El análisis de la maduración pulmonar de células dendríticas y migración durante la inflamación de las vías alérgica

El objetivo de este procedimiento es evaluar la maduración y migración de las células dendríticas pulmonares o CD durante el curso de la inflamación alérgica de las vías respiratorias inducida por Val Boomin en ratones. Esto se logra primero sensibilizando a los ratones con Val Boomin, seguido de un desafío en las vías respiratorias con Val Boomin marcado con fitsy. A continuación, se extraen los pulmones y los ganglios linfáticos mediastínicos.

Finalmente, se prepara una suspensión de células individuales a partir de los tejidos pulmonar y de ganglio linfático. En última instancia, el estado de maduración y el número absoluto de células dendríticas Pullman que leen presentes en el ganglio linfático mediastínico después del desafío con FITC Val Boomin pueden evaluarse mediante análisis citométrico de flujo. Este método puede ayudarnos a responder preguntas clave sobre las respuestas inmunitarias pulmonares, como si las células dendríticas experimentan maduración tras la exposición al antígeno, y si migran hacia los ganglios linfáticos regionales.

Y si migran, cuál es la tasa de migración. Comience añadiendo, gota a gota, una solución de Val Boomin recién preparada en una proporción uno a uno en un tubo de alúmina mientras se mezcla en vórtex. Agite la mezcla durante 30 minutos y luego llene una jeringa de un mililitro con 0,2 mililitros de la mezcla.

Con el pulgar y el dedo índice de una mano, sujete al ratón que va a ser inyectado por el pliegue del cuello cerca de la base del cráneo. Luego, con la otra mano, inyecte la solución de Val Boomin en alúmina en la cavidad peritoneal del ratón. Siete días después de la segunda inyección de Val en alúmina, sostenga al animal sensibilizado con Val en alúmina bajo anestesia en posición vertical, y a continuación, utilizando puntas de pipeta estériles, pipetee 100 microlitros de solución recién preparada de Val en fxi sobre la NAS del ratón gota a gota.

Comience por sujetar un catéter de calibre 20 a una jeringa de un mililitro. Luego, tras confirmar la eutanasia del ratón, abra la cavidad torácica del animal hasta el cuello para exponer y canular la tráquea del ratón. Es absolutamente fundamental lavar los pulmones y perfundir el corazón para asegurarse de que se hayan eliminado todos los macrófagos alveolares y células mononucleares contaminantes presentes en la sangre periférica.

Asegúrese de realizar estos dos próximos pasos con cuidado y, por supuesto, con mano firme. Ahora administre PBS frío con EDTA tres veces a través del catéter para lavar el tracto respiratorio inferior y eliminar las células de los espacios alveolares. Luego, después de colocar una jeringa de 10 mililitros con una aguja de calibre 20, perfunda los pulmones con 10 mililitros de PBS que contenga heparina a través del ventrículo derecho del corazón.

Se considera que la eliminación de cualquier célula sanguínea residual del sistema vascular pulmonar está completa cuando los pulmones se vuelven blancos. A continuación, retire los ganglios linfáticos mediastínicos y colóquelos en un recipiente aparte. Evite la pérdida de señal por apagado minimizando la exposición de la muestra a la luz.

A continuación, diseccionar los pulmones perfundidos y colocarlos en una placa de Petri; con tijeras, picar los pulmones. Después, digerir el tejido pulmonar a 37 grados Celsius en 250 unidades por mililitro de colagenasa D. Tras 25 minutos de incubación, añadir EDTA a la mezcla durante cinco minutos para detener la actividad de la colagenasa. Finalmente, pasar los fragmentos de pulmón digerido a través de un filtro celular de 100 micrones y lisar los eritrocitos con tampón hipotónico.

Separar cuidadosamente los ganglios linfáticos mediastínicos utilizando agujas finas y digerirlos con colagenasa tal como se acaba de demostrar para los pulmones, seguido de la filtración del tejido a través de un filtro celular tras la sensibilización intraperitoneal y el desafío por vía aérea con Val. La presencia de células inflamatorias puede evaluarse mediante tinción con hematoxilina y eosina en secciones pulmonares representativas de controles.

En los animales tratados con solución salina, los tejidos carecen de inflamación, como se demuestra en el gráfico superior. En contraste, las células inflamatorias son generalizadas en las secciones pulmonares de los animales sensibilizados y expuestos a Val, tal como se observa en la imagen inferior. La tinción con ácido periódico de Schiff puede utilizarse para evaluar la producción de moco, como se muestra en este gráfico inferior.

La inducción de la inflamación alérgica en las vías respiratorias tras el desafío con Val en ratones sensibilizados con Val se confirma por la presencia de moco. Por el contrario, los controles exhiben una ausencia completa de producción de moco. Los ratones tratados con solución salina, como se muestra en el gráfico superior, tras el desafío con Val, los DC pulmonares experimentan maduración y posterior migración hacia los ganglios linfáticos drenantes.

Aquí, un análisis representativo de los ganglios linfáticos mediastínicos de ratón muestra que se detecta un aumento modesto pero consistente en la proporción de células positivas para CD11C en animales sensibilizados y estimulados con Val Boomin en comparación con ratones tratados con solución salina. Además, el análisis del número absoluto de células positivas para CD11C, positivas para CD11B y positivas para Val Boomin FITC procedentes de los ganglios linfáticos mediastínicos de ratones sensibilizados y estimulados con Val muestra que ocurre un incremento varias veces mayor en el número de DC en ratones estimulados en comparación con animales tratados con solución salina. Después de ver este video, deberíamos tener una comprensión muy clara de nuestra técnica para analizar la maduración y la migración de las células dendríticas pulmonares.

Y una vez que comprenda verdaderamente esta técnica, podrá continuar modificándola para evaluar las respuestas de las células dendríticas pulmonares a otros patógenos, así como a otros factores experimentales.