La extracción de RNA a partir de células Neuroprecursor utilizando el kit de Bio-Rad ARN total

Hola, soy Josh Sh, quien soy estudiante de posgrado en el laboratorio del Dr. Ed Maki en la Universidad de California en Irvine. Les mostraré cómo extraer ARN de células precursoras neuronales utilizando este kit BioRad para ARN mini. Ya he estado utilizando este kit durante varios años en este laboratorio y siempre me ha dado resultados consistentes con altos rendimientos.

Entonces, las células que utilizamos son células precursoras neurales Eton y media que se han disociado agudamente a partir de cortezas embrionarias, y generalmente las sembramos en una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos tratada con PD L y recubierta con laminina, a una densidad de cien mil células por pocillo. Antes de comenzar, debo indicarle que debe trabajar en un banco designado específicamente para sus procedimientos con ARN. Lo primero que debe hacer es asegurarse de que el banco de ARN esté limpio.

La forma adecuada de limpiar la bancada es usar este RNA zap. Básicamente, elimina cualquier ARN porque el RA destruye fundamentalmente sus ARN. Otra cosa es usar guantes siempre que manipule la extracción, ya que su piel está llena de estos ARN.

Así que está totalmente prohibido. Bien, lo que tengo aquí es el kit mini de AR total de BioRad. He sacado su contenido, así que déjenme mostrarles qué es.

Lo primero es que tenemos un PBS tratado con X dep C y etanol tratado con 70 %DEP. Tenemos una solución de licencia de ARN total a la que se le ha añadido etanol Dan me mayúscula. Lo segundo es un lavado de baja rigurosidad al que se le ha añadido etanol al 100 %, el lavado de alta rigurosidad, la solución de dilución de ADN, el propio ADN y la elución de ARN total.

Así que la solución, que colocaremos en el bloque de calor de 70 grados. Las otras cosas que necesitamos son tubos con tapa de 1,5 ml. Estos no contienen ADN ni ais, así que asegúrese de tener tubos que no contengan esas sustancias.

Y tenemos dos tubos de 2 ml sin tapa. Y lo más importante de todo son las columnas de ARN. Sin ellas, no se pueden realizar las extracciones de ARN.

Entonces, para armar estas columnas, necesita la columna de ARN y necesita las dos tapas mil sin tapón dos y simplemente ensámbrelas así y debería estar listo para comenzar. Bien, y lo último que siempre necesitamos son estas células. Las células aquí son células precursores neurales Eton y media.

Se disociaron agudamente a partir de cortezas embrionarias. Se han cultivado durante un par de días en medio temple. He sacado las células del incubador a 37 grados.

Este protocolo es específico para células adherentes. Estas células se cultivaron en placas de cultivo de tejidos tratadas de 0,4 pocillos que han sido recubiertas con PDL y laminina. Ahora voy a tomar una manguera de vacío y voy a aspirar, retirando el medio.

Y el siguiente paso consiste en agregar aproximadamente 500 microlitros del PBS con SEA desproteinizado. Y nuevamente, queremos utilizar puntas filtrantes. Ahora, el PBS tiene como función principal lavar el medio.

Por lo tanto, no desea que ninguno de los componentes del medio entre en su columna de ARN ni interfiera con la extracción de ARN, y si eso ocurre, no obtendrá buenos rendimientos. ¿De acuerdo? Voy a aspirar rápidamente el PBS porque las células madre neurales no toleran bien el PBS. Ahora voy a añadir 350 microlitros de tampón de lisis a cada una.

Bien, nuevamente, asegúrese de tener etanol beta a temperatura ambiente en el tampón de licencia. Ahora voy a pipetear hacia arriba y hacia abajo el tampón de lisis 15 veces para asegurarme de que las células estén lisadas. Así podemos extraer el contenido de ARN.

Ahora voy a añadir etanol al 70 % a cada pocillo; después de agregar 350 microlitros de este etanol al 70 %, voy a pipetear hacia arriba y hacia abajo en cada pocillo 10 veces. Pipeteé hacia arriba y hacia abajo 10 veces en cada uno. Ahora voy a ajustar mi pipeta a más de 700 microlitros, ya que el volumen total de cada pocillo es de 700 microlitros.

Luego, después de recoger la muestra que está por encima de 700 microlitros, la dispensaré en una columna de ARN. Después de agregar el contenido a la columna, procederé al centrífuga y la haré girar durante 30 segundos a velocidad máxima. Tras la primera centrifugación del lisado durante 32 segundos, descartaré el filtrado vaciándolo en un recipiente vacío.

O lo que hacen algunas otras personas es tomar una manguera de respaldo y aspirar el filtrado. A continuación, añadirá 700 microlitros del tampón de lavado de baja rigurosidad. Y nuevamente, asegúrese de añadir etanol a la mezcla.

Ahora lo voy a centrifugar durante 30 segundos a velocidad máxima. Después de centrifugar el tampón de lavado de baja rigurosidad, voy a desechar el filtrado. ¿De acuerdo? Luego voy a preparar la D, la solución de ADN.

Entonces, para cada muestra se agregarán cinco microlitros de ADN. En nuestro caso, en realidad aliquotamos el ADN antes de comenzar este paso, ya que, nuevamente, se trata de una enzima.

Es mejor almacenarlos como alícuotas. Si los almacena como un todo, los ciclos de congelación y descongelación destruirán la actividad enzimática. Por lo tanto, después de agregar los cinco microlitros de ADN, lo diluiré con 75 microlitros de la solución de dilución de ADN.

Entonces, después de agregar eso, el volumen total será de 80 microlitros de solución de ADN. Ahora voy a agregar 80 microlitros de la solución de ADN a cada muestra. Asegúrese de depositarla sobre la membrana de la columna.

Por lo tanto, desea que la solución de ADN impregne la membrana. Así eliminará el ADN. De este modo, aumentará su rendimiento de ARN.

Entonces, después de agregar los ADN, dejará la columna durante 15 minutos a temperatura ambiente para permitir que la enzima realice su trabajo. Y nuevamente, incubarás durante 15 minutos. Muy bien, el temporizador está apagado.

Después de la incubación de 15 minutos, voy a llevarlo a la centrífuga y centrifugar el ADN durante 30 segundos a velocidad máxima. Bien, después de centrifugar durante 30 segundos para eliminar el ADN, voy a desechar el filtrado. Ahora voy a añadir 700 microlitros con un tampón de alta rigurosidad para eliminar cualquier resto de ADN.

Luego de agregar eso, voy a centrifugar nuevamente durante otros 30 segundos en la centrífuga. Después de la centrifugación, voy a desechar el filtrado de alta rigurosidad, eliminándolo simplemente vertiéndolo en un recipiente. Y vamos a agregar 700 microlitros del tampón de baja rigurosidad.

Esta vez, lo voy a centrifugar durante un minuto a máxima velocidad en Centri Beach. Después del primer lavado de baja restricción de un minuto, voy a desechar el filtrado. Y esta vez no añadiré nada, sino que volveré a centrifugar durante otros dos minutos con el fin de eliminar el exceso de tampón de baja restricción, ya que este contiene etanol, lo cual reduciría el rendimiento de ARN.

Ahora voy a sacar el tampón de elución del bloque térmico a 70 grados. Solo para recordarle, asegúrese antes de comenzar el experimento de que el tampón de elución esté a 70 grados y queremos mantenerlo caliente para aumentar la eficiencia de su rendimiento de ARN. Así que ya tengo las columnas listas.

Se han sacado de la centrífuga. Así que los próximos pasos son retirar las columnas. Bien, voy a descartar los tubos del tapón y vamos a transferirlos a estos tubos cat.

Va a añadir 50 microlitros del tampón Lucian a cada columna. Asegúrese de aplicar el tampón de elución sobre la membrana para que la impregne completamente. Si no lo hace, no obtendrá un buen rendimiento de ARN.

Ahora deje la columna reposar durante uno o dos minutos para asegurar que la solución está impregnando la membrana de la columna. Bien, ya pasó un minuto. Ahora puedo llevarla a la centrífuga.

Ahora voy a colocar las columnas en la centrífuga. Las voy a centrifugar durante un minuto a velocidad máxima. Y este es el último paso de centrifugación, en el cual recogerás el eluyente o el ARN en estos tubos con tapa.

Ahora, tras la última centrifugación, retire su contenido, elimine la columna, puede desecharla, cierre el tubo y ahora puede almacenarlo a -80 °C; posteriormente puede hacer con él lo que desee. Acabo de extraer ARN utilizando el kit de ARN de BioRad. Ahora voy a medir la concentración del ARN extraído, o podemos leer la DO mediante un espectrofotómetro.

Entonces esto es lo que voy a mostrarle. Primero, debemos preparar una mezcla de dilución. Será una dilución uno a cinco.

Vamos a mezclar nuestro ARN y agua filtrada MQ. Primero, prepararé un blanco. Tomaré dos microlitros de la solución de elución que usamos para eluir nuestro ARN al principio, y añadiré ocho microlitros de agua molecular. ¿De acuerdo?

Entonces, eso es nuestro blanco. Ahora voy a preparar la muestra. Serán dos microlitros de nuestro ARN de interés.

Vamos a agregar, nuevamente, ocho microlitros de agua MQ. Así obtendremos una dilución uno a cinco, ¿verdad? Tengo este vial de vidrio donde voy a colocar mis muestras, y luego cargaré este vial en el espectrómetro.

Así que vamos a medir esto. Antes de medir la DO de las muestras de ARN, tendré que limpiar mi vete. Nuevamente, aquí está la vete de vidrio.

Nunca, bajo ninguna circunstancia, debe tocar la parte frontal de él. De lo contrario, dejará huellas dactilares que alterarán las mediciones. Por lo tanto, lo primero que voy a hacer es lavar la llave de vidrio con agua doblemente desionizada.

Luego voy a tomar una manguera de vacío. Voy a aspirar el agua. Después de ese lavado, lo lavaré con etanol al 95%, y luego volveré a usar una manguera de vacío para eliminar el etanol.

Ahora estoy listo para cargar mi blanco. Necesitamos primero el blanco para normalizar nuestras lecturas. Así que voy a tomar 10 microlitros de la mezcla que acabamos de preparar.

Así que voy a mezclar nuestra solución de arriba abajo y obtener una mezcla homogénea. La llevaré a este espectrofotómetro. Esta es la máquina Ultra Spec 3 con sonda, y vamos a medir la concentración de ARN.

Así que abra la máquina y colóquela en uno de estos portamuestras. Vamos a manipular los programas de manera que solo lea ARN. Bien, nuevamente, realizamos una dilución de uno a cinco.

Entonces, queremos establecer nuestro factor de dilución en cinco. Muy bien, ya estoy listo para comenzar. Voy a presionar ejecutar para referenciar el blanco.

Muy bien, ahora está calibrado a cero. Así que ya estamos listos para medir nuestra muestra. Voy a sacar la cama de vidrio con la llave.

Voy a extraer el contenido del blanco. Nuevamente, lo voy a lavar con agua doblemente destilada. Lo voy a lavar con etanol al 95%.

Ahora estoy listo para cargar 10 microlitros de nuestra muestra de interés. Así que nuevamente, asegúrese de mezclar bien su muestra. Luego, cárguela en el vial de vidrio.

Ahora estamos listos para leer. Después de medir la DO, un buen rendimiento debería mostrar una relación de absorbancia de ARN a 260 y 280 de aproximadamente 2. Y el rendimiento es de unos 144 microgramos por mililitro.

Aunque la máquina indique 72 microgramos por mil, debemos multiplicar esto por dos debido a la longitud media en nuestros equipos, dos centímetros mostraron cómo extraer ARN de células precursoras neuronales. Nuevamente, estamos utilizando el kit total mini ARN de BioRad. Probamos otros kits y este es el mejor kit que utilizamos según su eficiencia.

Eso proporciona ARN de alta calidad. Si utiliza este kit, obtendrá los mismos resultados de alta calidad que siempre obtenemos.