Name: Una expresión adecuada y el general de la Plataforma para la producción de proteínas secretadas por las células humanas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Aprende a expresar proteínas secretadas usando células HEK 293T humanas con este protocolo eficiente. El método permite producir proteínas recombinantes en conformaciones nativas y escalar la producción usando fábricas de células de 10 capas.

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Este trabajo fue apoyado por un Ontario Tratamiento del VIH operativo de red Beca de Investigación (ROG-G645) y los Institutos Canadienses de Salud Investigator Award Nueva investigación (MSH-113554) de JEL, y la Universidad de Toronto Becas a la HA, la FCA, y JDC. Los autores desean agradecer a Marnie Fusco, Abelson Dafna y la Dra. Erica Saphire Ollmann en el Instituto de Investigación Scripps (La Jolla, CA) para las células que proporcionan, los virus Ébola vector de expresión GP y asesoramiento general.

<ol><li>Celik, E., Calik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+recombinant+proteins+by+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Adv%22%5BJournal%5D)">Production of recombinant proteins by yeast cells.</a> Biotechnol. Adv. , (2011).</li>
<li>Yokoyama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+expression+systems+for+structural+genomics+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein expression systems for structural genomics and proteomics.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 7, 39-43 (2003).</li>
<li>Nettleship, J. E., Assenberg, R., Diprose, J. M., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+production+of+proteins+in+insect+and+mammalian+cells+for+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the production of proteins in insect and mammalian cells for structural biology.</a> J. Struct. Biol. 172, 55-65 (2010).</li>
<li>Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis%3A+Applications+come+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Adv%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis: Applications come of age.</a> Biotechnol. Adv. , (2011).</li>
<li>Lee, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+Ebola+virus+glycoprotein+bound+to+an+antibody+from+a+human+survivor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the Ebola virus glycoprotein bound to an antibody from a human survivor.</a> Nature. 454, 177-182 (2008).</li>
<li>Bowden, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+Nipah+and+Hendra+virus+attachment+to+their+cell-surface+receptor+ephrin-B2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural basis of Nipah and Hendra virus attachment to their cell-surface receptor ephrin-B2.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 15, 567-572 (2008).</li>
<li>Evans, M. J., Hartman, S. L., Wolff, D. W., Rollins, S. A., Squinto, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+expression+of+an+anti-human+C5+chimeric+Fab+utilizing+a+vector+that+replicates+in+COS+and+293+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid expression of an anti-human C5 chimeric Fab utilizing a vector that replicates in COS and 293 cells.</a> J. Immunol. Methods. 184, 123-138 (1995).</li>
<li>Ye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+protein+expression+in+scalable+CHO+transient+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">High-level protein expression in scalable CHO transient transfection.</a> Biotechnol. Bioeng. 103, 542-551 (2009).</li>
<li>Wurm, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+recombinant+protein+therapeutics+in+cultivated+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells.</a> Nat Biotechnol. 22, 1393-1398 (2004).</li>
<li>Lee, J. E., Fusco, M. H., Hessell, A. J., Burton, D. R., Saphire, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+and+tactics+used+in+determining+the+structure+of+trimeric%2C+prefusion+Ebola+virus+GP%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst%22%5BJournal%5D)">Techniques and tactics used in determining the structure of trimeric, prefusion Ebola virus GP.</a> Acta Cryst. 65, 1162-1180 (2009).</li>
<li>Aricescu, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+expression%3A+developments+for+structural+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Crystallogr.+D+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic expression: developments for structural proteomics.</a> Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 62, 1114-1124 (2006).</li>
<li>Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+time-+and+cost-efficient+system+for+high-level+protein+production+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Crystallogr.+D+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells.</a> Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. D62, 1243-1250 (2006).</li>
<li>Chang, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoprotein+structural+genomics%3A+solving+the+glycosylation+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem.</a> Structure. 15, 267-273 (2007).</li>
<li>Lee, J. E., Fusco, M. H., Saphire, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+platform+for+screening+expression+and+crystallization+of+glycoproteins+produced+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">An efficient platform for screening expression and crystallization of glycoproteins produced in human cells.</a> Nature Protocols. 4, 592-604 (2009).</li>
<li>Nettleship, J. E., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+production+of+glycoproteins+by+transient+expression+in+Mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The production of glycoproteins by transient expression in Mammalian cells.</a> Methods Mol. Biol. 498, 245-263 (2009).</li>
<li>Neil, S. J., Zang, T., Bieniasz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetherin+inhibits+retrovirus+release+and+is+antagonized+by+HIV-1+Vpu%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tetherin inhibits retrovirus release and is antagonized by HIV-1 Vpu.</a> Nature. 451, 425-430 (2008).</li>
<li>Nakamura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterodimerization+of+the+IL-2+receptor+beta-+and+gamma-chain+cytoplasmic+domains+is+required+for+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Heterodimerization of the IL-2 receptor beta- and gamma-chain cytoplasmic domains is required for signalling.</a> Nature. 369, 330-333 (1994).</li>
<li>Wang, X., Rickert, M., Garcia, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+quaternary+complex+of+interleukin-2+with+its+alpha%2C+beta%2C+and+gammac+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure of the quaternary complex of interleukin-2 with its alpha, beta, and gammac receptors.</a> Science. 310, 1159-1163 (2005).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Las fábricas de células 10-capa son un buque eficaz para la producción de cantidades de miligramos de proteína. Una ventaja importante del uso de la fábrica de células sobre otras embarcaciones tradicionales, tales como botellas de rodillos, matraces de agitación o spinner frascos, es que no requieren la compra de cualquier equipo de laboratorio adicional. Un estándar de incubadora de CO 2 (aproximadamente 6.0 pies cúbicos) fácilmente acomodar a cuatro capas de 10 fábricas de células (Fig. 2).</strong...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre de reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> La fosfatasa alcalina (BCIP / NBT) solución de sustrato líquido </td><td> Sigma </td><td> B6404 </td><td></td></tr><tr><td> Antibiótico / antimicótico, 100X </td><td> Invitrogen </td><td> 15240062 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-HA matriz de afinidad, el clon 3F10 </td><td> Roche </td><td> 1815016 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-HA AcM murino, el clon 16B12 </td><td> Covance </td><td> MMS-101P </td><td></td></tr><tr><td> Frasco de cultivo celular, T75 cm 2 de cultivo de tejidos tratados </td><td> Corning </td><td> 430641 </td><td></td></tr><tr><td> Frasco de cultivo celular, T225 de 2 cm de cultivo de tejidos tratados </td><td> Corning </td><td> 431082 </td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo celular ,6-de cultivo de tejidos tratados </td><td> Corning </td><td> 3516 </td><td></td></tr><tr><td> Fábrica de la célula, de 10 capas CellSTACK </td><td> Corning </td><td> 3312 </td><td></td></tr><tr><td> Centramate Omega 5K cassette </td><td> Palio </td><td> OS005C12 </td><td></td></tr><tr><td> Centramate Omega 30K cassette </td><td> Palio </td><td> OS030C12 </td><td></td></tr><tr><td> Cromatografía en columna de vidrio, 1.0x10 cm </td><td> Kontes </td><td> 4204001010 </td><td></td></tr><tr><td> Ciprofloxacino </td><td> Sigma </td><td> 17850 </td><td></td></tr><tr><td> De CO 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco modificado de Eagle medio (DMEM) </td><td> Sigma </td><td> D5796 </td><td></td></tr><tr><td> Suero fetal bovino (FBS), inactivado por calor </td><td> Invitrogen </td><td> 12484-028 </td><td></td></tr><tr><td> FuGENE HD reactivo de transfección </td><td> Promega </td><td> 4709691001 </td><td></td></tr><tr><td> GeneJuice reactivo de transfección </td><td> EMD / Merck </td><td> 70967-6 </td><td></td></tr><tr><td> Glicina </td><td> Sigma </td><td> G8898 </td><td></td></tr><tr><td> Cabra anti-ratón IgG F (ab &#39;) 2 alcalina </td><td> Thermo Scientific </td><td> 31324 </td><td></td></tr><tr><td> anticuerpo conjugado con fosfatasa </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> La hemaglutinina (HA) péptido, 100 mg </td><td> Genscript </td><td> síntesis de la costumbre </td><td></td></tr><tr><td> (Secuencia: YPYDVPDYA, y el 95% de pureza) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> HEK 293T </td><td> ATCC </td><td> CRL-11268 </td><td></td></tr><tr><td> Household cloro (4% w / v hipoclorito de sodio) </td><td> varias marcas de fábrica están disponibles </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Immobilon-P membrana PVDF </td><td> Millipore </td><td> IPVH07850 </td><td></td></tr><tr><td> MiniPrep kit de purificación de plásmido, PureLink rápida </td><td> Invitrogen </td><td> K2100-11 </td><td></td></tr><tr><td> Maxiprep kit de purificación de plásmido, PureLink HiPure </td><td> Invitrogen </td><td> K2100-07 </td><td></td></tr><tr><td> NaN 3 </td><td> Sigma </td><td> S8032 </td><td></td></tr><tr><td> pDISPLAY vector de expresión </td><td> Invitrogen </td><td> V660-20 </td><td></td></tr><tr><td> La penicilina / estreptomicina (penicilina / estreptomicina), 100X </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Tampón fosfato salino (PBS) estéril 1X </td><td> Sigma </td><td> D8537 </td><td></td></tr><tr><td> Polietilenimina (PEI), lineales 25 kDa </td><td> Polyscience </td><td> 23966 </td><td></td></tr><tr><td> Leche descremada en polvo en seco </td><td> Clavel </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Stericup-GP de vacío PSE unidad de filtración, </td><td> Millipore </td><td> SCGPU05RE </td><td></td></tr><tr><td> 0,22 mm, 500 ml de capacidad </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> El azul tripán </td><td> Invitrogen </td><td> 15250061 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina-EDTA, 0,05% (w / v) </td><td> Invitrogen </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> Tween-20 al </td><td> Sigma </td><td> P7949 </td><td></td></tr><tr><td> El ácido valproico </td><td> Sigma </td><td> P4543 </td><td></td></tr><tr><td> Centramate sistema de flujo tangencial </td><td> Palio </td><td></td><td></td></tr><tr><td> CO 2 humidificado incubadora, 6.0 pies cúbicos estándar. pie </td><td> varias marcas de fábrica están disponibles </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Electroforesis y transferencia de la unidad </td><td> varias marcas de fábrica están disponibles </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Incubadora, 37 ° C </td><td> varias marcas de fábrica están disponibles </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

una expresión adecuada y el general de la plataforma para la producción de proteínas secretadas por las células humanas

A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells

Expresión de proteínas recombinantes en bacterias, típicamente E. coli, ha sido la estrategia de mayor éxito para la expresión cantidad miligramo de proteínas. Sin embargo, huéspedes procariotas son a menudo no es tan adecuado para la expresión de proteínas humanas, virales o eucarióticos, debido a la toxicidad de la macromolécula exterior, las diferencias en la maquinaria plegamiento de proteínas, o debido a la falta de modificaciones particulares co-o post-traslacional en bacterias. Los sistemas de expresión basados ​​en levadura (P. pastoris o S. cerevisiae) 1,2, baculovirus infectado insecto (S. frugiperda o T. ni) las células 3, y libre de células in vitro en los sistemas de traducción 2,4 han sido utilizados con éxito para producir proteínas de mamíferos. Intuitivamente, la mejor coincidencia es utilizar un huésped mamífero para asegurar la producción de proteínas recombinantes que contengan las adecuadas modificaciones post-traduccionales. Un número de líneas de células de mamíferos (Kid embriónico humanoney (HEK) 293, C V-1 en células O RIGEN que transportan el S V40 Larget antígeno T (COS), de ovario de hámster chino (CHO), y otros) se han utilizado con éxito para sobreexpresar cantidades de miligramos de un número de proteínas humanas 5-9. Sin embargo, las ventajas de utilizar células de mamífero son a menudo contrarrestada por mayores costos, requisito de equipo de laboratorio especializado, menores rendimientos de proteínas, y los tiempos prolongados para desarrollar líneas celulares estables de expresión. El aumento de rendimiento y las proteínas que producen más rápido, mientras mantiene los costos bajos, son factores importantes para muchos laboratorios académicos y comerciales. A continuación, describimos un tiempo-y costo-eficiente, procedimiento en dos partes para la expresión de proteínas secretadas por las células humanas de adherentes HEK 293T. Este sistema es capaz de producir microgramos de cantidades de miligramos de proteína funcional para estudios estructurales, biofísicos y bioquímicos. La primera parte, las construcciones de múltiples del gen de interés son producird en paralelo y transfectadas transitoriamente en células HEK 293T adherentes en pequeña escala. La detección y el análisis de la proteína recombinante secretada en el medio de cultivo celular se lleva a cabo mediante análisis Western blot utilizando anticuerpos disponibles comercialmente dirigidos contra una proteína etiqueta vector codificado purificación. Posteriormente, las construcciones adecuadas para la producción de proteínas en gran escala son transfectadas transitoriamente utilizando polietilenimina (PEI) en fábricas de células 10-capa. Las proteínas secretadas en litros volúmenes de medio condicionado se concentran en cantidades manejables utilizando filtración de flujo tangencial, seguido de purificación por cromatografía de afinidad anti-HA. La utilidad de esta plataforma se demuestra por su capacidad para expresar cantidades de miligramos de citoquinas, receptores de citoquinas, receptores de la superficie celular, factores intrínsecos de restricción, y glicoproteínas virales. Este método también fue utilizado con éxito en la determinación estructural de los inhibidores de la glucoproteína 5,10 triméricas virus Ébola. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; En conclusión, esta plataforma ofrece la facilidad de uso, velocidad y escalabilidad, además de maximizar la calidad de la proteína y la funcionalidad. Por otra parte, ningún equipo adicional, que no sea de humidificado incubadora de CO 2, se requiere. Este procedimiento puede ser expandido rápidamente a los sistemas de mayor complejidad, tales como co-expresión de los complejos de proteínas, antígenos y anticuerpos, la producción de partículas similares a virus de vacunas, o la producción de adenovirus o lentivirus para la transducción de líneas celulares difíciles.

En la era genómica post-humana, la disponibilidad de proteínas recombinantes en conformaciones nativas es crucial para la investigación estructural, funcional y terapéutico y el desarrollo. Aquí se describe una prueba a gran escala y sistema de expresión de proteínas en células embrionarias humanas de riñón 293T que se pueden utilizar para producir una variedad de proteínas recombinantes.

Una expresión adecuada y el general de la Plataforma para la producción de proteínas secretadas por las células humanas

La expresión de proteínas recombinantes en bacterias, típicamente E. coli, ha sido la estrategia más exitosa para la expresión de proteínas en cantidades de miligramos.

En este video, describimos un procedimiento eficiente en tiempo y costo para la expresión de proteínas secretadas a partir de células HEK 293T. Inicialmente, se prepara un cultivo de células HEK 293T al 40 % de confluencia en una placa de seis pocillos. Luego, se prepara una mezcla de transfección diluyendo GeneJuice y los plásmidos de prueba en medio libre de suero.La mezcla de transfección se deposita sobre las células, las cuales luego se incuban a 37 grados Celsius para permitir la expresión de proteínas. La detección de la proteína en el sobrenadante puede realizarse mediante inmunotransferencia (western blot). Una vez identificado un constructo adecuado, el procedimiento puede ampliarse utilizando fábricas de células de 10 capas.Las células se transfectan utilizando PEI como reactivo de transfección. Las proteínas pueden obtenerse a partir de los sobrenadantes de cultivo mediante filtración tangencial seguida de cromatografía de afinidad. En última instancia, esta plataforma permite la expresión de una amplia gama de macromoléculas en cantidades del orden de miligramos.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como la expresión en células de insect

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Biología

Un alto rendimiento, la plataforma automatizada de desarrollo de la fabricación línea celular para la producción de proteínas terapéuticas se describe. Implementación de BD clasificador de células FACS Aria, CloneSelect Imager y Libertad TECAN EVO sistema de manejo de líquidos se ha demostrado la capacidad de procesamiento aumentó significativamente en el desarrollo de líneas celulares con mejor calidad de línea celular y una alta reproducibilidad.

Una plataforma automatizada de alto rendimiento para el desarrollo de líneas celulares de fabricación de proteínas terapéuticas

Este protocolo de cinco días se esbozan todos los pasos, el equipo y el software complementario necesario para la creación y ejecución de un eficiente Escherichia coli endógeno basado sistema de expresión libre de células TX-TL a partir de cero. Con los reactivos, el protocolo de toma 8 horas o menos a la configuración de una reacción, recopilar y procesar datos.

Los protocolos para la implementación de un Escherichia coli Basado TX-TL-Cell de Libre Expresión de la biología sintética

El desarrollo de las proteínas de fusión biotinylatable tiene muchas aplicaciones potenciales en diversos campos de la investigación. La ingeniería de proteínas recombinantes es un procedimiento recta hacia adelante que es rentable, proporcionando altos rendimientos de proteínas de diseño personalizado.

Expresión, aislamiento y purificación de soluble e insoluble Biotinylated Proteínas del Tejido Nervioso para regeneración

La expresión de proteínas recombinantes por sistemas de mamíferos se está convirtiendo en un método atractivo para producir complejos de proteínas para biología estructural. Aquí presentamos un sistema de expresión simple pero altamente eficiente utilizando células de mamíferos cultivadas en suspensión para purificar complejos de proteínas para estudios estructurales.

Expresión de proteínas recombinantes para la Biología Estructural en HEK 293F Suspensión Células: Un enfoque novedoso y accesible

Describimos aquí un sistema de expresión de granzima rentable utilizando células HEK293T que produce altos rendimientos de proteasa pura, totalmente glicosilada y enzimáticamente activa.

Un alto rendimiento y sistema de expresión de costo-eficiente de granzimas humanos en células de mamífero

Este es un protocolo rápido y rentable para la producción de proteínas de mamíferos secretadas y glicosiladas y su posterior purificación en un solo paso con rendimientos suficientes de proteína homogénea para la cristalografía de rayos X y otros estudios biofísicos.

Efficient Expresión células de mamíferos y Single-step La purificación de glicoproteínas extracelular para la cristalización

La producción a escala de laboratorio de proteínas eucariotas con la modificación postraduccional adecuada representa una barrera significativa. Este es un protocolo robusto con un rápido establecimiento y respuesta para la expresión de proteínas utilizando un sistema de expresión de mamíferos. Este sistema admite aminoácidos selectivos, marcaje selectivo de proteínas y moduladores de moléculas pequeñas de la composición de glicanos.

High Yield La expresión de proteínas recombinantes humanos con la transfección transitoria de células HEK293 en Suspensión

Aquí, presentamos los protocolos para la utilización de la célula y baculovirus proteína expresión sistema insecto para producir grandes cantidades de proteínas vegetales segregada para la cristalización de proteínas. Un vector de expresión de baculovirus se ha modificado con GP67 o insectos hemolin péptido señal para la expresión de la secreción de la proteína de planta en células de los insectos.

Modificación de vectores de expresión de Baculovirus para producir secretado proteínas vegetales en células de los insectos

Este protocolo detalla los pasos, costos y equipamiento necesario para generar e. coli-basado en extractos celulares e implementar en vitro reacciones de la síntesis de proteína dentro de 4 días o menos. Para aprovechar la naturaleza flexible de esta plataforma para aplicaciones generales, se discuten las condiciones de reacción que pueden ser adaptadas y optimizadas.

Escherichia coli-base libres de células síntesis de la proteína: protocolos para una tecnología de plataforma robusta, flexible y accesible

Los estudios estructurales y bioquímicos de los transportadores de membrana humana requieren cantidades de miligramos de proteína estable, intacta y homogénea. Aquí describimos métodos escalables para seleccionar, expresar y purificar transportadores de solutos humanos utilizando genes optimizados para codones.

Expresión y purificación de alto rendimiento de portadores de solutos humanos para estudios estructurales y bioquímicos

Este protocolo describe el sistema de síntesis de proteínas libres de células (CFPS) utilizado en la construcción de células sintéticas. Describe las etapas clave con resultados representativos en diferentes microcompartimentos. El protocolo tiene como objetivo establecer las mejores prácticas para diversos laboratorios en la comunidad de células sintéticas, avanzando en el desarrollo de células sintéticas.

Sistema de síntesis de proteínas libres de células para la construcción de células sintéticas

Aprende a expresar proteínas secretadas usando células HEK 293T humanas con este protocolo eficiente. El método permite producir proteínas recombinantes en conformaciones nativas y escalar la producción usando fábricas de células de 10 capas.

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