Purificación por afinidad de los complejos de ribonucleoproteína Influenza Virus de la cromatina de las células infectadas

Cadena Lyco negativa, virus de ARN. El genoma de los virus de la influenza se empaqueta en forma de complejos de proteínas nucleares de costillas virales, o VR nps, en los que el genoma monocatenario está encapsulado por la proteína nuclear y asociado con el complejo de la cúrcuma polimerasa que consta de las subunidades PA PB uno y PB dos para purificar los complejos intactos de células de mamíferos infectadas. Las células Hela se incuban con el virus de la influenza marcado con estreptococos recombinantes.

Una vez que el virus ingresa a las células, el ARN viral se sintetiza en los núcleos después de la infección, las células se someten a un detergente y se fraccionan en fracciones nucleares citoplasmáticas y de cromatina mediante centrifugación y protocolo de fracción de cromatina basado en asalto. Finalmente, los VRP marcados con estreptos se purifican por afinidad a partir de cada fracción. El análisis de la composición de proteínas y ARN de VR NPS purificadas mediante tinción con plata demuestra que usando este protocolo, incluso de manera estricta, se pueden aislar VRP unidas a cromatina. Intacto. Por lo tanto, una de las principales ventajas de nuestro protocolo en comparación con los métodos estándar para purificar por afinidad los complejos de proteínas nucleares de costillas del virus de la influenza es que, mediante el uso de nuestro método, es posible purificar VR NPS de la cromatina de las células infectadas, que se sabe que es el sitio de síntesis de ARNm del virus de la influenza.

Por lo tanto, nuestro método podría utilizarse para responder a preguntas relacionadas con la regulación de la replicación y la transcripción viral, como, por ejemplo, qué factores virales o celulares, pero también qué modificaciones postraduccionales se requieren para, por ejemplo, la síntesis de ARNm viral o también la síntesis de ARN genómico viral. Por lo tanto, los investigadores nuevos en este método podrían encontrarse con algunas dificultades porque el fraccionamiento subnuclear es muy sensible a las condiciones bioquímicas y también puede variar mucho entre diferentes líneas celulares. Comience este protocolo con la curación de nuestras células que han sido infectadas con el virus de la influenza, el estreptococo RWSN PB dos, que tiene una etiqueta de estreptococo fusionada genéticamente al extremo C de la subunidad PB dos en una multiplicidad de infección de tres.

Lave las celdas una vez con PBS frío, luego agregue 12 mililitros de PBS frío y retírelas del plato. Usando un raspador de goma. Transfiera las células a un tubo cónico de 50 mililitros y péguelas por centrifugación.

El aspecto más difícil de este procedimiento es el protocolo de fraccionamiento celular. Los núcleos celulares son muy sensibles a los procedimientos de homogeneización y mezcla, y si se realiza incorrectamente, puede arruinar fácilmente un extracto de cromatina. Por lo tanto, es muy importante seguir no solo las técnicas de homogeneización, sino también el manejo general de los lisados, como mostramos aquí.

Después del aspirado de centrifugado, el PBS y Resus, suspenda el pellet de la célula en 10 mililitros de tampón de sacarosa fría. Conecte una punta de pipeta de 200 microlitros a una pipeta de suero de plástico de 10 mililitros y pase las células a través de ella para romper los grupos de células. Incuba la suspensión en hielo durante 10 minutos.

Invirtiendo periódicamente las células suavemente para resuspenderlas. A continuación, agregue P 40 no IET a una concentración final de 0.5% y vórtice a alta velocidad durante 15 segundos centrifugar inmediatamente durante 10 minutos a 3, 500 veces G a cuatro grados Celsius en una centrífuga de mesa. Después del centrifugado, retire el supinato y transfiéralo a un tubo cónico de 15 mililitros.

Almacene el supinato a cuatro grados centígrados. Se trata de una fracción citoplasmática. El pellet debe ser más pequeño y más blanco que el pellet de celda original, como se muestra aquí.

Si el protocolo se completará más tarde, almacene el pellet de celda a cuatro grados centígrados. De lo contrario, continúe lavando el pellet en cinco mililitros de sacarosa fría, tampón y centrifugando como antes. Una vez que se haya completado el centrifugado, deseche el supinato y vuelva a suspender el pellet, que contiene los núcleos en 1,5 mililitros de tampón de extracción plásmica nuclear fría.

Transfiera el pellet resuspendido a un homogeneizador de baile de cuatro mililitros de vidrio enfriado con un mortero apretado y homogeneice los núcleos con 20 golpes. Evitando la formación de espuma, la resistencia debe aumentar después de aproximadamente 10 golpes. Para confirmar la homogeneización eficiente, examine la muestra bajo un microscopio de contraste de fase.

Los núcleos ya no deben ser redondos, sino que deben tener formas irregulares y parecer como si hubieran estallado. Una vez homogeneizados los núcleos, transfiéralos a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Incubar el homogeneizado en una rueda giratoria a cuatro grados centígrados durante 20 minutos.

A continuación, centrifugar a 16.000 veces G en una microcentrífuga durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Después del centrifugado, transfiera el supinato, que es la fracción plasmática nuclear, a un tubo de 1,5 mililitros y guárdelo a cuatro grados centígrados. A continuación, Reese suspende el pellet en 1,5 mililitros de digestión, tampona precaliente a 37 grados centígrados.

Luego incubar la fracción durante 10 minutos a 37 grados centígrados. A continuación, agregue 42 microlitros de cloruro de sodio de cinco molares para llevar la concentración final de cloruro de sodio a 150 milimolares y luego incube durante 20 minutos en hielo. Centrífuga a 16.000 veces, G en una microcentrífuga de cuatro grados centígrados durante 10 minutos.

Después de girar, retire el supinato y guárdelo a cuatro grados centígrados. Esta es la fracción CH one 50. Los Reeses doblan el pellet en 1,5 mililitros de tampón frío con alto contenido de sal e incuban durante 20 minutos en hielo.

Centrífuga a 16.000 veces, G en una microcentrífuga a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Después del centrifugado, retire el supnatante y guárdelo a cuatro grados centígrados. Se trata de la fracción CH 500.

Saca las fracciones guardadas durante el protocolo de fraccionamiento y colócalas en hielo. Luego, a la fracción citoplasmática, agregue 300 microlitros de cloruro de sodio de cinco molares. Luego transfiera 100 microlitros de estreptococo T empaquetado en perlas Sphero por fracción a un tubo cónico de 15 mililitros.

Agregue 10 volúmenes de tampón de lavado estreptocócico a las perlas. Invierta el tubo para mezclar y centrifugar durante cinco minutos a 1000 veces. G en una centrífuga de mesa, deseche el sna.

Repita el lavado del tampón dos veces, y luego Reese doble el pellet en un volumen igual de tampón de lavado de estreptococos, agregue 200 microlitros de estreptococos lavados Acta en la lechada de perlas a cada fracción. Gire los tubos durante una hora a cuatro grados centígrados. Luego centrifugar los tubos durante un minuto a 1000 veces G de cuatro grados centígrados, desechar el supinado.

A continuación, añada un mililitro de tampón de lavado a las perlas para las perlas incubadas con la fracción citoplasmática en un tubo de 15 mililitros. Agregue el tampón de lavado y transfiera las perlas a un tubo de 1,5 mililitros. Lave las perlas durante un minuto, luego centrifugue los tubos durante un minuto a 1000 veces G a cuatro grados centígrados.

Repita dos veces después del último paso de lavado. Elimine todos los restos del tampón de lavado con una punta de pipeta plana. A continuación, añade 100 microlitros de tampón elucian y mezcla suavemente y coloca los tubos sobre hielo durante 15 minutos.

Durante la incubación, mezcle ocasionalmente las perlas golpeando suavemente la parte inferior de los tubos. Después de 15 minutos han pasado la centrífuga a elegir durante un minuto a 1000 veces G a cuatro grados centígrados. Recoja el Senna que contiene los VRP marcados con estreptococos eluidos.

Él, nuestras células se infectaron con la cepa del virus de la gripe, WSN durante nueve horas, y los lisados fraccionados se analizaron por floración occidental como se muestra aquí. El aislamiento nuclear suave extrae eficientemente proteínas citoplasmáticas como la tubulina, al tiempo que evita la liberación de abundantes proteínas nucleares. Tenga en cuenta que la fracción de cromatina extraída con bajo contenido de sal está enriquecida en proteínas importantes para la transcripción.

Mientras que la fracción alta en sal contiene principalmente nucleosomas para determinar la composición proteica de la fracción citoplasmática eluida, se analizaron las V NPS de las células R infectadas durante nueve horas con virus no marcados, RWSN o RWSN PB dos estreptoestreptococos mediante tinción de plata como se muestra para un eluido citoplasmático. Aquí hay una alta proporción de NP a PA PB uno, PB dos, como lo demuestra la banda principal por encima de 55 kilodaltons en comparación con las bandas entre 95 y 100 kilodaltons, lo que sugiere que la mayor parte del estreptococo PB dos se purifica como parte de un VRNP completamente formado, o en otras palabras, se captura poca polimerasa soluble para comparar los rendimientos relativos. VR NPS purificado después de nueve horas de infección con RWSN, PB dos estreptococos o RWSN o teñido de plata, como se muestra en este gel de tinción de plata, v RMP se puede purificar a partir de las cuatro fracciones celulares después de nueve horas de infección.

La concentración más alta de v RMPs se encuentra en el plasma nuclear, aunque también se pueden purificar porciones considerables del citoplasma y la cromatina. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo purificar altos rendimientos de complejos de ribonucleoproteínas intactos del virus de la influenza del núcleo de las células infectadas. A la hora de llevar a cabo este procedimiento, es importante recordar el uso de tampones limpios y evitar exponer las muestras innecesariamente a temperatura ambiente, ya que de esta manera se puede evitar la degradación tanto del ARN como de las proteínas, así como el desmontaje del complejo proteico.

Y no olvide que trabajar con un virus infeccioso de la influenza puede ser peligroso. Todos los pasos deben llevarse a cabo bajo un banco de trabajo de nivel de bioseguridad dos hasta que se haya agregado NP 40 a los lisados.