Una expresión adecuada y el general de la Plataforma para la producción de proteínas secretadas por las células humanas

En este video, describimos un procedimiento eficiente en tiempo y costo para la expresión de proteínas secretadas a partir de células T Durant HEC 2 9 3 fabricadas. Inicialmente, se prepara un cultivo de células T HEC 2 9 3 con cofluente al 40% en una placa de seis mundos. A continuación, se produce una mezcla de transfección diluyendo el jugo de genes, y luego se prueban los plásmidos en medio libre de suero.

La mezcla de transfección se deposita en las células, que luego se incuban a 37 grados centígrados para permitir la expresión de proteínas. La detección de proteínas en el agente supan se puede realizar mediante Western blot. Una vez que se identifica una construcción adecuada, el procedimiento se puede ampliar utilizando fábricas de celdas de 10 capas.

Las células se transfectan utilizando PEI como transfección. El reactivo y la proteína se pueden recolectar de los sobrenadantes del cultivo mediante filtración de flujo tangencial seguida de cromatografía de afinidad. En última instancia, esta plataforma permite la expresión de una amplia gama de macromoléculas en cantidades de miligramos.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la expresión de células de insectos basada en el virus balo, es que se puede seleccionar y escalar un gran número de construcciones para su expresión, con resultados obtenidos en cuestión de tres semanas. Demostrando este procedimiento estará Hello Aiden para Shada Zini y Jonathan Cook. Tres estudiantes graduados de mi laboratorio Comience sembrando 250, 000 células T HEC 2 9 3 por pocillo en un volumen de un mililitro en una placa de seis pocillos, agregue un mililitro por pocillo de 10% de DMEM suplementado con PBS y S revuelva la placa para dispersar las células de manera uniforme.

A continuación, incubar las células durante la noche en una incubadora humidificada de dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados. Una vez que las células alcancen una fluidez de aproximadamente el 40%, reemplace el SUP natum con dos mililitros de medio fresco para preparar la mezcla de transfección. Primera alícuota de 90 microlitros de DMEM libre de suero en un tubo de orph terminal.

Luego agregue tres microlitros de jugo de genes, el reactivo de transfección, mezcle suavemente el contenido del tubo e incube a temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, agregue 10 microlitros de un stock de 100 nanogramos por microlitro del plásmido purificado de mini preparación, ADN. A transfectar.

Mezcle el contenido del tubo y déjelo reposar a temperatura ambiente durante 15 minutos. Para realizar la transfección, deposite la mezcla en las células T HEC 2 9 3. Gota a gota, hinche la placa suavemente para distribuir la mezcla de transfección de manera uniforme.

A continuación, incubar las células a 37 grados centígrados, 24 horas después, añadir un mililitro de medio fresco a cada pocillo e incubar durante 48 horas más. Tres días después de la transfección, se recolecta el supinato y se detectan los niveles de expresión de la proteína de interés por Western blot.

Una vez que se ha identificado un constructo apropiado, se puede ampliar el procedimiento de transfección. Usando fábricas de celdas de 10 capas, llene una fábrica de celdas con DMEM de 1,2 litros complementado con 5% FBS. Luego agregue 200 millones de células T HEC 2 9 3, distribuyendo las células de manera uniforme a todas las capas.

Cuatro matraces de cultivo de células cuadradas T de 225 centímetros cultivados al 100% de fluidez Co contienen alrededor de 200 millones de células. Incuba las células a 37 grados centígrados durante la noche. Prepare la mezcla de transfección en un matraz T 75 diluyendo 840 microgramos de ADN en 84 mililitros de estéril una vez. Pbs.

Agregue 2,5 mililitros de un miligramo por mililitro, solución de iones de polietileno o PEI, e incube la mezcla a temperatura ambiente durante 15 minutos. La solución debería volverse turbia. A continuación, vierta lentamente la mezcla de transfección en la fábrica de células y distribúyala bien.

Capas generales. Añadir ácido valproico a una concentración final de cuatro milimolares. Esto aumentará los rendimientos de expresión una vez que se haya agregado la mezcla de transfección.

Incubar el cultivo a 37 grados centígrados durante cuatro días para permitir la expresión de proteínas. Coseche el medio cuatro días después de la transfección e inmediatamente limpie la fábrica de celdas para su reutilización, centrifugue el medio recolectado a 6.000 G durante 30 minutos a cuatro grados centígrados y fíltrelo a través de un aparato de filtro de vacío de taza estérica de 0,22 micras para eliminar cualquier partícula. A continuación, utilice el sistema de filtración de flujo tangencial centra mate para concentrar el sobrenadante a 75 mililitros.

Una vez concentrado el sobrenadante, la proteína de interés puede purificarse mediante cromatografía de afinidad. En este experimento, purificamos las subunidades adjuntas de HA del dominio extracelular de los dos receptores AAL humanos utilizando el sistema a gran escala descrito aquí, seguido de cromatografía anti THA de alta afinidad. Como se muestra en este análisis de la página SDS teñida de kumasi.

Los dominios extracelulares de las dos subunidades receptoras alfa y gamma de la interleucina migran a los pesos moleculares de 40 kilodaltons y 46 kilodaltons. La heterogeneidad de los glicanos EnLink presentes en IL dos R alfa e IL dos R gamma causó un ensanchamiento de la banda en el gel de la página SDS. La banda de mayor peso molecular representa el BSA contaminante.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo expresar proteínas de cultivos celulares humanos utilizando fábricas de células de 10 capas. No olvide que las células T HC 2 93 se consideran biopeligrosas y deben manipularse en el nivel de bioseguridad dos. Use siempre ropa de protección personal adecuada y las superficies deben desinfectarse de acuerdo con las pautas institucionales y gubernamentales.