El aislamiento de los ribosomas polipéptidos nacientes Bound In vitro Para la identificación de sitios de traslación pausa a lo largo del ARNm

El objetivo general de este procedimiento es identificar y localizar los principales sitios de pausa traduccional para un ARNm traducido en un sistema de traducción libre de células. Esto se logra primero clonando el gen de interés bajo el control de un promotor transcripcional T siete. A continuación, el ARNm se transcribe y se purifica.

Luego, se realiza la traducción in vitro en presencia de ARNm y aminoácidos radiactivos para marcar la proteína sintetizada y los polipéptidos en crecimiento. Finalmente, los polisomas se aíslan mediante centrifugación por velocidad de sedimentación, y las cadenas en crecimiento aisladas se separan mediante electroforesis en gel. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran polipéptidos en crecimiento de diferentes longitudes mediante SDS-PAGE tridimensional y autorradiografía, lo que indica la presencia de sitios de pausa a lo largo del ARNm de interés.

La principal ventaja de esta técnica frente a nuestros métodos existentes, como el ensayo de protección de micro núcleos, es que es extremadamente sencilla, rápida y eficiente, y permite la determinación e identificación de los principales sitios de traducción a lo largo de cualquier ARNm en un sistema celular determinado. Este método puede ayudar a responder algunas de las preguntas clave en el campo de la traducción y del plegamiento proteico co-traduccional, como qué factores celulares, por ejemplo el uso de codones, la abundancia de ARNt o la estructura secundaria del ARNm, pueden afectar la cinética de la traducción. Este método podría además mejorar nuestra comprensión de las relaciones entre la cinética de la traducción y los pasos clave en la vía de plegamiento proteico co-traduccional.

La implicación de esta técnica se extiende hacia la comprensión del proceso de plegamiento de proteínas in vivo, el cual se cree ampliamente que ocurre de manera co-traduccional durante la traducción en el ribosoma, aunque el presente estudio involucra la traducción libre de células de gamma bi cristalina utilizando un extracto celular disponible comercialmente. Esta técnica también puede aplicarse para identificar IDE traduccionales en potencialmente cualquier proteína, utilizando un extracto competente para la traducción preparado a partir de cualquier fuente celular. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades en dos pasos clave del protocolo.

El primero consiste en establecer el tiempo total necesario para llevar a cabo la reacción de traducción, lo que garantizaría que la mayoría de los polipéptidos recién sintetizados permanezcan unidos al ribosoma. Y el segundo consiste en encontrar un sistema de electroforesis apropiado para separar la mayoría de los polipéptidos nascentes; la elección del sistema de electroforesis depende del tamaño de la proteína en estudio. Tuvimos por primera vez la idea de este método cuando decidimos analizar la cinética traduccional de las moléculas de globina a mediados de los ochenta, en relación con el modelo propuesto de plegamiento acoplado a la traducción (COT) de la globina.

La no uniformidad de la traducción de la globina fue observada por primera vez por PRO y Maurice en 1974 al utilizar cromatografía de exclusión por tamaño CLO de las cadenas NAS y de globina. Sin embargo, su análisis no poseía la precisión deseable; Pro y otros observaron cuatro sitios principales de pausas durante la traducción de la globina. Posteriormente, nuestro análisis permitió revelar aproximadamente 10 sitios adicionales de pausas y construir un modelo detallado del plegamiento traduccional de la globina. La demostración visual de este método es fundamental, ya que la técnica descrita aquí implica el aislamiento de polisomas y el análisis del polipéptido naciente mediante electroforesis en gel Tri S Ds.

Ambos estos pasos son fundamentales para obtener resultados de alta calidad y reproducibles. La demostración del progel la realizará una estudiante de posgrado del laboratorio Myelo, Sujata For, en la transcripción in vitro de ARN mensajero. Comience con un gen de interés que haya sido clonado bajo un promotor T siete o SP seis; utilizando una enzima de restricción apropiada, linealice la plantilla de ADN aguas abajo del codón de terminación y/o del extremo tres prima del ARNm.

Una muestra de la digestión con enzima de restricción se somete a electroforesis en gel de agarosa para verificar que el ADN se ha linearizado completamente. Tras determinar la concentración óptima de la plantilla de ADN, utilice un kit de transcripción para transcribir in vitro el ARN mensajero según las instrucciones del fabricante. A continuación, purifique el ARNm mediante precipitación con cloruro de litio.

Luego, utilice ya sea electroforesis en gel de acrilamida o aros para verificar su pureza. Prepare una reacción de traducción in vitro de 100 microlitros en agua libre de nucleasas añadiendo una mezcla de aminoácidos de un milimolar sin metionina, 10 unidades de inhibidor de ARN, 20 microcurios de metionina radiactiva 35 s y lisado de reticulocitos de conejo. A continuación, precaliente la reacción incubándola a 30 grados Celsius durante cinco minutos.

Luego, agregue dos microgramos de ARNm e incube a 30 grados Celsius durante cinco minutos para detener la reacción; coloque la mezcla en hielo para aislar los polipéptidos recién sintetizados unidos a los ribosomas. Añada la reacción de traducción encima de 4,5 mililitros de tampón de glicerol al 30 % en HCl, pH 7,6, con cloruro de potasio y cloruro de magnesio, y centrifugue utilizando un rotor TLA 110 a 100 000 × g durante una hora a 4 grados Celsius. A continuación, retire cuidadosamente el sobrenadante y luego resuspenda el pellet de polisomas que contiene los polipéptidos recién sintetizados en un pequeño volumen de tampón tris 1 milimolar, HCl, pH 7,6, que contenga 0,5 miligramos por mililitro de ribonucleasa A, e incube durante 30 minutos a 37 grados Celsius.

Para mejorar la hidrólisis del enlace éster de péptido, agregue hidróxido de sodio a una concentración final de 10 milimolares a la reacción e incube durante 30 minutos adicionales. Separe los polipéptidos nascentes mediante electroforesis en gel de tris-tris-SDS, luego fije y seque los geles. Somete los geles a autorradiografía, seguida de imagenología con fósforo para la detección de polipéptidos nascentes.

El movimiento alterado de los ribosomas inducido por cambios en el grupo de ARNt debería provocar cambios en la distribución de tamaños de los polipéptidos nacientes que se acumulan durante la traducción, así como en sus intensidades relativas, que reflejan la duración de la pausa en este punto. Los polipéptidos nacientes de la proteína cristalina gamma B se aislaron y separaron mediante electroforesis SDS-PAGE Tristine. Las diferencias en las longitudes e intensidades de los polipéptidos en los sistemas de RRL y E. coli indican que el movimiento de los ribosomas a lo largo del ARNm en estos dos sistemas sigue una cinética de traducción distinta.

Por ejemplo, observe la banda prominente de 17,7 kilodalton en el lisado de e coli que no está presente en el sistema de lisado de reticulocitos de conejo. Gamma B cristalina alberga codones de arginina en tándem que son frecuentes en sistemas mamíferos, pero se sabe que son extremadamente raros y lentamente traducidos en e coli, lo que sugiere que esta banda es causada por la pausa del ribosoma en estos codones raros en tándem, como se muestra aquí.

No se pueden observar bandas en ausencia de ARNm, y el tratamiento con puromicina elimina la mayor parte de las cadenas nacientes del polisoma. Además, el tratamiento prolongado con puromicina elimina todas las cadenas nacientes, lo que confirma que los productos polipeptídicos observados son cadenas nacientes asociadas a ribosomas, y no proteínas mitocondriales ribosomales (MRPs) que co-sedimentan con el polisoma. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en uno o dos días. La duración del procedimiento depende principalmente del tiempo del paso de centrifugación y del paso de electroforesis en gel de los péptidos nacientes.

Al realizar este procedimiento, es importante detener inmediatamente la reacción de traducción tras el tiempo de incubación. Para evitar la liberación del polipéptido naciente del ribosoma, obviamente es fundamental evitar las ARN en cualquier paso. La contaminación con ARN puede afectar la eficiencia de traducción del extracto y provocar la liberación del polipéptido naciente del ribosoma tras seguir este procedimiento.

Otros objetivos, como por ejemplo, los efectos de las proteínas que se unen al ARNm sobre la eficiencia del movimiento del ribosoma en un mensaje determinado, también pueden evaluarse tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del plegamiento de proteínas exploraran el papel de la traducción provocado por la presencia de códigos raros en el plegamiento proteico traduccional. Anteriormente, esta técnica se empleó para evaluar el papel de las sustituciones de kaón en el movimiento del ribosoma sobre un mensaje y en el plegamiento proteico traduccional.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo identificar los sitios activos en la traducción presentados por el ARNm mediante el aislamiento de polipéptidos recién sintetizados unidos al ribosoma. No olvide que trabajar con isótopos radiactivos y aminoácidos marcados, como, por ejemplo, metionina-35S, requiere precauciones especiales y siempre debe tenerse en cuenta al realizar este procedimiento.