Neuroimagen Funcional Utilizando ultrasonidos hematoencefálica perturbación de la barrera y la RM-manganeso mayor

El objetivo general del siguiente experimento es obtener imágenes de la actividad neuronal del ratón mediante resonancia magnética mejorada con manganeso. Esto se realiza estimulando unilateralmente la vibración y cartografiando la respuesta neuronal en la corteza del campo barril contralateral. El primer paso consiste en armar y calibrar el sistema de ultrasonido, compuesto por un transductor de ultrasonido sin enfoque, impulsado por un generador de señales y un amplificador para el experimento.

Después de una inyección intraperitoneal de manganeso, se abre la barrera hematoencefálica mediante ultrasonido y microburbujas, lo que permite que el manganeso entre en el parénquima cerebral. A continuación, el ratón se somete a un paradigma de estimulación neuronal, lo que provoca una mayor acumulación de manganeso en las regiones cerebrales más activas. Finalmente, se obtienen imágenes por resonancia magnética que muestran diferencias regionales en la intensidad de la imagen ponderada en T1 según los distintos niveles de acumulación de manganeso en el cerebro.

En neurociencia, el ratón es el sistema modelo predominante para estudiar las bases genéticas y moleculares del desarrollo cerebral y de las enfermedades. Esta técnica proporciona una herramienta no invasiva para mapear la actividad neuronal en estos modelos de ratón. La interrupción ultrasónica de la barrera hematoencefálica no solo puede utilizarse para administrar manganeso al parénquima cerebral con fines de neuroimagen funcional, sino que también puede emplearse para entregar una amplia variedad de otros compuestos al parénquima cerebral, incluyendo agentes de contraste basados en gadolinio o quimioterapéuticos.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades para calibrar el sistema de ultrasonido y manipular los microtransductores. La demostración del procedimiento estará a cargo de cada uno de los técnicos en nuestro laboratorio. El sistema de ultrasonido consta de un transductor ultrasónico de un solo elemento con un diámetro suficientemente amplio para cubrir el cerebro del ratón y una frecuencia central en el rango de dos megahercios.

El transductor es accionado por un generador de señales y un amplificador de potencia de 50 decibelios, que produjo la secuencia de pulsos de ultrasonido. Calibre el sistema de ultrasonido en un tanque de agua. Coloque el hidrófono en el fondo del tanque y posicione el transductor sobre él con una etapa de traslación de tres ejes.

Luego, aplique un tren corto de pulsos sinusoidales al transductor y ajuste la plataforma para encontrar la respuesta máxima, que debe estar en el centro del haz de ultrasonido y en el foco natural del transductor. A continuación, realice varias mediciones de presión acústica en un rango de voltajes de entrada y utilice una regresión lineal para estimar la relación entre el voltaje de entrada y la presión acústica. Determine la amplitud del pulso para generar una presión acústica negativa máxima de aproximadamente 0,36 megapascales.

En este paso, anestesie al animal administrando el isoflurano a través del cono nasal. El aparato del cono nasal debe fijar la cabeza del animal de forma precisa y confiable en la misma posición cada vez; nuestro dispositivo mantiene la cabeza en posición plana respecto al cráneo. Durante el experimento, se utiliza una almohadilla neumática para monitorear la frecuencia respiratoria y ajustar el anestésico con el fin de mantener una frecuencia respiratoria entre 85 y 125 respiraciones por minuto. Al mismo tiempo, supervise la temperatura del animal con una sonda rectal y mantenga su temperatura corporal mediante una lámpara de calor o aire caliente soplado.

A continuación, inserte un catéter en la vena de la cola y un catéter intraperitoneal en el animal. El siguiente paso consiste en recortarle el pelo para demostrar la estimulación unilateral del nervio VII y mapear la respuesta neuronal en la corteza del campo de barriles contralateral. Corte el nervio VII contralateral lo más cerca posible de la superficie de la piel sin irritar el folículo ni la piel circundante.

Luego transfiera el animal al sistema de ultrasonido y aplique el gel de ultrasonido sobre el cuero cabelludo, en la lámina plástica delgada inferior que contiene una columna de agua sobre la cabeza. Atraviese la columna de agua con un hisopo de algodón para eliminar cualquier burbuja de aire atrapada en el gel de ultrasonido. A continuación, coloque el transductor de ultrasonido en el agua a su distancia focal natural directamente sobre el cerebro del ratón y limpie el transductor con el dedo para eliminar cualquier burbuja de aire atrapada.

Posteriormente, produzca las microesferas lipídicas de perrin agitando el vial en el agitador durante 45 segundos mientras trabaja. Deje el vial a temperatura ambiente, pero guárdelo en el refrigerador después del último uso del día anterior al primer uso. En días posteriores, agite el vial almacenado en el agitador nuevamente.

A continuación, inyecte 0,5 milimol por kilogramo de cloruro de manganeso por vía intraperitoneal y espere 10 minutos para permitir su distribución. Luego, agite el vial de microburbujas manualmente durante un minuto para resuspender las microesferas. Posteriormente, retire 30 microlitros más el volumen muerto del catéter.

Tenga cuidado de no inyectar aire en el vial, ya que esto degradará las microburbujas restantes. Inicie inmediatamente la secuencia de pulsos de ultrasonido e inyecte las microesferas a través del catéter en la vena de la cola con el mínimo retraso posible. Continúe la sonificación durante tres minutos.

Luego apague el sistema de ultrasonido. Después de que el nivel de manganeso en el cerebro se haya estabilizado durante aproximadamente 40 minutos, apague el isoflurano y retire el cono nasal. En este momento, comience el paradigma de estimulación neuronal para mapear la corteza del campo de los barriles.

Mueva un pincel con un movimiento circular a una frecuencia de aproximadamente uno a cinco hercios a través de la matriz vibrotáctil contralateral durante 90 minutos. Reanude la anestesia después de la estimulación, luego continúe manteniendo la temperatura corporal y titulando el nivel de isoflurano hasta alcanzar una frecuencia respiratoria de 85 a 125 respiraciones por minuto. A continuación, coloque al ratón en una bobina de RM y transfiéralo al sistema de resonancia magnética.

Luego, adquiera las imágenes ponderadas en T1 de alta resolución con tres DT, como se muestra aquí. La alteración de la barrera hematoencefálica tras la administración de un agente de contraste que acorta el tiempo T1, como el manganeso o un agente a base de gadolinio, provoca un aumento de la señal en el parénquima cerebral en imágenes ponderadas en T1 en comparación con los cerebros en los que no se realizó BOMA. Aquí se muestran los mapas de actividad neuronal generados mediante la estimulación unilateral del risi en siete animales, en la primera columna.

Los mapas de diferencia en dos ubicaciones distintas muestran una señal de MRI aumentada contralateral al estímulo aplicado mediante brissy. En la segunda columna, los mapas de valores p indican la significancia relativa de estas diferencias. En la tercera columna, los diagramas correspondientes del atlas cerebral muestran que estas regiones activas corresponden al campo de los bigotes de la corteza sensorial primaria.

Con práctica, esta técnica puede realizarse en aproximadamente dos horas más la duración de la simulación. Al realizar el procedimiento, es importante recordar agitar el vial de microburbujas antes de la inyección y tener cuidado de no inyectar aire en el vial. Además, es fundamental asegurarse de que no queden burbujas de aire atrapadas en el gel de ultrasonido ni debajo del transductor de ultrasonido.

Para esta demostración, hemos elegido estimular los bigotes, aunque es evidente que esta técnica puede adaptarse para estudiar cualquier estímulo de interés. Tras el procedimiento, el animal puede recuperarse completamente, lo que permite estudios longitudinales.