En electroporación in ovo en el mesencéfalo polluelo para estudiar la función génica en el desarrollo neuronal dopaminérgica

Este experimento demuestra la electrotransferencia in ovo en el mesencéfalo de embriones de pollo para estudiar el efecto de la expresión génica exógena en el desarrollo del mesencéfalo y en la diferenciación de neuronas dopaminérgicas. Primero, inyecte el mesencéfalo de embriones de pollo en la etapa 11 según la escala de Hamburger-Hamilton con el plásmido de ADN deseado, con el fin de dirigir específicamente el ADN exógeno hacia la vesícula mesencefálica en desarrollo. Luego, utilizando electrodos pequeños personalizados, electrotransfiera la vesícula mesencefálica para introducir el ADN exógeno específicamente en los progenitores neurales del mesencéfalo.

A continuación, coseche embriones en la etapa 23 con buena expresión de M cherry en el mesencéfalo y genere secciones transversales óptimas del mesencéfalo. En última instancia, el análisis de inmunotinción para marcadores de neuronas dopaminérgicas, como la tirosina hidroxilasa, puede mostrar la diferenciación de progenitores neurales en neuronas dopaminérgicas maduras inducida por la expresión de genes de interés. La principal ventaja de esta técnica frente a otros métodos existentes de electroforesis in ovo es que este protocolo puede lograr una electroforesis específica de membrana para estudiar la diferenciación de neuronas dopaminérgicas.

Aunque este método puede proporcionar información sobre el desarrollo del mesencéfalo, también puede aplicarse a otras partes del sistema nervioso para realizar análisis de mapas de destino y para investigar la regulación de la expresión génica. Para obtener embriones en la etapa 11 de Hamburger-Hamilton, coloque cada huevo fertilizado de lado y marque la parte superior con una raya de lápiz. Luego, coloque las bandejas sobre un agitador en un incubador humedecido y precalentado.

Verifique la humedad y el nivel de agua cada 24 horas a las 41 horas posteriores a la fertilización. Retire los huevos del incubador y guárdelos a temperatura ambiente. Limpie la superficie de cada huevo con etanol al 70 % y séquelos.

Ahora coloque dos trozos de cinta adhesiva de cuatro centímetros uno al lado del otro sobre un huevo para formar un rectángulo grande sobre la marca de lápiz. Alise la cinta contra el huevo para enmarcar la ventana con una jeringa de 10 mililitros conectada a una aguja de calibre 18. Perfore la cáscara del huevo inclinando la aguja lejos de la yema para no perturbar ni dañar el embrión.

Extraiga cinco mililitros de albúmina del huevo. Limpie la aguja con etanol al 70%. Seque la aguja antes de perforar el siguiente huevo.

Introduzca la configuración para el extractor de micropipetas marrón con llama. Luego, estire tubos capilares de pared delgada para formar agujas de inyección con una pipeta P 10. Aspire entre cinco y diez microlitros de solución de plásmido en la punta de una micropipeta capilar de punta larga.

Luego cargue lentamente la aguja de vidrio en una columna continua, sin burbujas de aire. Coloque la aguja cargada en el portaagujas unido al micromanipulador y al microinyector. Ahora, bajo un microscopio de disección y utilizando un fondo oscuro para visualizar mejor la aguja, corte la aguja en el punto donde el líquido verde termina, usando tijeras de resorte.

Corte una ventana de dos a dos centímetros y medio de diámetro a partir del orificio anterior de la aguja. Para extraer la albúmina. Gire el huevo con una mano mientras corta.

Recuerde limpiar las tijeras con una toallita kim impregnada con etanol al 70 % entre cada huevo. Proceda a observar el embrión de pollo bajo un microscopio de disección. Si es necesario, visualice el embrión inyectando tinta de la India al 20 % filtrada a 0,22 micrómetros en PBS debajo del embrión de pollo. Coloque el embrión paralelo al trayecto de la aguja, con la cabeza orientada en dirección opuesta a la aguja.

Perfore lentamente el tubo neural con un ángulo de 45 grados en la unión entre el mesencéfalo y el rombencéfalo. Comience la inyección utilizando los microinyectores pico spritzer con la Duración ajustada a 25 milisegundos. Ajuste el tiempo según sea necesario y solo llene la vesícula neural que representa el mesencéfalo con ADN plasmídico que contenga el colorante verde rápido.

Después de retirar la aguja de inyección, coloque tres gotas de solución de penicilina-estreptomicina sobre el embrión. Verifique la configuración del electro porador B-T-X-E-M-C ocho 30 para una electro poración eficiente. En la posición del mesencéfalo ventral, coloque los pequeños electrodos de platino personalizados en forma de L al mismo nivel horizontal que la base del tubo neural, de modo que el mesencéfalo embrionario quede centrado entre los dos electrodos.

Pulse el interruptor de pedal BTX una vez y observe las burbujas de aire generadas alrededor de los electrodos. Tras cada electrotransferencia exitosa, retire cuidadosamente los electrodos del huevo y límpielos. Con una toallita química impregnada en etanol al 70 %, coloque otras tres gotas de solución de penicilina-estreptomicina sobre el embrión.

Ahora cubra la ventana con un trozo de cinta adhesiva transparente de embalaje de cinco centímetros por cinco centímetros. Sin tocar el contenido del huevo, selle bien el huevo y coloque los huevos nuevamente en el incubador con las plataformas giratorias apagadas. Cuando se alcance la etapa deseada, recolecte los embriones vivos en una placa de Petri común llena de PBS para cada condición.

A continuación, un microscopio de disección fluorescente. Examine los embriones recolectados en busca de expresión de mCherry y transfiera los embriones positivos a pozos individuales de una placa de 24 pozos. Añada a cada pozo un mililitro de paraformaldehído al 2% recién preparado e incube durante tres horas a cuatro grados centígrados.

Lave los embriones fijados en PBS 3 veces; coloque los embriones en sacarosa al 15% hasta que se hundan tras la equilibración. Repita la equilibración en sacarosa al 30%, luego incluya cada embrión en OCT, orientando adecuadamente los embriones para generar cortes transversales óptimos del mesencéfalo para los análisis posteriores.

Prepare secciones de 18 micrones de grosor mediante criostato del mesencéfalo grueso para análisis posteriores en el ensayo de electroforesis en ovo del mesencéfalo de embrión de pollo. Se inyecta en embriones de pollo en estadio 11 un cóctel de plásmidos que contiene el marcador fluorescente mCherry, los genes de interés y un trazador teñido con verde rápido para seguir el proceso de inyección. Tras la electroforesis del mesencéfalo, los embriones se incuban adicionalmente y se recolectan aquellos positivos para mCherry, los cuales se fijan e incluyen.

Luego se preparan secciones criostáticas del mesencéfalo. Las muestras se analizan mediante tinción inmunohistoquímica con marcadores del mesencéfalo, como la tirosina hidroxilasa, en embriones de pollo inyectados y electroporados con éxito. La expresión de mCherry generalmente es visible en la región del mesencéfalo tras un desarrollo adicional, utilizando la expresión de mCherry como marcador de inyección.

Los embriones que exhiben una expresión adecuada de m-cherry se fijan, incluyen e orientan luego para preparar secciones criológicas del mesencéfalo. Aquí, la especificación del destino dopaminérgico en progenitores neurales electroporados se examina mediante la colocalización de m-cherry y el gen marcado con flag con el marcador de neuronas dopaminérgicas tirosina hidroxilasa. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo restringir regionalmente la expresión génica a los progenitores de neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo embrionario, incluyendo cómo inyectar construcciones de ADN específicamente en la región del mesencéfalo y cómo precisar la electroporación utilizando electrodos pequeños hechos a medida siguiendo este procedimiento.

Otros métodos, como el bloqueo mediado por RNI o la expresión de potenciadores vinculados a genes reporteros, pueden utilizarse para estudiar la función génica y la regulación génica en regiones específicas y tipos celulares del sistema nervioso.