Aislamiento de células endoteliales de vena umbilical y su uso en el Estudio de la transmigración de neutrófilos bajo condiciones de flujo

El objetivo general de este procedimiento es aislar células endoteliales humanas de alta calidad y utilizarlas para examinar los mecanismos que regulan la transmigración de neutrófilos, bajo condiciones de flujo. Esto se logra primero aislando y sembrando células endoteliales de vena umbilical humana. El segundo paso consiste en dividir las células en cámaras IBD.

A continuación, neutrófilos humanos recién aislados fluyen sobre células endoteliales activadas, lo que resulta en la rodadura de los neutrófilos, adhesión firme y transmigración. El paso final consiste en cuantificar la transmigración mediante microscopía de video. En última instancia, se puede utilizar microscopía fluorescente y de campo claro para evaluar la transmigración de neutrófilos a través de células endoteliales activadas.

El aislamiento de células endoteliales es fácil de describir, pero difícil de aprender en parte porque los pasos clave requieren la visualización de la vena umbilical. Por esta razón, la demostración visual de este método es fundamental. Este método nos ayudará a comprender preguntas clave en el campo de la inflamación, como cómo ocurre el reclutamiento de leucocitos bajo condiciones de flujo, y cómo se comportan las células endoteliales bajo condiciones de flujo será mejor comprendido.

Aunque este método puede proporcionar información sobre el reclutamiento de neutrófilos durante la inflamación, también puede aplicarse a poblaciones raras de leucocitos, como las células asesinas naturales y los eosinófilos. Demostrando este procedimiento junto con Ritu Sharma está Hong Jang, una técnica en mi laboratorio. Al menos una hora antes del procedimiento, prepárese y luego incube un frasco T 75 con gelatina a 37 grados Celsius.

Luego, comience el procedimiento de aislamiento de células endoteliales en la cabina de flujo laminar utilizando un par de tijeras para cortar un cordón umbilical de una placenta. Después de cambiar a guantes estériles, examine cuidadosamente el cordón y deseche cualquier porción que contenga coágulos de sangre o que esté dañada por la pinza del cordón durante el parto. A continuación, identifique las dos arterias y la vena única presentes en el cordón.

A continuación, inserte suavemente una cánula con una llave de paso de dos vías conectada en uno de los extremos de la vena, y luego coloque una pinza alrededor de la cánula para mantenerla firmemente en su lugar. Una de las partes más complicadas del procedimiento es la perfusión del cordón umbilical. Para asegurar que se realice con éxito, perfunda el cordón con tampón en exceso y observe el flujo hasta que quede transparente.

Perfunda la vena con tampón del cordón hasta que el flujo saliente esté claro y luego sujete con una pinza el extremo del cordón. Durante la perfusión, a veces se revela un pequeño orificio porque los médicos han extraído sangre del cordón umbilical. En estas situaciones, se pueden utilizar hemostatos para obstruir el orificio y continuar la perfusión mientras se aíslan las células endoteliales.

Es críticamente importante controlar con precisión el tiempo del tratamiento con colagenasa. Si el tiempo es demasiado corto, no se recolectarán suficientes células endoteliales; si es demasiado largo, pueden ocurrir contaminaciones con células musculares lisas o daño a las células endoteliales. Luego, perfundir la vena con colagenasa recién preparada y tibia.

Cierre la llave de paso e incube el cordón en un vaso de precipitados que contenga tampón tibio para cordón. Después de 10 minutos, retire el cordón y masajéelo suavemente para soltar las células endoteliales del lumen de la vena. Drene la solución en un tubo que contenga cinco mililitros de medio para células endoteliales o ECM, lavando el cordón con tampón para cordón dos veces para eliminar cualquier célula restante.

Ahora centrifugue las células durante 10 minutos a 350 × g. A temperatura ambiente, retire el sobrenadante y luego resuspenda el sedimento en 10 mililitros de medio para células endoteliales. Transfiera las células al matraz T75 recubierto con gelatina y cultive las células endoteliales durante la noche a 37 grados Celsius y 5 %CO₂. Al día siguiente, agite suavemente el matraz para desprender cualquier glóbulo rojo.

Luego, elimine el sobrenadante y lave el cultivo de células endoteliales con HBSS tibio. Después de eliminar el HBSS, agregue 10 mililitros de ECM tibio al cultivo celular. A continuación, examine las células bajo el microscopio para asegurarse de que los glóbulos rojos hayan sido eliminados y para evaluar el grado de confluencia y la morfología de las células endoteliales.

Continúe cambiando el medio cada tres días hasta que las células alcancen confluencia. En ese momento, separe las células utilizando una solución de tripsina y EDTA. Luego, recoja las células desprendidas y resuspenda en ECM.

Finalmente, recubra cada pocillo de una cámara IBD con gelatina. Elimine el exceso de gelatina y luego agregue 1,5 × 10⁶ por mililitro de la suspensión de células endoteliales en cada pocillo de la cámara. Comience induciendo la sobreexpresión de moléculas de adhesión y activación en la superficie celular incubando las células endoteliales con un estimulante adecuado mientras las células endoteliales se están activando.

Aísle los neutrófilos de la sangre periférica de voluntarios humanos sanos mediante centrifugación en gradiente de densidad según se ha publicado previamente, y luego suspenda las células a una concentración de uno por diez a la seis por mililitro en HBSS más albúmina humana. Después de preparar el microscopio, conecte la cámara IBD que contiene las células endoteliales estimuladas al tubo del microscopio. Seleccione el objetivo de contraste de fases de 10 x y luego configure la bomba de jeringa para retirar y comenzar el flujo de HBSS al estrés cortante deseado.

Detenga brevemente el flujo girando la llave de paso de tres vías en el lado de salida a la posición de apagado y cambiando la línea de entrada de HBSS a neutrófilos aislados. Reinicie el flujo girando nuevamente la llave de paso a la posición de encendido. Luego comience la grabación utilizando una cámara CCD conectada a un grabador de DVD.

Inicie el temporizador. Cuando los neutrófilos entren en la cámara después de cuatro minutos, cambie nuevamente a HBSS para evitar la adhesión de nuevos neutrófilos. Si se desea obtener datos sobre las interacciones totales, el rodamiento y la adhesión firme, utilice un contraste de fase 10x.

Objetivo de obtener imágenes de seis campos aleatorios durante 10 segundos cada uno entre los minutos cuatro y cinco. Finalmente, cambie a un objetivo de 40 x y registre un solo campo de visión en el momento de interés. Después de la perfusión de neutrófilos a los 10 minutos, recolecte entre cinco y 10 campos de visión aleatorios.

Las células endoteliales no estimuladas no favorecen el reclutamiento de neutrófilos. Por lo tanto, las siguientes figuras muestran neutrófilos interactuando con células endoteliales estimuladas con TNF alfa. Observe el neutrófilo adherido indicado por la punta de flecha amarilla y el neutrófilo en transmigración denotado por la punta de flecha blanca.

La transmigración de neutrófilos puede ocurrir en las uniones celulares o a través de las propias células endoteliales. Para diferenciar entre estas dos condiciones, las células endoteliales se marcaron con un anticuerpo anti VE-coherente. Como se observa aquí en rojo, la transmigración se clasifica como paracelular o transcelular.

En este modelo, prácticamente toda la transmigración es paracelular, como lo demuestra esta figura que muestra la superposición de las dos figuras anteriores. En este primero de tres gráficos, se examinaron y midieron las interacciones de neutrófilos utilizando el software ImageJ. Obsérvese que ocurrieron significativamente más interacciones entre neutrófilos y células endoteliales activadas por TNF alfa que con las células endoteliales de control no estimuladas.

Las células interaccionantes totales se caracterizaron adicionalmente como células rodantes, adheridas firmemente o transmigrando, como antes. Se observó una transmigración significativamente mayor de neutrófilos en los pocillos que contenían células endoteliales activadas tras el aislamiento de las células endoteliales. Se pueden realizar otros métodos como inmunotransferencia, PCR en tiempo real y medición de la resistencia endotelial para responder preguntas adicionales relacionadas con la biología de las células endoteliales tras el desarrollo.

Este método ayudará a los investigadores en el campo de la inflamación y la biología vascular a comprender cómo ocurre el reclutamiento de leucocitos bajo condiciones de flujo en un sistema modelo humano. Después de ver este video, deberían tener una buena comprensión de cómo aislar células endoteliales de la vena umbilical humana y utilizarlas para estudiar la transmigración de neutrófilos bajo condiciones de flujo empleando una cámara de ity.