Preparación de agudos Slices zona subventricular for Imaging Calcio

El objetivo de este procedimiento es obtener imágenes de la actividad del calcio de las células de la zona subventricular postnatal. Esto se logra primero extrayendo cuidadosamente el tejido cerebral de un ratón postnatal. El segundo paso es hacer cortes de cerebro agudos vivos que contengan la zona subventricular.

A continuación, las rodajas de cerebro se cargan con un tinte sensible al calcio. El paso final es obtener imágenes de la actividad con un microscopio confocal de lapso de tiempo. En última instancia, las imágenes de lapso de tiempo de la actividad del calcio en las células de la zona ventricular se utilizan para mostrar la dinámica de la actividad intercelular y revelar los patrones de comunicación entre los diferentes tipos de células y la vasculatura.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurogénesis, como cómo los diferentes tipos de células se comunican entre sí y cómo las células pueden influir en la vasculatura después de sacrificar y decapitar a una cría de ratón P 20 a P 30. De acuerdo con las pautas aprobadas institucionalmente, coloque la cabeza en un campo de bandeja con solución de disección. Estabilice la cabeza con pinzas y use microtijeras para hacer cortes continuos alrededor del cráneo y la línea media.

Asegúrese de que el bulbo olfativo permanezca unido al cerebro y no se dañe. Haga cortes en el lado dorsal y luego use fórceps para extraer el cráneo suprayacente del cerebro. Luego, mientras aún sostiene la cabeza con fórceps, use una cuchilla quirúrgica para hacer un corte coronal a nivel de lambda.

Use la misma hoja de afeitar para hacer cortes sagitales en ambos lados del cerebro aproximadamente de dos a tres milímetros laterales a la línea media. Luego, use la cuchilla para recoger debajo del cerebro y sacarlo completamente del cráneo. El procedimiento hasta este punto debe realizarse en menos de tres minutos.

Coloca un poco de superpegamento a base de cianoacrilato en la placa del vibram. A continuación, recoge el tejido cerebral y móntalo en uno de los lados planos creados por el corte sagital lateral. El montaje de un bloque de agarosa para estabilizar el tejido durante el corte es opcional.

Enjuague la cuchilla vibram con etanol para eliminar los aceites y luego enjuague con agua destilada. Coloque la cuchilla en el soporte de la cuchilla y monte el soporte de la cuchilla en el vibrador. Ajuste el vibrador de modo que las rodajas de tejido se corten a un grosor de 250 a 350 micras a alta frecuencia, vibración y baja velocidad y se seccionen progresivamente a través del tejido.

La apariencia del bulbo olfatorio es un buen indicador de que las secciones sagitales se están acercando a la zona subventricular. La aparición de los ventrículos y el engrosamiento del cuerpo calloso también son buenos indicadores de la aparición posterior de la zona subventricular. Una vez alcanzada la zona subventricular, utilice una pipeta de plástico para pasta con la punta cortada para retirar cada loncha y transferirla a una cámara de retención de lonchas.

Con un CSF. Las rodajas requieren una hora de incubación en un CSF A. Durante este tiempo, las pipetas, el tinte y el microscopio se pueden preparar para los siguientes pasos de obtención de imágenes.

Para preparar las pipetas, extraiga de seis a ocho pipetas de vidrio de modo que cada una tenga una longitud de punta de unos dos milímetros y un diámetro de dos a tres micras. Además, el soporte de pipeta está preajustado en un ángulo de unos 16 grados para que la pipeta pueda montarse sin entrar en contacto con la cámara de perfusión ni interferir en la colocación del objetivo. Para preparar el colorante cálcico, agregue 4,6 microlitros de solución ónica F1 27, 20% en DMSO a una alícuota de 50 microgramos de gripe oh cuatro.

Finalmente, para preparar la bomba peristáltica, cuyo uso ayuda a minimizar la deriva de la imagen, pase un líquido cefalorraquídeo a través de las líneas de perfusión y asegúrese de que las líneas estén libres de burbujas. Ahora, coloque la punta de vacío para asegurarse de que la solución se aspire desde la cámara de perfusión. Esta imagen muestra la configuración del sistema de perfusión.

La solución debe estar a un nivel adecuado para sumergir el objetivo a la distancia de trabajo adecuada, pero no tan alto como para que la solución se derrame por los lados de la cámara. Escuche la estabilidad para verificar una aspiración constante para aplicar el tinte de carga a través del método del baño. Primero, haga de uno a dos mililitros de la solución de trabajo de colorante de cuatro a cinco micromolares diluyendo la solución madre.

En un líquido cefalorraquídeo A, transfiera las rodajas a un plato cultivado de 35 milímetros con un fondo de malla relleno de líquido cefalorraquídeo A. Utilice una pipeta de transferencia de plástico de tres mililitros para retirar suavemente el líquido cefalorraquídeo A y, al mismo tiempo, añadir la solución de trabajo del colorante cálcico. Luego incube a 37 grados Celsius durante 30 a 60 minutos en un ambiente controlado con gas de 5% de dióxido de carbono.

Después de la incubación, vuelva a colocar la rebanada en la cámara de retención llena de líquido cefalorraquídeo A para lavar el tinte que no haya entrado en las células. Después de 30 minutos en un líquido cefalorraquídeo, transfiera el corte a la cámara de perfusión para la aplicación a presión del tinte. Transfiera un corte de la cámara de retención a la cámara de perfusión en la configuración del microscopio.

A continuación, rellene la pipeta de vidrio con una solución de trabajo de colorante de 250 micromolares. Asegúrese de que la punta de la pipeta esté libre de burbujas y colóquela sobre el micromanipulador. Ahora baje la pipeta a la región de interés.

La pipeta se puede colocar de manera que la punta esté a varios micrómetros por encima de la superficie cortada, o enterrada a varios micrómetros por debajo de la superficie, pero lejos de la región registrada. Configure el pico rociador para que produzca menos de tres libras por pulgada cuadrada y aplique el tinte durante uno o dos minutos. Es posible que sea necesario repetir las aplicaciones dependiendo de la etiqueta, según se evalúe a ojo.

Cuando se aplica a la superficie del corte, este protocolo marcará preferentemente el neuroblasto cuando se aplique por debajo de la superficie, esta técnica marcará preferentemente los astrocitos, pero si se aplica durante más de tres minutos a una concentración de 500, se marcará el neuroblasto micromolar. Independientemente de la ubicación de la punta de la pipeta, deje que la rebanada se lave y se recupere en un líquido cefalorraquídeo durante 30 a 45 minutos. Localice la región de interés con un objetivo de menor potencia y, a continuación, cambie a un objetivo de inmersión en agua de mayor potencia y evalúe el estado de las células de la región de interés.

Bajo un contraste de interferencia diferencial, las células sanas aparecen redondas y regordetas y muestran una leve carga de gripe. Después de verificar que la perfusión y el vacío funcionan correctamente, configure la resolución de lapso de tiempo y la resolución espacial a las tasas deseadas. En este caso, se visualiza un fotograma aproximadamente por segundo con una resolución de cinco píxeles de 12 por cinco.

Después de establecer la duración de dos a 10 minutos, inicie la ejecución. Los agentes farmacológicos se lavan durante cinco a 10 minutos y luego se lavan durante otros cinco a 10 minutos. Esta imagen promediada representativa de un registro de lapso de tiempo de la actividad del calcio se tomó después de los astrocitos en la zona subventricular.

Estaban cargados de presión. Aplicación de gripe a las 4:00 a.m. en la rebanada. Las películas se adquirieron a 0,5.

En segundos pasos de tiempo, las regiones de interés se colocan sobre las células que exhiben actividad. Estos son los seguimientos de las regiones de interés numeradas que se muestran anteriormente. Las trazas se filtraron con una media móvil y se normalizaron.

La escala vertical representa dos veces delta F sobre F cero, donde F es la intensidad de la señal, F cero es la señal de referencia promedio y delta F es igual a F menos F cero. Una vez dominado. Esta técnica se puede realizar en cuatro o cinco horas si se hace correctamente.