Generación de una línea murina Inmortalizado microvascular cerebral célula endotelial como

El objetivo general de este procedimiento es obtener un cultivo homogéneo de células endoteliales cerebrales inmortalizadas. Esto se logra primero aislando los cerebros de ratones neonatos y obteniendo una suspensión simple de células. El segundo paso consiste en inmortalizar las células con el antígeno T medio del polioma.

A continuación, las células crecen durante aproximadamente cuatro semanas hasta que se forma una monocapa endotelial homogénea. El paso final consiste en caracterizar la nueva línea celular utilizando técnicas como tinción inmunológica, inmunotransferencia (Western blot) y Q-Q-P-C-R. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de trastornos cerebrales neuroinflamatorios o isquémicos, ya que pueden obtenerse evaluaciones preclínicas de tratamientos y conocimientos sobre la fisiopatología.

La doctora Elaine Salvador, investigadora postdoctoral de mi laboratorio, demostrará el procedimiento. Después de extraer el cerebro de un ratón neonato de tres a cinco días de edad y transferirlo a una placa de Petri que contiene tampón A, se requieren los cerebros de cinco a 10 ratones para cada preparación, trabajando bajo una cabina de flujo laminar. Retire el cerebelo, el tronco encefálico, las meninges y los fragmentos capilares de cada cerebro.

Luego, transfiera los cerebros a una segunda placa de Petri que contenga tampón A. Utilice un escalpelo estéril para cortar los cerebros en trozos pequeños y luego use una pipeta de 10 mililitros para aspirar y expulsar el tejido y el tampón hasta que no aparezcan grumos. En este punto, transfiera la suspensión a un tubo cónico de 50 mililitros tras centrifugar el tejido cerebral a 250 ×g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Descarte el sobrenadante y disuelva el sedimento en 4,5 mililitros de tampón A con 1,5 mililitros de 0,75 % peso por volumen.

Colagenasa dis pace. Incube el tejido y la solución de colagenasa durante 45 minutos en un baño de agua a 37 grados Celsius con agitación ocasional. Mientras tanto, prepare las placas de cultivo celular recubriendo cuatro pocillos de una placa de 12 pocillos con una solución estéril de 0,1 miligramos por mililitro.

El colágeno cuatro y el ácido acético 50 milimolar permiten que el colágeno se adhiera a las cavidades a temperatura ambiente durante una hora. Una vez transcurrido el período de incubación de 45 minutos, detenga la digestión del tejido cerebral añadiendo 15 mililitros del tampón A y resuspenda completamente el precipitado en esta solución. A continuación, centrifugue a 250 ×g durante 10 minutos y deseche el sobrenadante.

A continuación, para eliminar la mielina de la preparación, agregue 10 mililitros de BSA al 25% peso por volumen, estéril, en PBS al tejido y centrifugue a 1000 × g durante 20 minutos a 4 °C. Tras la centrifugación, deseche cuidadosamente el sobrenadante y luego disuelva el sedimento en 15 mililitros de tampón A y transfiera a un tubo cónico fresco de 50 mililitros; centrifugue nuevamente a 250 × g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Mientras tanto, lave la placa recubierta con colágeno tipo IV dos veces con PBS.

Después del segundo lavado, deje dos pozos vacíos y agregue dos mililitros de medio de crecimiento a los otros dos pozos. Después de desechar el sobrenadante, re suspenda el botón celular, que está compuesto principalmente por células endoteliales, en cuatro mililitros de medio de crecimiento que contenga cuatro microgramos por mililitro de puromicina, y siembre dos mililitros de la suspensión celular en cada uno de los dos pozos vacíos recubiertos con colágeno. Incube a 37 grados Celsius durante 45 minutos para eliminar las células no endoteliales que se adhieren rápidamente. A continuación, aspire el medio de crecimiento de los dos pozos que no contienen células y deséchelo.

Luego, transfiera el medio que contiene las células no adheridas, el cual incluye la fracción de células endoteliales, a estos dos pozos. Rellene los pozos anteriores con dos mililitros de medio fresco. Estos pozos contienen otros tipos celulares, como fibroblastos y astrocitos, y pueden cultivarse en paralelo y utilizarse para comparaciones de la morfología.

Incubar las células durante la noche en el incubador de cultivo de tejidos al día siguiente. Reemplazar con medio fresco y cultivar los fibroblastos GPE neo, que secretan un virus deficiente en replicación con el oncogén T medio de polioma en matraces recubiertos con gelatina que contienen GPE neomed. La transfección con el oncogén T medio de polioma provoca una ventaja de crecimiento de las células endoteliales frente a las células no endoteliales, lo que lleva a una monocapa homogénea de células con morfología endotelial. Después de cuatro a seis semanas de cultivo, las células GPE neo no están disponibles comercialmente y pueden obtenerse como material público compartido.

Después de cultivar el GPE Neo Fiberblast durante 24 horas, retire 10 mililitros del medio y agregue solución estéril de poli cerebro hasta una concentración final de ocho microgramos por mililitro. Pase la mezcla de sobrenadante a través de un filtro de 0,45 micrones para eliminar cualquier fragmento celular. Ahora aspire el medio de los cultivos de células endoteliales y agregue dos mililitros de la mezcla de sobrenadante de poli cerebro a los pocillos tras incubar durante la noche.

Repita este procedimiento al día siguiente con una nueva alícuota de la mezcla poli-cerebral del sobrenadante. Retire la mezcla poli-cerebral del sobrenadante. Lave las células dos veces con PBS y luego agregue medio de crecimiento fresco.

Continúe cambiando el medio de crecimiento cada tres días cuando las células alcancen la confluencia. Pase las células de uno a dos en placas recubiertas con colágeno. Se obtienen líneas celulares endoteliales cerebrales estables típicamente después de cuatro a cinco semanas de cultivo subsiguiente.

Cuando una monocapa endotelial homogénea cubra completamente todo el pocillo. Una vez obtenidas las líneas celulares estables, transfiera a frascos de cultivo de tejidos recubiertos con colágeno IV y pase las células no más de una vez por semana mediante tripsina con tres mililitros de tripsina-EDTA e incubación a 37 grados Celsius durante cinco a 15 minutos hasta que la capa celular se disperse. Tras la adición de cinco mililitros de medio, siembre en los nuevos frascos y evite divisiones superiores a 1:4.

Una vez que hay suficientes células para obtener un frasco T 75 confluyente, se pueden preparar alícuotas criogénicas de células para su uso posterior. Para ello, recolecte las células con tripsina como antes, luego centrifugue la suspensión celular a 250 × g durante cinco minutos. A temperatura ambiente, re-suspenda el sedimento celular en seis mililitros de medio de congelación, luego pipetee 1,5 mililitros de la suspensión celular en cuatro viales criogénicos.

Coloque los viales criogénicos en un recipiente de congelación Nalgene lleno con isopropanol y déjelos durante un día a menos 80 grados Celsius. Finalmente, almacene los viales criogénicos bajo nitrógeno líquido. Evapore el cuadrante criogénico de células en un baño de agua y luego transfiéralos a un tubo cónico de 15 mililitros que contenga 10 mililitros de medio de crecimiento.

Precalentar el medio a 37 grados Celsius y centrifugar el tubo a 250 ×g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de aspirar el medio, resuspender el precipitado en un volumen adecuado de medio de crecimiento. Transferir la suspensión celular a un frasco de cultivo celular T 25 recubierto con colágeno tipo IV que contenga medio de crecimiento precalentado.

La densidad celular para la siembra debe ser de al menos una vez 10 a la cuarta células por mililitro. Cambie el medio al día siguiente y continúe haciendo los pasajes celulares como antes, cuando las células alcancen confluencia aproximadamente cinco días después, momento en el cual siembre las células a la densidad deseada para sus experimentos posteriores. Las células C end fueron caracterizadas mediante tinción inmunológica de marcadores endoteliales y de la barrera hematoencefálica.

Esta imagen muestra la morfología de las células C y la tinción inmunológica para clain cinco. Las células C presentan una morfología similar a la de cultivos primarios de ECS cerebrales, con monocapas de células alargadas estrechamente empaquetadas que exhibieron inhibición del crecimiento. En estado de confluencia, las células expresaron niveles detectables de clain.

Aquí, las células CN del C han sido inmunomarcadas con un anticuerpo contra la ocludina. Aquí observamos la expresión de las proteínas de cadherina VE, que se localizan en las uniones entre células, nuevamente, como se muestra mediante tinción de inmunofluorescencia. La resistencia eléctrica transendotelial se midió utilizando un ensamblaje que contiene electrodos de paso de corriente y de medición de voltaje.

Puede observarse en esta figura que la resistencia eléctrica transendotelial de las células C end aumenta con el tiempo en cultivo después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia exploraran trastornos cerebrovasculares en un modelo murino.