de interacción con objetivos.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera lecturas cuantitativas de fluorescencia para evaluar la absorción del colorante y la eficiencia de etiquetado neuronal.
- Valor operativo: Facilita la preparación del ensayo mediante la administración estandarizada y libre de burbujas del colorante y protocolos de incubación reproducibles.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Facilita la modelización de sistemas relevantes para enfermedades al permitir la visualización de poblaciones de motoneuronas, neuronas sensoriales e interneuronas en preparaciones de la médula espinal.
- Valor operativo: Garantiza la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante la marcación fiable de neuronas para electrofisiología y obtención de imágenes.
Integración de la tubería y del flujo de trabajo
El método se integra en la biología del descubrimiento al permitir la marcación dirigida de neuronas, apoyando la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías. Avanza hacia ensayos al proporcionar preparaciones listas para su uso con resultados cuantitativos dependientes del colorante. La técnica contribuye al análisis mediante métricas medibles de intensidad y distribución de la fluorescencia. Apoya la investigación traslacional al mantener la integridad neuronal para estudios de continuidad preclínicos. La reutilización a escala empresarial se posibilita mediante el sistema de bajo costo y adaptable basado en pipetas, aplicable a múltiples trayectos neuronales.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías mediante la etiquetación definida de trayectos neuronales.
- Selección: Proporciona disponibilidad para ensayos mediante la introducción estandarizada de colorante en alta concentración sin dilución.
- Análisis: Permite mediciones cuantitativas de la intensidad de fluorescencia y la distribución neuronal para el análisis comparativo entre condiciones.
- Investigación Traducida: Garantiza la continuidad preclínica al preservar la morfología y función neuronales tras la etiquetación.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma reutilizable y de bajo costo para la etiquetación neuronal consistente en diversos modelos experimentales.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva al reducir la ambigüedad mecanicista en los estudios de conectividad y actividad neuronal.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y escalabilidad mediante la preparación estandarizada de pipetas y la administración de colorantes.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar datos confiables sobre la interacción con objetivos neuronales y la modulación de vías.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo mediante una etiquetación neuronal consistente y de alta fidelidad en todas las etapas del descubrimiento.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en microcirugía y visualización microscópica para la manipulación adecuada de pipetas y el manejo de tejidos.
- Depende del acceso a tubos de polietileno, sistemas de jeringas y microscopía de fluorescencia para la carga y detección del colorante.
- Necesita una estandarización entre equipos de las técnicas de elaboración de pipetas y de las condiciones de incubación para garantizar una marcación consistente.
- Incluye consideraciones de adaptación al aplicar el método a diferentes trayectos neuronales o sistemas modelo con diámetros axónicos variables.
- Comprende limitaciones prácticas, como la necesidad de evitar la introducción de burbujas de aire y mantener la integridad del sello durante la carga del colorante.
