El análisis de la maduración pulmonar de células dendríticas y migración durante la inflamación de las vías alérgica

El objetivo de este procedimiento es evaluar la maduración y migración de las células dendríticas pulmonares o DC durante el curso de la inflamación alérgica de las vías respiratorias inducida por Val Boomin en ratones. Esto se logra sensibilizando primero a los ratones con Val Boomin, seguido de un desafío de las vías respiratorias con Val Boomin etiquetado. A continuación, se extraen el pulmón y los ganglios linfáticos mediastínicos.

Finalmente, se prepara una suspensión de una sola célula a partir de los tejidos del pulmón y los ganglios linfáticos. En última instancia, el estado de maduración y el número absoluto de células de las células dendríticas de la lectura de Pullman que se encuentran en el ganglio linfático mediastínico después del desafío FITC Val Boomin se pueden evaluar mediante análisis de citometría de flujo. Este método puede ayudarnos a responder preguntas clave sobre las respuestas inmunitarias pulmonares, como si las células dendréticas experimentan maduración, disminuyen la exposición al antígeno y si migran a los ganglios linfáticos.

Y si migran, entonces cuál es la tasa de migración. Comience agregando la solución de Val Boomin recién preparada Dropwise en una proporción de uno a uno en un tubo de alumbre mientras se agita el vórtice. Revuelva la mezcla durante 30 minutos y luego llene una jeringa de un mililitro con 0,2 mililitros de la mezcla.

Con el pulgar en el dedo índice de una mano, agarre el ratón para ser inyectado por el trozo del cuello cerca de la base del cráneo. A continuación, inyecte la solución de alumbre Val Boomin en la cavidad peritoneal del ratón con la otra mano. Siete días después de la segunda inyección de Val en alumbre, sostenga un val anestesiado en un animal sensibilizado con alumbre en posición vertical y, a continuación, con puntas de pipeta estériles, pipetee 100 microlitros y una solución de val en fxi recién preparada en el NAS del ratón gota a gota.

Comience conectando un catéter de calibre 20 a una jeringa de un mililitro. Luego, después de confirmar la eutanasia del ratón, abra la cavidad torácica del animal hasta el cuello para exponer y canular la tráquea del ratón. Es absolutamente crítico lavar los pulmones y profusar el corazón para asegurarse de que se hayan eliminado todos los macrófagos alveolares contaminantes y las células mononucleares que están presentes en la sangre periférica.

Y asegúrese de realizar estos dos pasos siguientes con cuidado y, por supuesto, con mano firme. Ahora administre PBS helado con EDTA tres veces a través del catéter para enjuagar el tracto respiratorio inferior y eliminar las células de los espacios alveolares. Luego, después de colocar una jeringa de 10 mililitros con una aguja de calibre 20, perfundir los pulmones con 10 mililitros de PBS que contengan heparina a través del ventrículo derecho del corazón.

La eliminación de las células sanguíneas restantes de la vasculatura pulmonar se considera completa cuando los pulmones se vuelven blancos. A continuación, retire los ganglios linfáticos mediastínicos y colóquelos en un plato aparte. Evite el enfriamiento del ajuste minimizando la exposición a la luz del tejido.

Luego, diseccione los pulmones perfundidos y colóquelos en una placa de Petri con unas tijeras, pique los pulmones. A continuación, digiere el tejido pulmonar a 37 grados centígrados en 250 unidades por mililitro de colagenasa D. Después de 25 minutos de incubación, agregue EDTA a la mezcla durante cinco minutos para detener la actividad de la colagenasa. Finalmente, se pasan los fragmentos de pulmones digeridos a través de un colador de células de 100 micras y se colocan los eritrocitos con tampón hipotónico.

Separa los ganglios linfáticos mediastínicos con agujas finas y digiere con colagenasa como se acaba de demostrar para los pulmones, seguido de colar el tejido a través de un filtro celular después de la sensibilización intraperitoneal y la vía aérea. Val en desafío. La presencia de células inflamatorias puede evaluarse mediante tinción de hemat, toína y eosina en secciones pulmonares representativas del control.

Animales tratados con solución salina, los tejidos están desprovistos de inflamación, como lo demuestra el gráfico superior. Por el contrario, las células inflamatorias son omnipresentes en todas las secciones pulmonares de Val en animales sensibilizados y desafiados, como se puede ver en la parte inferior. La tinción gráfica de desplazamiento de ácido peryódico se puede utilizar para evaluar la producción de moco, como se muestra en este gráfico inferior.

La inducción de inflamación alérgica de las vías respiratorias después de la provocación de Val en ratones sensibilizados se confirma por la presencia de moco. Por el contrario, el control exhibe una ausencia total de producción de moco. Los ratones tratados con solución salina, como se muestra en el gráfico superior después de Val en las DC pulmonares de desafío, experimentan maduración y posterior migración a los ganglios linfáticos drenantes.

Aquí, un análisis representativo de los ganglios linfáticos mediastínicos de ratón muestra que se detecta un aumento modesto pero constante en la proporción de células C CD positivas en animales sensibilizados y desafiados con Val Boomin en comparación con ratones tratados con solución salina. Además, el análisis del número absoluto de células CD 11 C positivas CD 11 B positivas Val Boomin se ajusta a las células C positivas de los ganglios linfáticos mediastínicos de Val en ratones sensibilizados y desafiados muestra que se produce un aumento varias veces mayor en el número de DC en los ratones desafiados en comparación con los animales tratados con solución salina. Después de ver este vídeo, deberíamos tener una muy buena comprensión de nuestra técnica para analizar la maduración y la migración de las células dendríticas pulmonares.

Y una vez que realmente comprenda esta técnica, puede modificarla para evaluar las respuestas de las células dendríticas pulmonares a otros patógenos, así como a otros factores experimentales.