Time-lapse de imágenes de Migración neuroblasto en rodajas agudas del cerebro anterior ratón adulto

Se describe un protocolo en tiempo real videoimaging de la migración neuronal en el cerebro anterior del ratón. La migración de viralmente marcados o injertado precursores neuronales se registró en rebanadas agudas en vivo utilizando de gran campo de imagen fluorescente con un intervalo de adquisición relativamente rápido para estudiar las diferentes fases de la migración de células, incluyendo las duraciones de las fases estacionaria y la migración y la velocidad de migración.

El objetivo general de este procedimiento es estudiar la migración de neuroblastos en cortes agudos del cerebro de ratón adulto cuatro. Esto se logra marcando primero los precursores neuronales en la zona subventricular adulta de cinco a ocho días después del marcaje de los neuroblastos, preparando cortes agudos del ratón para el cerebro. A continuación, se realizan las imágenes de lapso de tiempo de la migración de los neuroblastos.

En última instancia, la microscopía en tiempo real de campo amplio se utiliza para mostrar la dinámica de la migración de neuroblastos en cortes agudos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del desarrollo neuronal mediante el estudio del papel de las diferentes señales moleculares y los mecanismos celulares que involucran la migración celular. Ahora, este método puede proporcionar información sobre los procesos fisiológicos que regulan la migración neuronal en un adulto para el cerebro, pero también se puede aplicar en otros sistemas, como el estudio de la migración neuronal en el cerebro isquémico y durante el desarrollo embrionario.

Comience este procedimiento preparando un líquido cefalorraquídeo artificial a base de sacarosa para cortar las rodajas y un LCR A a base de cloruro de sodio de 32 grados Celsius para mantener las rodajas hasta la obtención de imágenes, luego oxigenar las soluciones burbujeándolas continuamente con 95% de oxígeno, 5% de dióxido de carbono. A continuación, anestesiar al ratón con el neuroblasto marcado con fluorescencia utilizando ketamina xilacina por vía interna. A continuación, prepare rápidamente la solución de corte helada con aspecto gelatinoso utilizando nitrógeno líquido.

Después de eso, tome de 15 a 20 mililitros de solución de corte helada con una jeringa de 20 cc y perfunda el ratón intra Cardi. Si los vasos sanguíneos necesitan ser marcados en lugar de perfundirse con la solución de corte, inyecte 200 microlitros de dextrano rojo Texas a una concentración de 10 miligramos por mililitro, trans Cardi en el ventrículo izquierdo del corazón, y espere de dos a tres minutos antes de decapitar al ratón después de la perfusión transcardial después de la perfusión transcardial, decapitar al ratón, sumergir rápidamente la cabeza en la solución de corte helada y moverla al vibrato. Cortar el cráneo con unas tijeras a lo largo de la sutura sagital desde el cerebelo hasta el bulbo olfatorio.

Posteriormente, retire suavemente los colgajos craneales con un par de pinzas Después, extirpe la parte mimada del cerebro con un bisturí. Luego haz dos cortes sagitales en la parte más lateral de cada hemisferio, y corta el cerebro a lo largo de la fisura intrahemisférica. A continuación, retire suavemente el cerebro con una espátula y colóquelo en una solución de corte helada y fría.

Coloque los dos hemisferios por separado en un bloque de agar al 4% con el lado dorsal tocando el agar. A continuación, pega el bloque con el lado cortado lateralmente de los dos hemisferios a la plataforma de un Vibram con el lado medial hacia arriba. Después de eso, coloque la plataforma en la cámara Vibram.

Llénalo con la solución de corte. A continuación, mantenga la solución oxigenada durante toda la preparación de la rebanada burbujeándola con un 95% de oxígeno y un 5% de dióxido de carbono. Ahora prepara las secciones de 250 micras de grosor con el vibrador.

Se debe utilizar una velocidad de corte baja y una vibración de la hoja de alta frecuencia para obtener secciones de alta calidad. Tan pronto como se suelte una rebanada de la cuchilla, retírela suavemente de la solución de corte y colóquela en una cámara de incubación llena de líquido cefalorraquídeo A oxigenado mantenido a 32 grados centígrados en un baño de agua. En este procedimiento, se colocó cuidadosamente el corte en la cámara de imágenes del microscopio para evitar que el corte se desvíe durante la toma de imágenes.

Estabilízalo colocando con cuidado una malla de nylon en la parte superior. Asegúrese de que el corte esté continuamente perfundido con un CSF. A continuación, use un objetivo de 10 x para encontrar un campo de interés.

Abra el software metamorph y asegúrese de que la malla de nailon no obstruya el campo de imagen. A continuación, activa el objetivo de 40x y ajusta el enfoque. Asegúrese de que haya suficiente solución entre el objetivo y la rebanada.

Usando el software metamorph, establezca los parámetros de adquisición de lapso de tiempo, como la duración de la excitación, el número de planos Z, la distancia entre cada sección Z, el intervalo de tiempo y la duración de la grabación. A continuación, inicie la adquisición de lapso de tiempo. Los datos son guardados automáticamente por Metamorph como un archivo tiff con cada archivo correspondiente a un punto de tiempo del video de lapso de tiempo adquirido para abrir la película en

Mrs.Cargue las imágenes adquiridas simplemente arrastrando y soltando la primera imagen de punto de tiempo del video en el icono del programa. Una vez cargada la película, ajuste el brillo y el contraste de la señal en la ventana de ajuste de la pantalla. Establezca los parámetros del vídeo adquirido, como el tamaño del vóxel y el intervalo de tiempo en las propiedades de la imagen, y establezca ventanas de puntos de tiempo equidistantes.

Después de especificar el tamaño del vóxel, es posible ver el fotograma en 3D, así como el tiempo y la escala del video para rastrear automáticamente las celdas grabadas. Cree un punto para cada celda en el campo en la ventana de rebase eligiendo la función de puntos, mida el diámetro de la celda que se rastreará en la ventana de corte. Establezca los parámetros para el seguimiento y continúe.

Inspeccione la fiabilidad de los objetos detectados a lo largo del tiempo. Si no se detectan automáticamente todas las celdas que migran, cambie el umbral de detección y asegúrese de que todas las celdas se hayan seleccionado con puntos en todos los puntos temporales. La distancia máxima y el tamaño máximo del espacio entre dos puntos que representan puntos de tiempo vecinos de la misma pista deben especificarse para que el programa pueda conectar los puntos de tiempo.

Una vez que se crean las pistas, es posible filtrarlas y eliminar las pistas irrelevantes simplemente eliminándolas. Las pistas se pueden corregir conectando y desconectando diferentes pistas y diferentes puntos de tiempo de la misma pista tan pronto como se hayan realizado todas las correcciones. Eche un último vistazo a las pistas y exporte los datos, incluido el desplazamiento de la celda por punto de tiempo, la longitud de la pista, la longitud del desplazamiento y la duración de la pista a un archivo de Excel.

Este video muestra las imágenes de lapso de tiempo de la migración de neuroblastos verdes a lo largo de los vasos sanguíneos marcados con dextrano, Texas marcados con rojo rojo. Nótese que los neuroblastos migratorios muestran un comportamiento saltatorio cuando las fases migratorias se interrumpen con períodos estacionarios. Y este video muestra el seguimiento de la migración de neuroblastos por el software imas.

Las esferas y las líneas indican los cuerpos celulares y las pistas de migración de las células individuales, respectivamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que se deben obtener cortes de vida aguda de buena calidad del prosencéfalo de ratón adulto. Además, los cortes deben estabilizarse bien en la cámara de imágenes colocando cuidadosamente una malla de nailon para evitar que el corte se desvíe durante la toma de imágenes.

Cualquier cambio en la tasa de perfusión del LCR A, una perfusión irregular o una variación drástica de la temperatura pueden causar deriva y cambios en el plano focal durante la toma de imágenes. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo registrar y analizar la migración de neuroblastos en los cortes agudos de adultos. Recomendamos utilizar un intervalo médico corto del orden de 15 a 30 segundos para identificar de manera confiable el comienzo y el final de las fases migratorias y estacionarias.