La inmovilización de las planarias, irradiación parcial, y el trasplante de tejido
6 de agosto de 2012
Un método eficaz para el injerto tejido de tamaño definido y constante entre planaria se describe. También se incluye una descripción de cómo la técnica de inmovilización utilizado para el trasplante se puede adaptar, en conjunción con los escudos de plomo, para la irradiación parcial de animales vivos.
El objetivo general del siguiente experimento es posicionar una población de células madre sanas adyacentes al tejido ablacionado con células madre dentro de un paria con el fin de analizar los comportamientos de las células madre y la progenie in vivo durante la regeneración. Esto se logra anestesiando e inmovilizando un paria no irradiado o un parian irradiado para su posterior manipulación. A continuación, el paria inmovilizado no irradiado se protege parcialmente con plomo y luego se irradia con rayos X, lo que produce un paria no lesionado con tejido ablacionado con células madre yuxtapuesto al tejido blindado que permanece cargado de células madre.
Alternativamente, un injerto de tejido tomado de un donante no irradiado puede ser trasplantado a un huésped previamente irradiado con el fin de producir un parian con una población aislada de células madre. Fally presente dentro de una célula madre. Se obtienen resultados de hospedadores ablacionados que muestran poblaciones de células madre aisladas adyacentes a las células madre ablacionadas con tejidos mediante ARN de montaje completo in situ dos hibridaciones para genes marcadores de células madre.
Por lo tanto, los métodos descritos aquí tienen como objetivo comprender mejor las planarias de regeneración mediante el estudio del comportamiento de las células madre tanto en el paradigma de trasplante como en el paradigma de irradiación parcial, lo que nos permite probar si los tejidos circundantes y los entornos locales en los que residen estas células madre, afectan o afectan el comportamiento de estos neoblastos o células madre. Durante el proceso de regeneración, uno o dos meses antes del experimento, alimente el plin de acuerdo con el manuscrito adjunto. Para obtener el tamaño deseado en esta demostración, se seleccionan plin de entre uno a dos centímetros de largo y más de dos milímetros de ancho.
Luego se les priva de tres a siete días antes de su uso. A continuación, prepare la solución de clorotono un anestésico local suave disolviendo de 0,1 a 0,2% de peso por volumen de cleone en el agua paria. Luego enfríe la solución en hielo para el trasplante de tejido con un quemador bunsen, doble un tubo capilar con un diámetro interior de 0,75 milímetros a uno o dos centímetros desde el extremo en un ángulo de 90 grados para cortar el tejido del injerto.
A continuación, doble otro tubo capilar de 0,7 milímetros de diámetro exterior a uno o dos centímetros del extremo en un ángulo de 90 grados para crear un agujero en el huésped para recibir el injerto. A continuación, corta el papel de filtro negro watman. Número tres, papel de filtro, toallita Kim y papel de liar de cigarrillos según los tamaños indicados en el manuscrito adjunto.
Después de eso, prepare la solución Holt Fers modificada y la solución Holt Fretter saturada con Caine. Enfríe ambos a cuatro grados centígrados. A continuación, coloca una toallita Kim doblada en un cuadrado de Paraform.
Colóquelo en la placa enfriadora Peltier u otro dispositivo de enfriamiento bajo un microscopio de disección. Posteriormente, sature la toallita Kim con una solución Holt Fretter fría. A continuación, coloque dos rectángulos de papel de filtro negro sobre la toallita Kim.
Ahora coloque un trozo de papel de filtro Watman número dos en una placa de Petri. Humedece el papel de filtro con la solución Holt Fretter. A continuación, enfríe el plato con hielo para obtener una irradiación parcial.
Coloque un revestimiento de papel más grande en un plato más grande, similar al trasplante de tejido. Humedece el papel de filtro con la solución Holt Fretter. Luego enfríe el plato con hielo.
En este procedimiento, llene una placa de Petri con una solución de cleone fría. Pipetear la Planaria en el plato para el trasplante. Solo anestesiar a un huésped y a un donante a la vez.
En el caso de la irradiación parcial, se puede anestesiar a muchos animales a la vez. A continuación, deje que los parias se sumerjan en la solución de cleone durante cinco a 10 minutos hasta que queden inmóviles. Enjuague los paria pipeteándolos en un plato lleno de solución Holt Fretter fría.
Después de eso, inmovilice el área del púl, pipeteándolos sobre los papeles de filtro negros saturados con una solución de traste Holt enfriada. A continuación, oriéntelos con el lado ventral hacia abajo con un par de pinzas. Ahora coloque una placa de Petri fría preparada anteriormente en un cubo de hielo que quepa dentro de un irradiador de rayos X de alta fuente.
Coloque el área del plin anestesiado en una placa de Petri moviendo los papeles de filtro negros. A continuación, transfiéralos al radiador de rayos X de la fuente superior y sitúe la cubitera de forma que se minimice la distancia desde el tubo catódico hasta el paria. Maximizando así la tasa de dosis efectiva.
A continuación, coloque los protectores de plomo entre la paria y el tubo catódico para la dosis de rayos X. Si se desea una ablación completa de células madre de regiones no protegidas, administre 30 grays o más. Inmediatamente después de la emisión de rayos X, transfiera el parian al agua paria fría.
Después de eso, deje que el agua paria se caliente a temperatura ambiente y los animales se desprendan del papel de filtro negro. El procedimiento de irradiación parcial ya se ha completado. Para comenzar este procedimiento bajo el microscopio de disección, coloque el huésped anestesiado y el área del donante en filtros negros rectangulares separados en la toallita Kim, que ya se ha enfriado en la placa peltier o enfriadora.
Utilice un tubo capilar de 0,75 milímetros de diámetro interior para cortar el tapón de injerto del donante. Luego, use un par de pinzas para colocarlo en una parte apartada del huésped. A continuación, utilice un tubo capilar de 0,7 milímetros de diámetro exterior para retirar un tapón del huésped.
A continuación, coloque el injerto en el orificio. Transfiera el huésped trasplantado en el papel de filtro negro rectangular a la placa de Petri preparada anteriormente. Humedece un pedazo de papel de liar con una solución Holt Fretter saturada con Caine.
A continuación, colóquelo encima del huésped trasplantado. A continuación, remoje cuatro trozos de papel de filtro que recubran la solución Holter saturada y, en caso de que el huésped trasplantado subalterno remoje posteriormente cuatro fajos de corte, Kim limpie la solución Holt Fretter saturada. Colócalos sobre los papeles de filtro.
Después de eso, cierre la tapa. Coloque la placa de Petri en hielo. A continuación, transfiera el parian donante al agua paria para su recuperación y regeneración.
Cuando se completen todos los trasplantes, coloque el parian trasplantado en una incubadora de 10 grados centígrados durante la noche. A la mañana siguiente, transfiéralo a una placa de Petri llena de agua paria. Deje que el parian se desprenda del papel de filtro o retírelo suavemente con pinzas y cambie el agua paria una vez cada dos o tres días después.
La hibridación in situ de montaje en agujero en el parian de control irradiado, pero totalmente blindado, fijado tres días después de la irradiación muestra una distribución de células madre que es indistinguible de la del parián de tipo salvaje. Por otro lado, para el paria que solo estaba parcialmente protegido, dejando las partes anterior y posterior expuestas, las células madre parecen ser ablacionadas de las regiones no protegidas. Aquí se muestran las vistas dorsal y ventral de un parián trasplantado con éxito.
Tres días después del trasplante, el injerto es claramente visible tanto en la superficie dorsal como en la ventral, y está rodeado de tejido no pigmentado característico en la interfaz huésped del injerto. Sin embargo, el trasplante fallido no muestra tejido de injerto visible en el sitio del trasplante. La hibridación in situ reveló la presencia de células madre solo en o alrededor de la ubicación del injerto, lo que indica el éxito del trasplante una vez dominado.
Los trasplantes se pueden realizar en tan solo cinco minutos cada uno. Con tasas de éxito que se acercan al 90 al 100% y la irradiación parcial se puede ampliar en gran medida. Suponiendo que el tamaño del campo de su irradiador sea lo suficientemente grande.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Resumen
Este estudio presenta un método para injertar tejido de tamaño definido entre planarias, utilizando una técnica de inmovilización para trasplante. El método también permite la irradiación parcial de animales vivos mediante el uso de blindajes de plomo.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología Regenerativa
- Investigación con Células Madre
Antecedentes
- Comprender el comportamiento de las células madre durante la regeneración es fundamental.
- La planaria sirve como organismo modelo para estudiar la regeneración.
- Los métodos anteriores carecían de precisión en el injerto de tejidos.
- Las técnicas de irradiación parcial pueden influir en la dinámica de las células madre.
Objetivo del estudio
- Analizar los comportamientos de las células madre y sus descendientes in vivo durante la regeneración.
- Desarrollar un método confiable para el injerto de tejidos en planarias.
- Explorar los efectos de la irradiación sobre las poblaciones de células madre.
Métodos Utilizados
- Anestesiar e inmovilizar planarias para su manipulación.
- Utilizar escudos de plomo para la irradiación parcial de tejidos.
- Realizar trasplantes de injertos de tejido de donantes no irradiados a receptores irradiados.
- Emplear hibridación in situ de ARN en preparaciones completas para el análisis.
Resultados principales
- Reimplante exitoso de tamaños definidos de tejido entre planarias.
- Aislamiento de poblaciones de células madre adyacentes a tejidos ablacionados.
- Efectos demostrados de la irradiación sobre el comportamiento de las células madre.
- Proporcionó información sobre la dinámica de las células madre durante la regeneración.
Conclusiones
- El método desarrollado mejora la precisión en el injerto de tejidos.
- La irradiación parcial puede utilizarse eficazmente para estudiar las interacciones de las células madre.
- Los hallazgos contribuyen a la comprensión de los procesos regenerativos en planarias.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La irradiación parcial de planarias y el trasplante de tejidos permiten una interrogación precisa in vivo de los comportamientos de las células madre adultas, apoyando la reducción mecanicista de riesgos en las fases iniciales del descubrimiento. Estos métodos facilitan el aislamiento y la prueba funcional de subpoblaciones de células madre, aportando información directa para la validación de dianas y el análisis de vías regenerativas. La adopción generalizada de estos protocolos escalables mejora la confianza predictiva en puntos críticos de inflexión dentro de las carteras de medicina regenerativa e investigación y desarrollo de células madre.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la disección funcional de la heterogeneidad de las células madre y su capacidad regenerativa.
- Apoya la reducción de riesgos mecanicistas mediante el aislamiento de factores autónomos y no autónomos respecto a la célula.
- Facilita la validación basada en hipótesis de dianas regenerativas en un sistema in vivo manejable.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Proporciona una preparación reproducible de modelos de planarias para ensayos funcionales posteriores.
- Normaliza los protocolos de irradiación parcial y trasplante para obtener lecturas cuantitativas.
- Permite la generación escalable de animales para estudios de repoblación o ablación de alto rendimiento.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Se alinea con las estrategias traslacionales de biomarcadores al permitir el seguimiento in vivo del destino de las células madre.
- Facilita la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica de los mecanismos regenerativos.
- Reduce la ambigüedad biológica en los modelos de reparación tisular impulsados por células madre.
Integración de la Línea de Procesamiento y Flujo de Trabajo
Estos protocolos sitúan a los modelos planarios como un puente desde el descubrimiento inicial hasta la identificación de candidatos prometedores en las líneas de investigación sobre regeneración y células madre.
- Biología del Descubrimiento: Aísla e investiga subpoblaciones de células madre para esclarecer las vías regenerativas.
- Cribado Proporciona modelos estandarizados y reproducibles para la evaluación cuantitativa de la función de las células madre.
- Análisis: Permite la hibridación in situ en preparaciones completas para el análisis espacialmente resuelto de marcadores de células madre.
- Investigación traslacional Proporciona una plataforma para evaluar las influencias celulares autónomas y ambientales sobre la regeneración.
- Reutilización Empresarial: Establece protocolos escalables y de alta eficacia para uso repetido en programas de biología regenerativa.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de dianas celulares y en los estudios sobre mecanismos regenerativos.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad, escalabilidad y capacidad de procesamiento de ensayos funcionales in vivo.
- Valor estratégico: Permite tomar decisiones sólidas de continuar/descartar al reducir la incertidumbre mecanicista en programas de etapa temprana.
- Impacto en la cartera: Facilita la priorización ajustada al riesgo de candidatos terapéuticos regenerativos y basados en células madre.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo, inmovilización y técnicas de microdisección de planarias.
- Necesita acceso a equipos de irradiación con rayos X y blindaje de plomo para ablación parcial.
- Exige protocolos estandarizados para la reproducibilidad entre equipos y la comparabilidad de datos.
- La adaptación a otros sistemas modelo puede requerir optimización y validación del protocolo.
- El rendimiento está limitado por los pasos manuales, aunque los protocolos están optimizados para eficiencia y escala.
