Grabación óptica de la actividad neural suprathreshold con la resolución de una sola célula y único punta-

El objetivo general del experimento FollowMe es registrar la actividad de aumento neuronal de un gran número de neuronas. Esto se logra observando el aumento de la concentración de calcio intracelular en un soma neuronal asociado con cada potencial de acción utilizando microscopía de fluorescencia en el primer paso. Se utilizan dos excitaciones de fotones y un principio de escaneo de acceso aleatorio para registrar señales fluorescentes de calcio de 40 neuronas somato con una alta resolución espacial y temporal.

En el segundo paso, se extraen los tiempos precisos de los picos de las señales fluorescentes mediante un algoritmo de deconvolución. Esta técnica se puede utilizar para registrar la actividad de picos de decenas de neuronas. Los datos de picos se pueden utilizar para medir la información mutua, la propagación de señales entre poblaciones neuronales o las correlaciones neuronales.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el registro de microelectrodos, es que se puede registrar la actividad de picos neuronales de un gran número de neuronas de una población local. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la función cortical a nivel de redes locales de neuronas, como la importancia de las correlaciones en la búsqueda de información y los cambios en la dinámica de las redes con la plasticidad cortical. Para la excitación de dos fotones, se utiliza un sistema láser de pulso infrarrojo con pulsos de femtosegundos. Se requiere una alta potencia de salida del láser para compensar las grandes pérdidas introducidas por los componentes ópticos del sistema.

Un predicador por sistema, que consta de dos prismas, imparte una dispersión de velocidad de grupo negativa sobre los pulsos láser antes de los deflectores ópticos custo, para compensar la dispersión temporal introducida por los AODs: dos AODs con grandes aperturas desvían el rayo láser en dos dimensiones. A 13 centímetros detrás de los AODs se coloca una graduación de difracción reflectante con 100 ranuras por milímetro para compensar la dispersión espacial introducida por los AODs. Cuando se utilizan pulsos láser cortos, el rayo láser se dirige con dos telescopios de relé al puerto de la cámara de un microscopio vertical.

Los iris se colocan a intervalos regulares para la alineación de los componentes ópticos. Un divisor de haz dicroico frente al objetivo transmite la luz de excitación infrarroja a la muestra y refleja la luz de fluorescencia desde la muestra a un detector. Los detectores de fluorescencia epi y trans recogen la señal de fluorescencia a través del objetivo y los filtros de vidrio coloreado del condensador se colocan delante de los detectores para evitar que la luz de excitación llegue a los detectores.

Los ángulos de deflexión A OD son controlados por una computadora equipada con una placa convertidora analógica digital, que a su vez acciona osciladores controlados por voltaje. La señal de los fotomultiplicadores se transmite a través de un filtro Butterworth de paso bajo con una frecuencia de corte de 100 kilohercios y se digitaliza mediante un convertidor digital analógico a una velocidad de reloj de 156,25 kilohercios antes de almacenarse en una computadora para su análisis, la alineación y el ruido eléctrico se prueban registrando la distribución de señales fluorescentes con y sin luz láser a baja y alta ganancia de los fotomultiplicadores, así como con y sin indicador, el escaneo de acceso aleatorio difuminado se basa en la detección de aumentos intracelulares de calcio. El primer paso en el protocolo es teñir un gran número de neuronas con la forma Esther de un indicador de calcio mediante inyección en bolo.

A continuación, registre la actividad del soma en cada neurona en cuatro ubicaciones durante 6,4 microsegundos en cada ubicación. Para seleccionar las neuronas de interés, adquiera un fotograma completo que consta de 256 por 256 píxeles. A continuación, seleccione manualmente los centros de las neuronas que se registrarán dentro de esta imagen.

El software de control agrega automáticamente tres puntos a una distancia de dos micras alrededor de cada centro en cada ciclo. La señal fluorescente se registra desde las cuatro ubicaciones en las 40 neuronas. La grabación de todas las neuronas en un ciclo requiere 1.536 milisegundos.

Repita esta grabación secuencial de las 40 neuronas durante cinco segundos. La detección de picos a partir de señales fluorescentes de calcio somático se basa en una alta relación señal/ruido. Se puede lograr una alta relación señal/ruido aumentando la intensidad de la excitación.

Sin embargo, la intensidad de la excitación solo se puede aumentar hasta un cierto límite debido al daño fotográfico. Solo hay una ventana muy pequeña de intensidad de excitación en la que el daño fotográfico es bajo y la relación señal/ruido es suficiente para detectar picos individuales con el fin de garantizar que las señales registradas estén dentro de la ventana de detección de picos altos. Durante un experimento, se utilizan una serie de softwares de análisis en línea desarrollados por nuestro laboratorio.

A continuación, calcule la tasa aproximada de fotones por neurona a partir de una breve ventana de tiempo de ruido de referencia de aproximadamente 100 a 200 milisegundos. El número de fotones y la tasa de fotones se calculan a partir de los valores de fluorescencia ajustando la distribución de los cambios relativos de fluorescencia con esta ecuación, luego calculan la fluorescencia de referencia desde la misma ventana de tiempo y la representan en función del tiempo o los ensayos. Mantenga la disminución promedio de la línea de base por debajo de 0.0002 por segundo ajustando la potencia del láser.

Porque la detección de picos disminuye rápidamente cuando se supera este límite. Después de eso, verifique las posiciones somáticas de las neuronas cada 10 a 20 minutos adquiriendo una imagen de fotograma completo. Ajuste las ubicaciones de grabación si es necesario.

Las señales fluorescentes resultantes de la actividad neuronal a menudo se comían a tiempo debido a la larga descomposición transitoria del calcio. En este procedimiento, se utiliza un método de deconvolución para los picos y los tiempos de los picos de las señales fluorescentes. Aquí utilizamos un algoritmo genético para determinar el modelo de tren de picos más probable que se ajuste a la señal fluorescente registrada.

Con cada iteración del algoritmo, la máxima verosimilitud se aproxima asintóticamente a su máximo que viene dado por el ruido de los registros de fluorescencia. En las poblaciones homogéneas de neuronas, la señal de calcio provocada por la espícula puede variar entre las neuronas. Para el análisis no supervisado de grandes conjuntos de datos, diseñamos un algoritmo que tiene en cuenta la variación de la señal de calcio evocada por el pico de una neurona a otra para evitar un gran número de detecciones de falsos positivos.

La distribución conjunta de la amplitud y la constante de tiempo de decaimiento de un solo transitorio de calcio evocado por espiga se registran en un conjunto separado de experimentos del mismo tipo de neuronas en las mismas condiciones experimentales. Para tener en cuenta los cambios lentos en la línea de base y reducir los costos computacionales de la descontaminación, las grabaciones más largas se dividen en varias trazas más cortas de uno a cinco segundos para cada neurona en cada grabación, el algoritmo de deconvolución puede probar un gran número de modelos hasta 1 millón de modelos diferentes o más para acelerar la deconvolución. En paralelo.

Después de la deconvolución, se analizan e inspeccionan los datos de los picos. El periestímulo, el tiempo, el histograma, la probabilidad de pico y la tasa de disparo de las neuronas se calculan de forma automatizada. Estos son los ejemplos de una señal fluorescente registrada a una tasa de excitación muy baja y la otra a una tasa de excitación muy alta dentro de la ventana de detección.

Tenga en cuenta que cada ejemplo muestra la respuesta a un pico. Aquí se muestra una fotomicrografía de un corte agudo de cerebro y dos pipetas de estimulación colocadas en la misma columna cortical. En la capa cuatro, estos muestran las respuestas neuronales para los estímulos repetitivos, y este gráfico muestra la información mutua de Shannon señalada por la población de neuronas registrada.

Aquí está la medición de la propagación de la actividad de picos de superumbral entre diferentes poblaciones de neuronas corticales. Estos son los picos detectados en las neuronas corticales, en respuesta a la estimulación eléctrica de las fibras corticales thal. Al registrar la actividad neuronal mediante el escaneo de acceso aleatorio, es muy importante registrar dentro de la ventana de detección.

De lo contrario, es muy fácil terminar con conjuntos de datos inutilizables. La detección óptica de picos aún está en pañales. Hay mucho margen de mejora.

Con algunas mejoras, grabamos desde aún más neuronas. Con otras mejoras, incluso podremos grabar en animales despiertos y comportándose.