Dos Métodos de Formación heterocarión para descubrir los factores de restricción del VHC

El objetivo de este procedimiento es investigar el impacto de los factores de restricción en la finalización del ciclo de replicación del virus de la hepatitis C en una línea celular determinada, utilizando dos métodos que dependen de la formación de hécadas. Para el primer método, comience por cultivar células hepáticas humanas, así como células empaquetadoras HeLa y Hep56.1D. A continuación, transfecte el ARN del virus de la hepatitis C o VHC en las células hepáticas mediante electroforesis. Posteriormente, fusione la línea celular que replica el VHC con la línea celular empaquetadora respectiva mediante polietilenglicol en el segundo método de fusión. El primer paso consiste en la producción de un stock de VHC de alto título.

A continuación, se realiza un cultivo conjunto de diferentes líneas celulares y se induce la fusión celular mediante la transfección del glicoproteína del virus espumoso prototípico. Luego, los heterocariones se infectan con VHC. Tras cualquiera de los métodos de formación de heterocariones, se lleva a cabo microscopía de fluorescencia para confirmar la fusión, y se cuantifica la producción de partículas infecciosas.

La principal ventaja de esta técnica es que resulta útil para analizar un amplio panel de líneas celulares y células primarias en busca de la expresión de factores de restricción dominantes específicos de HV. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la especificidad de especie y los noms del VHC. La demostración visual de este método es fundamental para facilitar la comprensión de los conceptos subyacentes de los dos sistemas de fusión antes de la inducción de la fusión celular mediante polietilenglicol.

Las células HUH 7.5 se transfectan con ARN del VHC siguiendo protocolos estándar y se cultivan durante 24 horas a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono al día siguiente. Recoger las células HUH 7.5 transfectadas que albergan el replicón subgenómico, así como las células empaquetadoras heal R y hep 56 1D. Estas células empaquetadoras han sido diseñadas para expresar ectópicamente las proteínas del VHC: core, E1, E2, p7 y NS2. Después de la tripsinización, resuspender las células en medio completo DMEM y diluir las suspensiones celulares a las siguientes concentraciones: HUH 7.5 a cinco veces 10 a la cinco células por mililitro, y las células heal y hep 56 1D a dos veces 10 a la cinco células por mililitro.

A continuación, prepare una placa de cultivo de seis pocillos con dos o tres cubreobjetos de vidrio estériles por pocillo. Para un análisis adicional de la eficiencia de fusión, combine un mililitro de células HUH 7.5 transfectadas con un mililitro de células empaquetadoras y siembre en un pocillo de la placa de seis pocillos; incube durante 24 horas a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Después de 24 horas, verifique la densidad celular.

La densidad celular debe oscilar entre el 60 y el 80 % de confluencia antes de la inducción de la fusión celular, para que las células estén en estrecha proximidad y sus membranas puedan fusionarse. Aspire el medio de las células en co-cultivo y lave una vez con un mililitro de PBS. A continuación, agregue cuidadosamente 500 microlitros de polietilenglicol al 40 % precalentado, o PEG 1.500. Agregue 500 microlitros de PBS a otro pocillo con células en co-cultivo como control. Incube durante cinco minutos a 37 grados Celsius para inducir la formación de heterocariones. Aspire el PEG y agregue cuidadosamente dos mililitros de PBS. Después de un minuto, aspire el PBS y agregue dos mililitros de PBS fresco. Lave con PBS de tres a cinco veces, durante un minuto por cada lavado, para eliminar el exceso de PEG.

Finalmente, agregue dos mililitros de DMEM, medio completo a cada pocillo e incube a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono durante 48 horas. 48 horas postfusión. Recolecte cada SNAT y filtre a través de un filtro de 0,45 micrones. Después de recolectar el sobrenadante del cultivo celular, la eficiencia de fusión puede determinarse mediante inmunofluorescencia. Lave los pocillos que contienen cubreobjetos de vidrio una vez con un mililitro de PBS durante un minuto.

Fije las células con 600 microlitros de paraformaldehído al 3% en PBS durante 15 minutos. Lave tres veces con PBS durante un minuto por cada lavado tras el lavado final. Utilice pinzas para transferir cuidadosamente las cubreobjetos a una placa de 24 pocillos con celdas permeabilizadas con 500 microlitros de Triton X-100 al 0,5% en PBS durante cinco minutos.

Posteriormente, lavar tres veces con PBS y aplicar 250 microlitros de la solución de anticuerpo primario a cada pozo. Utilice un anticuerpo anti-NS5A a una concentración de 0,5 microgramos por mililitro y un anticuerpo monoclonal humano anti-E2 a una concentración de 6,4 nanogramos por mililitro. Incubar durante 45 minutos a temperatura ambiente. Después de 45 minutos, lavar tres veces con PBS.

A continuación, agregue 250 microlitros de anticuerpos secundarios a cada pocillo; se utilizan anticuerpos secundarios de cabra anti ratón o anti humano IgG específicos conjugados con Alexa Floor 5 46 o Alexa Floor 4 88 a una concentración de dos microgramos por mililitro. Incube durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de 30 minutos, lave una vez con PBS.

Posteriormente, tiña los núcleos celulares con 250 microlitros de DPI diluido uno a 3000 en PBS. Incube durante un minuto a temperatura ambiente en la oscuridad, lave cuatro veces con PBS y una vez con agua. Finalmente, monte los cubreobjetos boca abajo sobre una gota de flora mount en una portaobjetos para microscopio y déjelos secar en la oscuridad.

Para comenzar este procedimiento, coseche y prepare suspensiones simples de células de las siguientes líneas. La línea celular humana de hígado Luna NA que carece de expresión endógena de CD81. Las células empaquetadoras He r y las células Hep 56 1D que expresan establemente el CD81 humano. Cocultive las células Luna n con las células He r en una proporción de uno a uno y con las células Hep 56 1D HCD81 en una proporción de uno a dos, obteniendo una densidad celular total de 1,5 × 10⁵ células por 12.

Incubar bien durante 24 horas a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono al día siguiente. Transfectar transitoriamente las células con una proteína de envoltura PFE altamente fusogénica utilizando lipofectamina 2000 según las instrucciones del fabricante. 30 horas después de la transfección con la glicoproteína PFE, inocular heterocariones con 350 microlitros de un stock de virus previamente preparado a una MOI de aproximadamente 2,3.

Incubar durante 12 horas a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono a la mañana siguiente. Lavar una vez con PBS y añadir un mililitro de medio completo DMEM por pocillo; incubar durante 48 horas a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Tras 48 horas, recolectar el sobrenadante de los cultivos de heterocarión, filtrar el sobrenadante a través de un filtro de 0,45 micrones. A continuación, utilizar el sobrenadante para inocular células HUH 7.5 sembradas el día anterior en placas de 96 pocillos, en un ensayo de dilución límite; incubar durante 72 horas antes de cuantificar la producción de partículas infecciosas progenitoras.

El procedimiento para visualizar los eventos de fusión debe completarse seis horas antes del lavado de la co-cultura. Adherir las células una vez con cinco mililitros de PBS y luego añadir cuatro mililitros de la solución DI adecuada por placa de 10 centímetros. Incubar las células durante 45 minutos a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Lavar las células una vez con cinco mililitros de PBS durante un minuto y luego añadir medio DMEM completo. Incubar durante seis horas a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono antes de sembrar. Añadir un cubreobjetos a cada pocillo de la placa de 12 pocillos. Después, sembrar y transfectar las células, y teñirlas como se indicó anteriormente. Treinta horas tras la transfección, lavar cuidadosamente las células con un mililitro de PBS durante un minuto y luego fijar las células con 250 microlitros de paraformaldehído al 3% durante 15 minutos a temperatura ambiente.

Lave las células una vez con un mililitro de PBS durante un minuto y luego tiña con dappy durante un minuto tras lavar las células una vez con PBS y una vez con agua. Monte cubreobjetos, gafas de sol y portaobjetos en el primer enfoque para investigar el impacto de los factores de restricción en la finalización del ciclo de replicación del VHC. En heterocariones, las células HUH 7.5 se transfectaron primero transitoriamente con un replicón subgenómico que expresa un transgén de luciferasa y proteínas no estructurales del VHC, y luego se cocultivaron y fusionaron con líneas celulares que expresan las proteínas estructurales principales y proteínas accesorias del VHC. Un resultado representativo se muestra en esta figura: células inmunotincionadas utilizando anticuerpos monoclonales contra la proteína estructural E2 y la proteína no estructural NS5A.

Las imágenes en los paneles superiores muestran que tras el tratamiento con PEG, se detectaron simultáneamente señales tanto para MS cinco A como para D dos en el mismo citoplasma, lo que indica autofusión. En contraste, las imágenes en los paneles inferiores muestran que cuando las células co-cultivadas fueron tratadas con PBS, no se indujo fusión alguna. Por lo tanto, no se observó colocalización de señales. Para cuantificar la infectividad viral producida a partir de heterocariones, se recolectaron sobrenadantes de las co-culturas a las 48 horas posteriores a la inducción de fusión y se utilizaron para inocular células HUH 7.5 naïve, destinadas a ensayos posteriores de luciferasa.

En este gráfico, se muestran los valores medios de tres experimentos independientes. La barra horizontal gris representa el fondo de unidades relativas de luz o RLU determinadas en células HUH 7.5 no infectadas. Notablemente, cuando las células replicantes HUH 7.5 se fusionaron con líneas celulares ingenuas o se trataron con PBS como control, no se detectó infectividad en los fluidos de cultivo.

Sin embargo, cuando se indujo la fusión celular entre el replicón HUH 7.5 y las líneas celulares empaquetadoras mediante PEG, se liberaron partículas virales infecciosas en los fluidos de cultivo. Esto indica que la producción de virus requiere la fusión celular y la expresión de proteínas virales en las líneas celulares empaquetadoras, destacando que no solo los heterocariones de células de hepatoma humano HUH 7.5, sino también los heterocariones con células hepáticas humanas no hepáticas y células hepáticas de ratón permitieron la liberación del virus, lo que sugiere que el ensamblaje y la liberación no están dominadamente inhibidos por posibles factores de restricción en estos tipos celulares. En un enfoque alternativo, se indujo la fusión de células somáticas mediante la expresión de una glicoproteína génica tras el cultivo de las células.

Los heterocariones se visualizaron tiñendo líneas celulares separadas con colorantes marcadores de células antes de la co-cultivación y la transfección con la proteína génica; las células se fijaron y tiñeron con DPI 30 horas después de la transfección, y en esta figura se muestra un resultado representativo. La fusión de dos tipos celulares se indica mediante un heterocarión con colorantes distribuidos homogéneamente en el citoplasma, como se ilustra aquí. En contraste, las imágenes del panel inferior muestran la ausencia de células con citoplasma doblemente teñido, lo que indica la ausencia de fusión celular.

Este gráfico final muestra que todos los factores de entrada del VHC se expresan únicamente en cultivos heterocelulares de células Luna N con células hela o Hep 56 1D que expresan CD81 humano. Aquí, los cultivos fueron inoculados con partículas infecciosas de VHC. Los fluidos de cultivo se recogieron 48 horas después y la liberación de nuevas partículas desde los cultivos heterocelulares se determinó mediante un ensayo de dilución límite utilizando células diana HUH 7.5 naïve; se muestran los valores medios de tres experimentos independientes y la barra horizontal gris representa el límite de detección del ensayo.

Como control, células N lunar se fusionaron con células N lunar, lo que resultó en niveles muy bajos de VHC infeccioso, cercanos al límite de detección. Resultados similares se obtuvieron cuando células N lunar se fusionaron con células HEP 56 1D naïve. En ambos casos, la CD81 humana estaba ausente, por lo que el VHC no pudo infectar productivamente a los heteros.

En contraste, se observó una producción de novo de progenie viral infecciosa aproximadamente diez veces superior al fondo del ensayo en células lunar 10 infectadas con heer y en células lunar hand fusionadas con células HEP 56 1D que expresan CD 81 humana. Esto indica que el VHC completó con éxito su ciclo de replicación en RetroCars, descartando así la expresión de factores restrictivos dominantes en estas líneas celulares. Una vez dominado, el procedimiento experimental completo puede realizarse en una semana si se lleva a cabo adecuadamente.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión sobre cómo generar heterocariontes para la identificación de posibles factores de restricción de VHC. No olvide que trabajar con el virus de la hepatitis C puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como un alto nivel de bioseguridad, al realizar este procedimiento.