Name: Generación de una línea murina Inmortalizado microvascular cerebral célula endotelial como In Vitro Barrera hematoencefálica modelo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Aprende a generar líneas celulares endoteliales cerebrales inmortalizadas de ratón para estudiar la barrera hematoencefálica. Este método permite evaluar terapias preclínicas para trastornos neuroinflamatorios.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Esta investigación fue apoyada por la DFG Deutsche Forschungsgemeinschaft bajo el número de concesión y DFG 315/4-1 FO SFB 688.

1. Aislamiento del cerebro microvasos <ol><li> Para cada preparación utilizan cinco a diez ratones neonatales de cualquier sexo (3-5 días de edad). </li><li> Eutanasia a un ratón de acuerdo a locales IACUC / veterinario recomendaciones, retire inmediatamente el cerebro, y se transfiere a una placa de Petri que contiene la solución siguiente: 15 mM Hepes (pH 7,4), 153 mM NaCl, 5,6 mM KCl, 2,3 mM CaCl 2 x 2H 2 O, 2,6 mM de MgCl 2 x 6H 2 O, 1% (w / v) de BSA (en lo sucesivo denominado tampón como A). </li><li> A menos que se indique otra cosa, todos los procedimientos de aislamiento deben realizarse a temperatura ambiente (RT) (22-24 ° C) bajo la campana de flujo laminar. Cortar el cerebro (cerebro sin cerebelo y tallo cerebral), después de la eliminación de las meninges y los fragmentos capilares, en tampón A usando un escalpelo estéril. Pipetear fragmenta el tejido de arriba abajo usando una pipeta de 10 ml hasta que no queden grumos aparecen. Transferir la suspensión a un tubo Falcon de 50 ml y centrifugar a 250 xg durante 5 min a TA. </li></ol> Nota: Meninges puede ser identificado como membranas delgadas y transparentes en la superficie del tejido cerebral. Pueden retirarse cuidadosamente con pinzas estériles. <ol start="4"><li> Eliminar el sobrenadante. </li><li> Disolver el precipitado en 4,5 ml de Tampón A con 1,5 ml de 0,75% (w / v) de colagenasa / dispasa (Roche) y se incuba durante 45 min a 37 ° C en un baño de agua (ocasionalmente agitación). </li><li> Mientras tanto, preparar las placas de 12-pocillos por recubrimiento de cuatro pocillos con colágeno IV (0,1 mg / ml disuelto en ácido acético 50 mM). Permitir que se adhieran durante 1 hr. </li><li> Detener la digestión mediante la adición de 15 ml de tampón enfriado con hielo A. Resuspender el precipitado completamente. </li><li> Centrifugar la suspensión a 250 xg durante 10 min a TA. </li><li> Eliminar el sobrenadante. </li><li> Para quitar la mielina, añadir 10 ml 25% (w / v) de BSA (Sigma, pureza&gt; 98%) y se centrifuga a 1.000 xg durante 20 min a 4 ° C. 25% de BSA se debe disolver en 1x PBS (PAA Laboratories) y se filtró a través de f 0,2 milter). </li><li> Con cuidado, descartar el sobrenadante, disolver el precipitado en 10 ml de tampón A y transferir a un nuevo tubo Falcon. </li><li> Centrifugar la suspensión a 250 xg durante 5 min a TA. El sedimento resultante contiene las células endoteliales. </li><li> Lavar dos veces el colágeno IV recubierto 12-así placa con PBS. </li><li> Resuspender el sedimento en 4 ml de medio de crecimiento (DMEM que contenía 10% de FCS, penicilina 50U/ml / estreptomicina, 1% de L-glutamina) y la placa de la suspensión celular en dos pocillos de 2 ml a cada pocillo. Añadir la puromicina a una concentración final de 4 mg / ml y se incuba durante 45 min a 37 ° C en una incubadora de cultivo celular. Este paso permite la eliminación de células que se adhieren rápidamente Nota:. Puromicina se añade durante 24 horas. Sólo cerebro ECs puede metabolizar, para otros tipos de células puromicina es tóxico 14. </li><li> Pasar el medio que contiene 2 ml de células no adheridas de paso 1,14 en dos pocillos frescos (estos pocillos contienen la fracción CE). Llenar los pocillos con células adheridas de step 1,14 con 2 ml de medio fresco (estos pocillos contienen otros tipos de células, por ejemplo, fibroblastos, astrocitos y se puede cultivar en paralelo y se utiliza para la comparación de la morfología). </li><li> Cambiar el medio al día siguiente. </li></ol> 2. Inmortalizando el cerebro células endoteliales microvasculares <ol><li> Cultivar la GP + E-86 Neo (GPENeo) 15 secretoras de fibroblastos, un virus deficiente en la replicación con polioma medio oncogén T en medio DMEM que contiene 10% FCS inactivado por calor, 50U/ml penicilina / estreptomicina, y 2 mg / ml de G418 ( . PAA Laboratories) en matraces recubiertos de gelatina Nota: polioma medio de transfección oncogén T provoca ventaja de crecimiento de las EC sobre los no-ECS que conduce a una monocapa homogénea de células con morfología endotelial 4 a 6 semanas de cultivo. GPENeo no están disponibles comercialmente y se pueden obtener como material pública compartida (por favor refiérase a las publicaciones originales 4,16). </li><li> Para usar el medio que contiene el virus de<html> inmortalización, cultivar las células en G418 GPENeo libre de mediano durante 24 h. </li><li> Eliminar 10 ml del sobrenadante y añadir GPEneo Polybrene (bromuro de hexadimetrina) (Sigma) a una concentración final de 8 mg / ml, esterilizar a través de filtros de 0,45 micras para eliminar los fragmentos celulares. </li><li> Retire el medio de cultivo de las culturas comunitarias preparadas en la parte 1 y añadir 2 ml de sobrenadante GPEneo / Polybrene mezcla en los pocillos. Repita al día siguiente utilizando un sobrenadante fresco GPEneo / Polybrene mezcla Nota:. Polybrene se utiliza para hacer los poros en la pared celular para facilitar la infección con las partículas víricas). </li><li> Eliminar el sobrenadante GPEneo / Polybrene mezcla el día siguiente, se lavan las células dos veces con PBS y mantener las células en el medio de crecimiento cambiantes que cada 3 días. Al confluencia, dividir las celdas 1:2 en colágeno IV placas recubiertas. </li><li> Típicamente, estables cerebrales endoteliales (CEND) líneas de células se debe obtener 4-5 semanas más tarde. </li></ol>e &quot;&gt; 3. Cultivar las células endoteliales microvasculares del cerebro <ol><li> Descongelar las células de cryoaliquot en un baño de agua y la transferencia de 15 ml-Falcon de 10 ml pre-calentado medio. </li><li> Centrifugar la suspensión a 250 xg durante 5 min a TA. </li><li> Eliminar el medio, transferir el precipitado en el colágeno IV T revestido 25 cm 2 frasco de cultivo celular con medio de crecimiento pre-calentado (densidad celular para el revestimiento debe ser de al menos 1 x 10 4 células / ml). </li><li> Cambio de medio al día siguiente y después de que las células alcanzaron la confluencia (generalmente después de 5 días) dividir las celdas. </li></ol> 4. La división de las células CEND (Nota: La división debe hacerse sólo una vez por semana, evitar la división superior de 1:4). <ol><li> Eliminar el medio, se lavan las células con PBS. </li><li> Añadir 3 ml de tripsina-EDTA caliente solución (PAA Laboratories) (T 75 cm 2 matraz), se incuba a 37 ° C y espere hasta que la capa de células se dispersa (generalmente dentro de 5 a 15 min). </li><li> Añadir 5 ml omedio f crecimiento, pipetear arriba y abajo, y la transferencia a un nuevo colágeno IV recubierto matraz. </li></ol> 5. La congelación de las células CEND <ol><li> Obtener la suspensión de células como se describe en el paso 4 </li><li> Centrifugar la suspensión a 250 xg durante 5 min a TA. </li><li> Resuspender el sedimento celular (obtenido a partir de 1 T 75 cm 2 matraz) en 6 ml de medio de congelación (95% medio de crecimiento, 5% de DMSO). </li><li> Divida la suspensión de células en 1,5 ml cuatro alícuotas crio-Nota:. Crio-Una alícuota se pueden sembrar en T 25 cm 2 frasco. </li><li> Guarde los crio-alícuotas en nitrógeno líquido a temperatura de vapor. </li></ol> CEND medio de crecimiento: 450 ml de DMEM, 10% FCS, 10 ml de L-glutamina, 2% MEM-Kit, 2% NEAA, 10 piruvato natrium ml, 50 U / ml de penicilina / estreptomicina 6. Los resultados representativos Las células CEND y cerebEND se caracteriza por inmunotinción de una endotelialnd BBB marcadores, así como por mediciones de la resistencia eléctrica transendotelial (TEER) y la permeabilidad. El CEND y cerebEND tenían una morfología similar a cultivos primarios de cerebro ECS, con monocapas de células alargadas estrechamente empaquetados que mostraron inhibición del crecimiento a la confluencia. Las células expresaron niveles detectables de bien claudin-5, ocludina y cadherina VE proteínas que se localizan en las uniones célula-célula, como se muestra por inmunofluorescencia (Figura 3) 4,5. El cultivo de células CEND en el suero reducida medio resultó en un aumento de la TEER (de 150 Ωcm 2 en presencia de 10% de suero a 500 Ωcm 2 en presencia de 2% de suero), que fue potenciada por la adición de hidrocortisona (800 Ωcm 2) o insulina (1.000 Ωcm 2) 4. Monocapas de CEND cultivadas en suero reducida medio durante 21 días tenía TEER de 900 Ωcm 2 (Figura 4). TEER se midió utilizando un conjuntoque contienen electrodos de corriente y voltaje de paso de medición-(World Precision Instruments). Para la comparación, el principal microvascular cerebral ECs se ha informado que tienen valores de TEER de 200-600 Ωcm 2 y una línea celular de ratón comercialmente disponible bEnd.3 tenía TEER valores de 100-140 Ωcm 2 (para una revisión reciente ver Abbot 2005 y Toth et al., 2011 17,18). Además, el paso de macromoléculas, tales como no cargado FITC-dextranos de masas moleculares 4, 10, 70 y 500 kDa, o con fluoresceína (300 Da) a través de la monocapa de CEND en medio de diferenciación 2% de FCS durante 4 h se redujo en comparación con las células de control mantenidos en medio de crecimiento que contiene 10% de FCS: flujo paracelular se redujo a 30% de las células de control para la fluoresceína, a 26% de FITC-dextrano 10 y 70 kDa, y el flujo se redujo a 4,5% de las células de control para FITC -dextrtan 500 kDa. Similar a TEER valores, la permeabilidad era al nivel más bajo en las células cultivadas en presencia de glucocorticoids (GC) 4. En otros estudios, se identificaron los genes diana de glucocorticoides, ocludina, claudin-5 y VE-cadherina en el endotelio vascular cerebral 4,7,9. Tratamiento GC llevado a un aumento en la expresión de estas proteínas y a la reordenación de la VE-cadherina con el citoesqueleto. El GC directa mediada por la regulación de proteínas apretado cruce occludin y claudina 5 aparece a través de los elementos de respuesta GC en sus regiones promotoras 4,7,19. Además, claudin-5 fue identificado como un objetivo estrógeno novela en endotelio vascular 10. Subyace en la disfunción endotelial muchas enfermedades diferentes. Hemos cultivado la CEND bajo oxígeno / privación de glucosa (OGD) condiciones. OGD condujo a la interrupción de la función BBB, que podría ser reconstituido después del tratamiento combinado con GC y el proteasoma bortezomib inhibidor 12. Condiciones OGD condujo a un fuerte aumento en la captación de glucosa y en la expresión de transpor glucosatros en cerebEND, que podría ser atenuada por la adición de MK801, un inhibidor no competitivo de NMDA-receptor 13. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig1.jpg" /> Figura 1. Morfología de las células endoteliales microvasculares del cerebro (CEND) una semana después del aislamiento. Fotografías de microscopía de luz se tomaron bajo el 6x (A) y 15x (B) aumentos. Las colonias formadas isla de células endoteliales son visibles. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig2.jpg" /> Figura 2. Morfología de las células endoteliales microvasculares del cerebro (CEND) un mes después del aislamiento y la inmortalización. Imágenes de microscopía de luz se tomaron bajo la ampliación de 15x. Una monocapa confluente, homogénea de células endoteliales puede ser observado. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig3.jpg" /> Figura 3. Inmortalizado cerebro microvascular células endoteliales expresan claudin-5, ocludina y cadherina VE. CEND células fueron cultivadas en colágeno IV cubreobjetos recubiertos y se tiñeron con anticuerpos contra claudin-5 (A), la ocludina (B) y VE-cadherina (C). Las imágenes fueron tomadas con un microscopio Zeiss Axioscop2 bajo el aumento de 40x. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig4.jpg" /> Figura 4. Medición de la resistencia eléctrica transendotelial (TEER) de CEND monocapa. CEND fueron cultivadas en colágeno IV recubiertos filtros transwell (tamaño de poro de 0,4 micras). Después de alcanzar la confluencia, las células se mantuvieron en medio que contenía 2% de FCS. TEER se midió después de 7 días, 14 y 21 utilizando un conjunto que contiene los electrodos de corriente y tensión de medición pasajeras.

<ol><li>Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurobiol.+Exp+%28Wars%29%22%5BJournal%5D)">In vitro models of the blood-brain barrier.</a> Acta Neurobiol. Exp (Wars). 71, 113(2011).</li>
<li>Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+hydrocortisone+and+TNFalpha+on+tight+junction+proteins+in+an+in+vitro+model+of+the+human+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Differential effects of hydrocortisone and TNFalpha on tight junction proteins in an in vitro model of the human blood-brain barrier.</a> J. Physiol. 586, 1937(2008).</li>
<li>Weksler, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier-specific+properties+of+a+human+adult+brain+endothelial+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB.+J%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line.</a> FASEB. J. 19, 1872(2005).</li>
<li>Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occludin+as+direct+target+for+glucocorticoid-induced+improvement+of+blood-brain+barrier+properties+in+a+murine+in+vitro+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Occludin as direct target for glucocorticoid-induced improvement of blood-brain barrier properties in a murine in vitro system.</a> J. Physiol. 565 (Pt 2), 475(2005).</li>
<li>Silwedel, C., Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+susceptibility+of+cerebral+and+cerebellar+murine+brain+microvascular+endothelial+cells+to+loss+of+barrier+properties+in+response+to+inflammatory+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Differential susceptibility of cerebral and cerebellar murine brain microvascular endothelial cells to loss of barrier properties in response to inflammatory stimuli.</a> J. Neuroimmunol. 179, 37(2006).</li>
<li>Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoid+effects+on+mouse+microvascular+endothelial+barrier+permeability+are+brain+specific%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoid effects on mouse microvascular endothelial barrier permeability are brain specific.</a> J. Physiol. 573 (Pt 2), 413(2006).</li>
<li>Burek, M., Forster, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+the+murine+claudin-5+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of the murine claudin-5 promoter.</a> Mol. Cell Endocrinol. 298, 19(2009).</li>
<li>Forster, C., Kahles, T., Kietz, S., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dexamethasone+induces+the+expression+of+metalloproteinase+inhibitor+TIMP-1+in+the+murine+cerebral+vascular+endothelial+cell+line+cEND%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Dexamethasone induces the expression of metalloproteinase inhibitor TIMP-1 in the murine cerebral vascular endothelial cell line cEND.</a> J. Physiol. 580 (Pt.3), 937(2007).</li>
<li>Blecharz, K. G., Drenckhahn, D., Forster, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoids+increase+VE-cadherin+expression+and+cause+cytoskeletal+rearrangements+in+murine+brain+endothelial+cEND+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoids increase VE-cadherin expression and cause cytoskeletal rearrangements in murine brain endothelial cEND cells.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 28, 1139(2008).</li>
<li>Burek, M., Arias-Loza, P. A., Roewer, N., Forster, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Claudin-5+as+a+novel+estrogen+target+in+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Claudin-5 as a novel estrogen target in vascular endothelium.</a> Arterioscler. Thromb Vasc. Biol. 30, 298(2010).</li>
<li>Blecharz, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoid+effects+on+endothelial+barrier+function+in+the+murine+brain+endothelial+cell+line+cEND+incubated+with+sera+from+patients+with+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mult.+Scler%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoid effects on endothelial barrier function in the murine brain endothelial cell line cEND incubated with sera from patients with multiple sclerosis.</a> Mult. Scler. 16, 293(2010).</li>
<li>Kleinschnitz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoid+insensitivity+at+the+hypoxic+blood-brain+barrier+can+be+reversed+by+inhibition+of+the+proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoid insensitivity at the hypoxic blood-brain barrier can be reversed by inhibition of the proteasome.</a> Stroke. 42, 1081(2011).</li>
<li>Neuhaus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+NMDA-receptor+antagonist+MK801+during+oxygen%2Fglucose+deprivation+moderately+attenuates+the+upregulation+of+glucose+uptake+after+subsequent+reoxygenation+in+brain+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Addition of NMDA-receptor antagonist MK801 during oxygen/glucose deprivation moderately attenuates the upregulation of glucose uptake after subsequent reoxygenation in brain endothelial cells.</a> Neurosci. Lett. 506, 44(2012).</li>
<li>Perriere, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Puromycin-based+purification+of+rat+brain+capillary+endothelial+cell+cultures.+Effect+on+the+expression+of+blood-brain+barrier-specific+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties.</a> J. Neurochem. 93, 279(2005).</li>
<li>Golenhofen, N., Ness, W., Wawrousek, E. F., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+induction+of+the+stress+protein+alpha-B-crystallin+in+vascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression and induction of the stress protein alpha-B-crystallin in vascular endothelial cells.</a> Histochem Cell Biol. 117, 203(2002).</li>
<li>Risau, W., Engelhardt, B., Wekerle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+function+of+the+blood-brain+barrier%3A+incomplete+presentation+of+protein+%28auto-%29antigens+by+rat+brain+microvascular+endothelium+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Immune function of the blood-brain barrier: incomplete presentation of protein (auto-)antigens by rat brain microvascular endothelium in vitro.</a> J. Cell Biol. 110, 1757(1990).</li>
<li>Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+CNS+barriers%3A+evolution%2C+differentiation%2C+and+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Dynamics of CNS barriers: evolution, differentiation, and modulation.</a> Cell Mol. Neurobiol. 25, 5(2005).</li>
<li>Toth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patented+in+vitro+blood-brain+barrier+models+in+CNS+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Recent+Pat.+CNS+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Patented in vitro blood-brain barrier models in CNS drug discovery.</a> Recent Pat. CNS Drug Discov. 6, 107(2011).</li>
<li>Harke, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoids+regulate+the+human+occludin+gene+through+a+single+imperfect+palindromic+glucocorticoid+response+element%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoids regulate the human occludin gene through a single imperfect palindromic glucocorticoid response element.</a> Mol. Cell Endocrinol. 295, 39(2008).</li>
<li>Kiefer, F., Courtneidge, S. A., Wagner, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+properties+of+the+middle+T+antigens+of+polyomaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Oncogenic properties of the middle T antigens of polyomaviruses.</a> Adv. Cancer Res. 64, 125(1994).</li>
<li>Kiefer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+transformation+by+polyomavirus+middle+T+antigen+in+mice+lacking+Src-related+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell transformation by polyomavirus middle T antigen in mice lacking Src-related kinases.</a> Curr. Biol. 4, 100(1994).</li>
<li>Ong, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ShcA+and+Grb2+mediate+polyoma+middle+T+antigen-induced+endothelial+transformation+and+Gab1+tyrosine+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">ShcA and Grb2 mediate polyoma middle T antigen-induced endothelial transformation and Gab1 tyrosine phosphorylation.</a> EMBO J. 20, 6327(2001).</li>
<li>O'Connell, K. A., Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+lymphoid+endothelial+cell+line+immortalized+by+simian+virus+40+binds+lymphocytes+and+retains+functional+characteristics+of+normal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A mouse lymphoid endothelial cell line immortalized by simian virus 40 binds lymphocytes and retains functional characteristics of normal endothelial cells.</a> J. Immunol. 144, 521(1990).</li>
<li>Roux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+gamma-glutamyl+transpeptidase+and+alkaline+phosphatase+activities+in+immortalized+rat+brain+microvessel+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of gamma-glutamyl transpeptidase and alkaline phosphatase activities in immortalized rat brain microvessel endothelial cells.</a> J. Cell Physiol. 159, 101(1994).</li>
<li>Montesano, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+proteolytic+activity+is+responsible+for+the+aberrant+morphogenetic+behavior+of+endothelial+cells+expressing+the+middle+T+oncogene%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Increased proteolytic activity is responsible for the aberrant morphogenetic behavior of endothelial cells expressing the middle T oncogene.</a> Cell. 62, 435(1990).</li>
<li>Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+immortalized+bEnd5+and+primary+mouse+brain+microvascular+endothelial+cells+as+in+vitro+blood-brain+barrier+models+for+the+study+of+T+cell+extravasation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, 315(2010).</li>
<li>Skaper, S. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSkaper%2C+SD+%22Methods+in+Neurosciences%22">Methods in Neurosciences</a>. Conn, M. 2, 1303(1990).</li>
<li>Ishii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombomodulin%2C+an+endothelial+anticoagulant+protein%2C+is+absent+from+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Thrombomodulin, an endothelial anticoagulant protein, is absent from the human brain.</a> Blood. 67, 362(1986).</li>
<li>Minagar, A., Alexander, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+disruption+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mult.+Scler%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier disruption in multiple sclerosis.</a> Mult. Scler. 9, 540(2003).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El procedimiento descrito puede ser utilizado para el aislamiento de microvascular ECs de diferentes cepas de ratón, así como a partir de diferentes cepas de ratón knock-out para estudiar los cambios específicos en la función del endotelio vascular. Como un método de inmortalización se utilizó la transformación con oncoproteína de poliomavirus murino, Polioma medio antígeno T. Se transforma rápidamente inmaduros células endoteliales in vivo e in vitro 20,21,22. Otros métodos de inmortalización de ECs descritos en la literatura incluyen, por ejemplo, la inmortalización con antígeno T grande SV40 de Simian Virus 40 23 vacuolizante, producto del gen E1A del adenovirus 24 o la sobreexpresión de la subunidad catalítica de la telomerasa humana 3. La inmortalización con PYMT es específico para el murino ECs inmaduro, que permite la obtención de un cultivo homogéneo CE de ratones neonatos en un corto tiempo. Inmortalización cambia las propiedades de las células y thE Resultados obtenidos con las líneas celulares inmortalizadas deben compararse con las células primarias o con experimentos in vivo con ratones. PYMT inmortalizada CE se ha descrito para expresar altos niveles de actividad fibrinolítica que resultan de una mayor producción de plasminógeno de tipo uroquinasa activador y disminución de la producción de activador del plasminógeno 25. La comparación directa de PYMT inmortalizada bEND5 línea celular primaria con ECs reveló que tanto en modelos in vitro BBB son muy adecuados para los estudios de adhesión de células T 26. Las líneas celulares establecidas de acuerdo con el procedimiento descrito se puede utilizar en el paso número bajo para mantener las propiedades de barrera por la alta expresión de proteínas de BBB y CE de la unión, como las células pierden estas propiedades durante el envejecimiento. Así, después de la pérdida de propiedades de barrera, la preparación de una nueva línea celular debe ser considerado. Densidad de célula de recubrimiento debe ser alta para ECs, ya que es fundamental para la proliferación celular. Esto debe tenerse en cuenta durante el procedimiento de aislamiento así como el mantenimiento de la inmortalizada ECs. Cada línea celular nuevo deben ser evaluados por sus propiedades de barrera y de posibles contaminantes con otros tipos de células. Monocapas CE pueden ser teñidas con anti-antígeno de músculo galactocerebrósido, anti-proteína ácida fibrilar glial y anti-liso como anticuerpos primarios para excluir la contaminación con los oligodendrocitos, astrocitos y pericitos 4,27. Para descartar la contaminación por vasculatura meningal, la expresión de la trombomodulina puede ser probado, que se expresa en todos los lechos vasculares con la excepción del cerebro 28. Curiosamente, las líneas de células endoteliales microvasculares inmortalizadas aisladas de diferentes regiones del cerebro difieren en sus propiedades de barrera y la susceptibilidad a los estímulos proinflamatorios. Como ejemplo, las líneas cerebEND CEND cerebrales y del cerebelo celulares se pueden mencionar 4,5. CerebEND mostró, en comparacióna CEND, la disminución de los niveles de expresión de los principales componentes del apretado nudo de claudina-1 y ocludina. Sin embargo, los niveles de claudin-3 y -12 fueron mayores en cerebEND. La función de barrera de las células cerebEND sufrido mucho más bajo un tratamiento con el mediador inflamatorio, TNFa que las propiedades de barrera de las células CEND hizo 5. Mayor vulnerabilidad cerebelosa a estímulos inflamatorios, se puede observar in vivo en pacientes con esclerosis múltiple y en su modelo animal experimental encefalomielitis autoinmune 29. Estos hallazgos interesantes muestran la necesidad de generación y caracterización individual en modelos in vitro para diferentes regiones del cerebro, con el fin de mejorar la focalización de medicamentos futuro en el cerebro.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Albúmina de suero bovino (BSA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7906 </td><td> Pureza&gt; 98% </td></tr><tr><td> colágeno IV </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C5533 </td><td> 50 ug / ml en 50 mM de ácido acético </td></tr><tr><td> Colagenasa / dispasa </td><td> Roche </td><td> 10269638001 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco modificado a medio Eagle (DMEM) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D5796 </td><td></td></tr><tr><td> Sulfóxido de dimetilo (DMSO) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D2650 </td><td></td></tr><tr><td> Suero de ternera fetal (FCS) </td><td> PAA Laboratories </td><td> A15110-1333 </td><td> concentración final 10%, inactivado por calor (30 min a 56 ° C) </td></tr&gt; <tr><td> L-glutamina </td><td> Biochrom AG </td><td> K0282 </td><td> Almacenamiento: ≤ -15 ° C </td></tr><tr><td> MEM Vitamine </td><td> Biochrom AG </td><td> K0373 </td><td> Almacenamiento: ≤ -15 ° C </td></tr><tr><td> Na-piruvato </td><td> Biochrom AG </td><td> L0473 </td><td></td></tr><tr><td> Neomicina (G418) </td><td> PAA Laboratories </td><td> P11-012 </td><td></td></tr><tr><td> No aminoácidos esenciales (NEA) </td><td> Biochrom AG </td><td> K0293 </td><td> El almacenamiento a 4 ° C </td></tr><tr><td> Penicilina / Estreptomicina </td><td> Biochrom AG </td><td> A2212 </td><td> Almacenamiento: ≤ -15 ° C </td></tr><tr><td> Salina tamponada con fosfato (PBS) </td><td> Biochrom AG </td><td> L1825 </td><td></td></tr><tr><td> Polibreno (bromuro de hexadimetrina) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 107689 </td><td> 0,8 mg / ml en PBS, el almacenamiento a -20 ° C </td></tr><tr><td> Puromicina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8833 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina / EDTA </td><td> Biochrom AG </td><td> L1825 </td><td> 0,05%, 0,02% de EDTA en PBS </td></tr></tbody></table>

generación de una línea murina inmortalizado microvascular cerebral célula endotelial como<em&gt; in vitro</em&gt; barrera hematoencefálica modelo

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Las células epiteliales y endoteliales (CE) están creando barreras paracelulares que protegen el tejido del entorno externo e interno. La barrera sangre-cerebro (BBB) ​​que consiste en CE, astrocitos pies finales pericitos, y la membrana basal es responsable de la protección y de la homeostasis del parénquima cerebral. En modelos in vitro BBB son herramientas comunes para estudiar la estructura y función de la BBB en el nivel celular. Un número considerable de diferentes modelos in vitro BBB se han establecido para la investigación en laboratorios diferentes hasta la fecha. Generalmente, las células se obtienen de bovino, porcino, de rata o de tejido de cerebro de ratón (discutido en detalle en la revisión por Wilhelm et al. 1). Muestras de tejidos humanos sólo están disponibles en un número limitado de laboratorios o empresas 2,3. Mientras que las preparaciones de células primarias son mucho tiempo y las culturas CE puede variar de lote a lote, el establecimiento de inmortalizada CE lines es el foco de interés científico. A continuación, se presenta un método para establecer una línea microvascular cerebral inmortalizado CE de cerebro de ratón recién nacido. Se describe el procedimiento paso a paso lista de los reactivos y las soluciones utilizados. El método establecido por nuestro laboratorio permite el aislamiento de una homogénea línea inmortalizada de células endoteliales dentro de las cuatro a cinco semanas. Las líneas de células microvasculares endoteliales del cerebro denominada CEND 4 (a partir de la corteza cerebral) y cerebEND 5 (a partir de corteza cerebelosa), se aisló de acuerdo con este procedimiento en el laboratorio Förster y se han usado eficazmente para la explicación de diferentes procesos fisiológicos y patológicos en el BBB. Uso de CEND y cerebEND hemos demostrado que estas células responden a glucocorticoides y estrógenos 4,6-9 tratamiento 10, así como a pro-infammatory mediadores, tales como TNF-alfa 5,8. Por otra parte, se ha estudiado la patología de múltiples sclerosis 11 y 12,13 hipoxia en la CE-nivel. El CEND y líneas cerebEND se puede considerar como una buena herramienta para el estudio de la estructura y función de la BHE, las respuestas celulares de los AE a diferentes estímulos o en la interacción de la CE con linfocitos o células cancerosas.

Este método se describe cómo aislar e inmortalizar las células endoteliales microvasculares de cerebro de ratón. Se describe un protocolo paso a paso a partir de la homogeneización del tejido cerebral, las fases de digestión, la siembra y la inmortalización de las células. Por lo general, toma alrededor de cinco semanas para obtener una homogénea línea inmortalizada de células endoteliales microvasculares.

Generación de una línea murina Inmortalizado microvascular cerebral célula endotelial como<em&gt; In Vitro</em&gt; Barrera hematoencefálica modelo

Las células epiteliales y endoteliales (EC) forman barreras paracelulares que protegen el tejido del entorno externo e interno. El ...

El objetivo general de este procedimiento es obtener un cultivo homogéneo de células endoteliales cerebrales inmortalizadas. Esto se logra primero aislando los cerebros de ratones neonatos y obteniendo una suspensión simple de células. El segundo paso consiste en inmortalizar las células con el antígeno T medio del polioma.A continuación, las células crecen durante aproximadamente cuatro semanas hasta que se forma una monocapa endotelial homogénea. El paso final consiste en caracterizar la nueva línea celular utilizando técnicas como tinción inmunológica, inmunotransferencia (Western blot) y Q-Q-P-C-R. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de trastornos cerebrales neuroinflamatorios o isquémicos, ya que pueden obtenerse evaluaciones preclínicas de tratamientos y conocimientos sobre la fisiopatología.La doctora Elaine Salvador, investigadora postdoctoral de mi laboratorio, demostrará el procedimiento. Después de extraer el cerebro de un ratón neonato de tres a cinco días de edad y transferirlo a una placa de Petri que contiene tampón A, se requieren los cerebros de cinco a 10 ratones para cada preparación, trabajando bajo una cabina de flujo laminar. Retire el cerebelo, el tronco encefálico, las meninges y los fragmentos capilares de cada cerebro.Luego, transfiera los cerebros a una segunda placa de Petri que contenga tampón A. Utilice un escalpelo estéril para cortar los cerebros en trozos pequeños y luego use una pipeta de 10 mililitros para aspirar y expulsar el tejido y el tampón hasta que no aparezcan grumos. En este punto, transfiera la suspensión a un tubo cónico de 50 mililitros tras centrifugar el tejido cerebral a 250 ×g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Descarte el sobrenadante y disuelva el sedimento en 4,5 mililitros de tampón A con 1,5 mililitros de 0,75 % peso por volumen.Colagenasa dis pace. Incube el tejido y la solución de colagenasa durante 45 minutos en un baño de agua a 37 grados Celsius con agitación ocasional. Mientras tanto, prepare las placas de cultivo celular recubriendo cuatro pocillos de una placa de 12 pocillos con una solución estéril de 0,1 miligramos por mililitro.El colágeno cuatro y el ácido acético 50 milimolar permiten que el colágeno se adhiera a las cavidades a temperatura ambiente durante una hora. Una vez transcurrido el período de incubación de 45 minutos, detenga la digestión del tejido cerebral añadiendo 15 mililitros del tampón A y resuspenda completamente el precipitado en esta solución. A continuación, centrifugue a 250 ×g durante 10 minutos y deseche el sobrenadante.A continuación, para eliminar la mielina de la preparación, agregue 10 mililitros de BSA al 25% peso por volumen, estéril, en PBS al tejido y centrifugue a 1000 × g durante 20 minutos a 4 °C. Tras la centrifugación, deseche cuidadosamente el sobrenadante y luego disuelva el sedimento en 15 mililitros de tampón A y transfiera a un tubo cónico fresco de 50 mililitros; centrifugue nuevamente a 250 × g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Mientras tanto, lave la placa recubierta con colágeno tipo IV dos veces con PBS.Después del segundo lavado, deje dos pozos vacíos y agregue dos mililitros de medio de crecimiento a los otros dos pozos. Después de desechar el sobrenadante, re suspenda el botón celular, que está compuesto principalmente por células endoteliales, en cuatro mililitros de medio de crecimiento que contenga cuatro microgramos por mililitro de puromicina, y siembre dos mililitros de la suspensión celular en cada uno de los dos pozos vacíos recubiertos con colágeno. Incube a 37 grados Celsius durante 45 minutos para eliminar las células no endoteliales que se adhieren rápidamente. A continuación, aspire el medio de crecimiento de los dos pozos que no contienen células y deséchelo.Luego, transfiera el medio que contiene las células no adheridas, el cual incluye la fracción de células endoteliales, a estos dos pozos. Rellene los pozos anteriores con dos mililitros de medio fresco. Estos pozos contienen otros tipos celulares, como fibroblastos y astrocitos, y pueden cultivarse en paralelo y utilizarse para comparaciones de la morfología.Incubar las células durante la noche en el incubador de cultivo de tejidos al día siguiente. Reemplazar con medio fresco y cultivar los fibroblastos GPE neo, que secretan un virus deficiente en replicación con el oncogén T medio de polioma en matraces recubiertos con gelatina que contienen GPE neomed. La transfección con el oncogén T medio de polioma provoca una ventaja de crecimiento de las células endoteliales frente a las células no endoteliales, lo que lleva a una monocapa homogénea de células con morfología endotelial. Después de cuatro a seis semanas de cultivo, las células GPE neo no están disponibles comercialmente y pueden obtenerse como material público compartido.Después de cultivar el GPE Neo Fiberblast durante 24 horas, retire 10 mililitros del medio y agregue solución estéril de poli cerebro hasta una concentración final de ocho microgramos por mililitro. Pase la mezcla de sobrenadante a través de un filtro de 0,45 micrones para eliminar cualquier fragmento celular. Ahora aspire el medio de los cultivos de células endoteliales y agregue dos mililitros de la mezcla de sobrenadante de poli cerebro a los pocillos tras incubar durante la noche.Repita este procedimiento al día siguiente con una nueva alícuota de la mezcla poli-cerebral del sobrenadante. Retire la mezcla poli-cerebral del sobrenadante. Lave las células dos veces con PBS y luego agregue medio de crecimiento fresco.Continúe cambiando el medio de crecimiento cada tres días cuando las células alcancen la confluencia. Pase las células de uno a dos en placas recubiertas con colágeno. Se obtienen líneas celulares endoteliales cerebrales estables típicamente después de cuatro a cinco semanas de cultivo subsiguiente.Cuando una monocapa endotelial homogénea cubra completamente todo el pocillo. Una vez obtenidas las líneas celulares estables, transfiera a frascos de cultivo de tejidos recubiertos con colágeno IV y pase las células no más de una vez por semana mediante tripsina con tres mililitros de tripsina-EDTA e incubación a 37 grados Celsius durante cinco a 15 minutos hasta que la capa celular se disperse. Tras la adición de cinco mililitros de medio, siembre en los nuevos frascos y evite divisiones superiores a 1:4.Una vez que hay suficientes células para obtener un frasco T 75 confluyente, se pueden preparar alícuotas criogénicas de células para su uso posterior. Para ello, recolecte las células con tripsina como antes, luego centrifugue la suspensión celular a 250 × g durante cinco minutos. A temperatura ambiente, re-suspenda el sedimento celular en seis mililitros de medio de congelación, luego pipetee 1,5 mililitros de la suspensión celular en cuatro viales criogénicos.Coloque los viales criogénicos en un recipiente de congelación Nalgene lleno con isopropanol y déjelos durante un día a menos 80 grados Celsius. Finalmente, almacene los viales criogénicos bajo nitrógeno líquido. Evapore el cuadrante criogénico de células en un baño de agua y luego transfiéralos a un tubo cónico de 15 mililitros que contenga 10 mililitros de medio de crecimiento.Precalentar el medio a 37 grados Celsius y centrifugar el tubo a 250 ×g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de aspirar el medio, resuspender el precipitado en un volumen adecuado de medio de crecimiento. Transferir la suspensión celular a un frasco de cultivo celular T 25 recubierto con colágeno tipo IV que contenga medio de crecimiento precalentado.La densidad celular para la siembra debe ser de al menos una vez 10 a la cuarta células por mililitro. Cambie el medio al día siguiente y continúe haciendo los pasajes celulares como antes, cuando las células alcancen confluencia aproximadamente cinco días después, momento en el cual siembre las células a la densidad deseada para sus experimentos posteriores. Las células C end fueron caracterizadas mediante tinción inmunológica de marcadores endoteliales y de la barrera hematoencefálica.Esta imagen muestra la morfología de las células C y la tinción inmunológica para clain cinco. Las células C presentan una morfología similar a la de cultivos primarios de ECS cerebrales, con monocapas de células alargadas estrechamente empaquetadas que exhibieron inhibición del crecimiento. En estado de confluencia, las células expresaron niveles detectables de clain.Aquí, las células CN del C han sido inmunomarcadas con un anticuerpo contra la ocludina. Aquí observamos la expresión de las proteínas de cadherina VE, que se localizan en las uniones entre células, nuevamente, como se muestra mediante tinción de inmunofluorescencia. La resistencia eléctrica transendotelial se midió utilizando un ensamblaje que contiene electrodos de paso de corriente y de medición de voltaje.Puede observarse en esta figura que la resistencia eléctrica transendotelial de las células C end aumenta con el tiempo en cultivo después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia exploraran trastornos cerebrovasculares en un modelo murino.

generation-an-immortalized-murine-brain-microvascular-endothelial

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Establecimiento de modelos humanos de la barrera sangre-cerebro (BBB) ​​puede beneficiar a la investigación de las condiciones del cerebro asociadas con la acreditación fracaso. Se describe aquí una técnica mejorada para la preparación de un modelo de acreditación de contacto, que permite que el cocultivo de astrocitos humanos y las células endoteliales del cerebro en los lados opuestos de una membrana porosa.

Método mejorado para la preparación de una base de células, Contacto Modelo Humano de la barrera hematoencefálica

El objetivo del presente estudio fue validar la reproducibilidad de un modelo de acreditación in vitro que implica una rata singénico co-cultivo de células endoteliales y astrocitos. La monocapa de células endoteliales presentan alta y baja permeabilidad TEER LY. La expresión de proteínas TJ específicos, se evaluaron las respuestas funcionales a la inflamación y la funcionalidad de los transportadores y los receptores.

Establecimiento de un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de Rata barrera hematoencefálica (BBB): Un Enfoque en la acreditación Impermeabilidad y transporte mediado por los receptores

Las células endoteliales microvasculares cerebrales (BMEC) están interconectadas por proteínas de unión específicas que forman una barrera altamente regulada que separa la sangre y el sistema nervioso central (SNC), la llamada barrera hematoencefálica (BBB). El aislamiento de las células endoteliales microvasculares primarias del cerebro murino, como se discute en este protocolo, permite estudios detallados in vitro de la BHE.

Aislamiento de células primaria murino cerebro endoteliales microvasculares

Aquí, describimos un modelo murino in vitro de la barrera hematoencefálica que hace uso de la espectroscopia de células de impedancia, con un enfoque en las consecuencias sobre la integridad y permeabilidad de las células endoteliales al interactuar con las células T activadas.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de la barrera sangre-cerebro mediante Espectroscopia de Impedancia: Un enfoque en la interacción de células T de la célula endotelial

El mantenimiento de la cobertura de la barrera hematoencefálica es clave para la homeostasis del sistema nervioso central. Este protocolo describe técnicas in vitro para delinear los procesos fundamentales y patológicos que modulan la cobertura de la barrera hematoencefálica.

Ensayos in vitro para evaluar la formación y la interrupción de los vasos sanguíneos de barrera hematoencefálica

El objetivo del protocolo es presentar un procedimiento optimizado para el establecimiento de un modelo de barrera blood - brain (BBB) en vitro basado en las células endoteliales de cerebro porcino primario (pBECs). El modelo muestra alta reproducibilidad, alta tensión y es adecuado para estudios de transporte y tráfico intracelular en el descubrimiento de medicamentos.

Mejor método para el establecimiento de un In Vitro Barrera Blood - Brain modelo basado en las células endoteliales de cerebro porcino

La barrera hematoencefálica humana previene selectivamente la penetración de moléculas hidrófilas y patógenos en el cerebro. Varias patologías, incluyendo meningitis y delirio postoperatorio, se asocian con una mayor permeabilidad de la barrera hematoencefálica. Aquí, describimos un modelo de cultivo celular endotelial para probar la permeabilidad de barrera por travesía microbiana.

Análisis de la permeabilidad de la barrera hematoencefálica mediante travesía microbiana a través de células endoteliales microvasculares

La barrera hematoencefálica (BBB) es una unidad neurovascular multicelular que regula estrechamente la homeostasis cerebral. Mediante la combinación de iPSC shumanos y tecnologías de órgano en chip, hemos generado un chip BBB personalizado, adecuado para el modelado de enfermedades y predicciones de penetrabilidad de fármacos del SNC. Se describe un protocolo detallado para la generación y el funcionamiento del chip BBB.

Generación de un chip de barrera hematoencefálica basada en iPSC humana

Este protocolo detalla un método adaptado para derivar, expandir y criopreservar las células endoteliales microvasculares cerebrales obtenidas diferenciando las células madre pluripotentes inducidas por humanos, y para estudiar las propiedades de la barrera hematoencefálica en un modelo ex vivo.

Derivación, expansión, criopreservación y caracterización de células endoteliales microvasculares cerebrales de células madre pluripotentes inducidas por humanos

Aquí, describimos un protocolo, el método de cultivo de células endoteliales extendidas (EECM), que permite la diferenciación de células madre pluripotentes a células similares a células endoteliales microvasculares cerebrales (BMEC). Estas células muestran la expresión de la molécula de adhesión de células endoteliales y, por lo tanto, son un modelo de barrera hematoencefálica humano adecuado para estudiar las interacciones de las células inmunes in vitro.

Diferenciación de células madre pluripotentes inducidas por humanos a células cerebrales similares a células endoteliales microvasculares con un fenotipo inmune maduro

Aprende a generar líneas celulares endoteliales cerebrales inmortalizadas de ratón para estudiar la barrera hematoencefálica. Este método permite evaluar terapias preclínicas para trastornos neuroinflamatorios.

Generación de una línea murina Inmortalizado microvascular cerebral célula endotelial como In Vitro Barrera hematoencefálica modelo (Video) | JoVE Journal

Generación de una línea murina Inmortalizado microvascular cerebral célula endotelial como

Explorar más videos