Name: Análisis de la transcripción de genes de una sola célula de ARN fluorescente In Situ La hibridación (FISH) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: Aprende a detectar transcritos de ARNm en células individuales mediante hibridación FISH en eritrocitos infectados con Plasmodium falciparum. Este método revela la expresión simultánea de múltiples genes var en parásitos de malaria.

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Los autores desean dar las gracias a Michael Alifrangis y Abildtrup Ulla para el genotipado de los parásitos y Holm Christina para su excelente asistencia técnica. Este trabajo fue financiado por el Howard Hughes Medical Institute (subvención de 55.005.511), la Fundación Lundbeck (subvención R9-A840) y por la Fundación Niels Bohr.

1. La generación de recién seleccionada eritrocitos infectados Para este ensayo, los mejores resultados se obtienen cuando se utilizan cultivos recién seleccionadas para la expresión en superficie de la proteína PfEMP1. En este experimento particular la P. 3D7 linaje falciparum fue seleccionado utilizando anticuerpos específicos como se ha descrito anteriormente 1. Día 1 <ol><li> Cosecha de 200 l de células de sangre envasados ​​de una P. falciparum cultivo que contiene 2-5% IE etapa tardía por centrifugación a 800 xg durante 8 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Se resuspende el sedimento en sangre 2 ml de 37 ° C cálido solución 0,75% de gelatina en un tubo de 14 ml estéril, y se deja durante 15-20 min a 37 ° C para permitir que el IE no infectado y anillo etapa-a sedimentos. </li><li> Se recoge el IE en etapa tardía, es decir, la fase superior, en un tubo de 14 ml nuevo y se lava dos veces con 10 ml de 37 ° C cálidos RBC-medios de lavado. </li><li> Diluir 50 l de anticuerpos específicos anti-PfEMP1 anticuerpos en 2 ml de 37 ° C cálidos RBC-medios de lavado y filtro estéril. </li><li> Mezclar el lavado la fase final del IE con los antisueros esterilizado diluida en un tubo de 14 ml estéril y se incuba durante 30 min a 37 ° C con agitación suave. </li><li> Centrifugue a 800 xg durante 8 minutos a temperatura ambiente, y se lava dos veces con 10 ml de 37 ° C cálidos RBC-medios de lavado. </li><li> Lávese 50 l de Proteína Dynabead Una suspensión dos veces con RBC-lavado de los medios de comunicación utilizando un imán DynaMaq-15. </li><li> Resuspender las Dynabeads en 300 L RBC-lavado de los medios de comunicación y añadirlos a la última etapa de lavado IE. Incubar durante 30 min a 37 ° C con agitación suave. </li><li> Transferir el tubo en el imán DynaMaq-15. Dejar reposar 1-2 minutos y retirar todo el líquido. </li><li> Resuspender las Dynabeads en 4-5 ml de RBC-lavado de medios de comunicación. Transfiera la parte posterior del tubo en el imán y se deja durante 1-2 minutos antes de retirar todo el líquido. Repetir la etapa de lavado una vez. </li><li> Transfiera las perlas lavadas a un 25 cm 2 f cultivo estérillask contiene 200 mu l recién concentrados de glóbulos rojos. Añadir 5-6 ml de Albumax medios de comunicación en la cultura. Guarde la noche a 5% de CO 2 a 37 ° C. </li></ol> Día 2 <ol start="12"><li> Eliminar las Dynabeads de la cultura cuando la IE ha seleccionado reinvadido las células rojas de la sangre fresca mediante la transferencia de todo el cultivo a un tubo de 14 ml estéril. Poner el tubo en el imán DynaMaq-15 y se deja durante 1-2 min. Luego, vierta todo el líquido nuevamente a un frasco de cultivo. </li><li> Cultura para el mayor número posible de ciclos hasta un 5-10% de parasitemia y los parásitos se encuentran en el ringstage. </li><li> Es decir, se analizaron por FACS para asegurarse de que el fenotipo de la superficie correcta, es decir, la expresión de la proteína de cualquiera de and/orPF11_0008 PFD1235w se ha obtenido 1. </li></ol> 2. Preparación de sondas Las sondas de ARN antisentido se generaron a partir de las regiones más variables de la PFD1235w y la var PF11_0008 &lt;/ Em&gt; genes de P. falciparum 3D7 ADN genómico. El ADN fue amplificado por PCR y clonado en el vector pSPT18 o 19 para la transcripción, respectivamente de acuerdo con la descripción del fabricante (Roche). Las sondas (580 pares de bases (pb) y 590 pb de longitud) fueron marcadas con digoxigenina (DIG) o biotina usando un kit de marcaje de ARN DIG o una mezcla de biotina ARN etiquetado, respectivamente. Se confirmó la especificidad de las sondas tanto por análisis de transferencia Northern y por una sola etiqueta análisis FISH 1. 3. Frotis delgado y fijación de los parásitos antes de la hibridación in situ Día 1 Todos los pasos se realizan en un ambiente libre de RNasa y todos los reactivos son RNasa libre o pre-tratado con pirocarbonato de dietilo (DEPC) o RNasa Zap (Invitrogen). Los portaobjetos y cubreobjetos debe limpiarse con alcohol para eliminar la grasa residual de fabricación. Es importante realizar el protocolo sin ninguna pausa entre pasoscon el fin de minimizar el riesgo de contaminación con nucleasas. <ol><li> Hacer una película delgada de sangre por el método estándar de difusión 3. Usando el lente objetivo 100x aceite del microscopio, cuente el IE y calcular el porcentaje de IE en la cultura. Compruebe que las etapas de parásitos están en sincronía aproximada, en el ring y las primeras etapas del ciclo de trofozoíto IE. Estos son el pre-replicación, etapas uni-nucleado, que expresan mRNA del gen var y adecuado para ensayos de células individuales de transcripción de peces de este tipo. </li><li> Transferir 50 l de la cultura parásito, a una parasitemia de 5-10%, a un 1,5 ml de RNasa libre de tubo Eppendorf. Centrifugar durante 1 min a 2.000 rpm a temperatura ambiente. </li><li> Retire el papel y añadir 50 l de PBS pH 7,2 en agua tratada con DEPC. Agite suavemente el tubo. Repetir la etapa de sedimentación centrífuga dos veces para lavar las células libres de los medios de comunicación y los residuos celulares. </li><li> Haga cuatro buenos frotis finos de calidad. Para cada mancha, hacer un frotis enuno de 11 mm de diámetro y de una diapositiva 4 bien, es decir, cuatro placas de vidrio en total, en una campana de RNasa libre (un paso crítico). Wave desliza brevemente en el aire para secar. Hacer tres diapositivas adicionales para controles de frotis negativo y uno para la tinción única sonda para cualquier gen no pertinente mediante el uso de una sonda específica, otra diapositiva para el tratamiento de RNasa y una tercera diapositiva que contiene IE no expresan el gen de interés. Deje que los portaobjetos se sequen en el banquillo durante 10-20 min. </li><li> Fijar las películas delgadas mediante la adición de 60 l de solución de fijación que contiene 4% de paraformaldehído y 5% de ácido acético glacial en los pocillos. Dejar durante 10 minutos en el banquillo a temperatura ambiente. </li><li> Lavar los portaobjetos en tampón SSPE 2x por 5 min por agitación suave a temperatura ambiente. Brevemente eliminar el exceso de líquido al tocar los pocillos que contienen las células suavemente con un pañuelo de papel. </li><li> Cubrir los portaobjetos con 0,01% de pepsina en HCl 0,01 M durante 2 min a 37 ° C (un paso extremadamente crítico). Lavar los portaobjetos en 2 x SSPE durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Diluir la solución de RNasa hasta una concentración final de 10 mg / ml. Cubrir los frotis de control negativo con 60 l de la solución de RNasa. Incubar durante 30 min a 37 ° C y lavar los portaobjetos en 2 x SSPE durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Se procede inmediatamente a la etapa de hibridación. </li></ol> 4. La hibridación de sondas de ARN a las diapositivas fijas Día 1 <ol><li> Prepare la cámara de hibridación, como un Thermostar 100 HC4 o una caja de puntas de pipeta vacía puso en un horno limpio, rociando con RNasa Zap y límpiela con un pañuelo de papel. Llenar los canales de la cámara de hibridación o la parte inferior de la caja con agua tratada con DEPC para asegurarse de que los portaobjetos no se sequen durante la hibridación. Cerrar la cubeta y precalentar a 48 ° C. </li><li> Diluir las sondas en la solución de hibridación a una concentración final de 12 ng / l. Desnaturalizar la solución de sonda a 65 ° C durante 5 min en un bloque calefactor. Inmediatamente enfriar en hielo. </li><li> En pocas palabras Secar las preparaciones después del lavado 2x SSPE. Retire cuidadosamente el exceso de líquido alrededor de los pocillos con un pañuelo de papel. </li><li> Abra la cámara de hibridación y coloque las diapositivas en la cámara. Aplicar una o ambas sondas en un volumen total de 60 l por pocillo. Cubra cuidadosamente la caída de líquido con un cubreobjetos RNasa libre con unas pinzas estériles. </li><li> Cerrar la cámara y se hibridan los portaobjetos a 48 ° C durante al menos 16 horas durante la noche. </li></ol> 5. Conjugación de anticuerpo y amplificación de fluorescencia Día 2 Los siguientes pasos se basan en el sistema de fluorescencia TSA Plus paleta de Perkin Elmer. Todos los pasos se realizan a temperatura ambiente. <ol><li> Lavar los portaobjetos 3 veces en tampón TNT por 5 min con agitación suave. </li><li> Bloquear los pocillos en 150 l de tampón TNB para 30 min. </li><li> Diluir el conjugado HRP-α-DIG anticuerpo en tampón TNB en una proporción de 1:100 y el anticuerpo HRP-conjugado de α-biotina en tampón TNB, en una proporción de 1:500. Retire el exceso de buffer de TNB las diapositivas con un pañuelo de papel. Al detectar simultáneamente dos transcripciones, ambos anticuerpos pueden ir a la vez. Aplique una cantidad total de 100 ml de la solución de anticuerpo por TNB bien y con cuidado cubrir con un cubreobjetos. Incubar los portaobjetos durante 2 horas. </li><li> Quitar los cubreobjetos con cuidado. Lavar los portaobjetos en tampón TNT 3 veces durante 5 min. </li><li> Diluir la FITC-fluoróforo en el reactivo de amplificación tiramida en una proporción de 1:500 y se aplican 100 ml de la solución a cada pocillo. Cubrir los pocillos con cubreobjetos y se incuba durante 12 min. </li><li> Quite el cubreobjetos con cuidado y lavar los portaobjetos 3 veces durante 5 minutos en tampón de TNT por agitación suave. </li><li> Diluir la Cyan3-fluoróforo en el reactivo de amplificación tiramida en una proporción de 1:500. Añadir 100 l porasí de esta solución. Cubrir los pocillos con cubreobjetos y se incuba durante 12 min. </li><li> Quite el cubreobjetos con cuidado y luego enjuague los portaobjetos rápidamente por inmersión en una solución tampón TNT. </li><li> Lavar los portaobjetos 3 veces con tampón TNT por 5 min. </li><li> Sumergir los portaobjetos rápidamente en agua tratada con DEPC. </li><li> Deje que los portaobjetos se seque al aire. Montar las diapositivas con anti-fade reactivo que contiene DAPI. Selle las esquinas de las hojas de la cubierta con esmalte de uñas. </li><li> Los portaobjetos ahora está listo para la microscopía. Mantenga las diapositivas cubiertas con papel de aluminio y se almacenan a 4 ° C si el experimento se completará al día siguiente. Un sellado completo de los lados de las láminas puede llevarse a cabo 24 horas después de aplicar el reactivo anti-fade. Esto permitirá que las láminas se fotografió por hasta una semana después de que el protocolo se ha completado. </li></ol> 6. La visualización de las sondas hibridadas <ol><li> Encender el microscopio. Un microscopio de inmunofluorescencia estándar es sufficient para este tipo de experimento, pero si usted tiene acceso a un microscopio confocal también puede usar esto para imágenes en 3D o para obtener los vídeos de las células teñidas. Permitir microscopio se caliente durante 15-30 min. Encienda el ordenador y el software. </li><li> Compruebe la calidad de la tinción al microscopio de inmunofluorescencia. Elija un lugar que contiene unos cuantos parásitos. </li><li> Ajuste la ganancia de cada láser manual. Ajuste el pixel de espera en 4-6 m -1 s -1 y los pasos a 512 x 512 píxeles. </li><li> Tome una fotografía de prueba utilizando Frame Lambda. Vuelva a ajustar la ganancia del láser. </li><li> Tome un mínimo de 20 buenas fotos de fluorescentes células individuales. Al menos 2-5 imágenes de un campo que contiene 5-20 parásitos son necesarios a fin de obtener una visión general ajustada del porcentaje de parásitos positivos. </li></ol>

<ol><li>Joergensen, L., Bengtsson, D. C., Bengtsson, A., Ronander, E., Berger, S. S., Turner, L., Dalgaard, M. B., Cham, G. K., Victor, M. E., Lavstsen, T., Theander, T. G., Arnot, D. E., Jensen, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+co-expression+of+two+different+PfEMP1+antigens+on+single+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes+facilitates+binding+to+ICAM1+and+PECAM1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Surface co-expression of two different PfEMP1 antigens on single Plasmodium falciparum-infected erythrocytes facilitates binding to ICAM1 and PECAM1.</a> PLoS Pathog. 2, 1001083(2010).</li>
<li>Pinaud, R., Mello, C. V., Velho, T. A., Wynne, R. D., Tremere, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+two+mRNA+species+at+single-cell+resolution+by+double-fluorescence+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Detection of two mRNA species at single-cell resolution by double-fluorescence in situ hybridization.</a> Nat. Protoc. 3, 1370-1379 (2008).</li>
<li>Cheeseborough, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCheeseborough%2C+M+%22District+Laboratory+Practice+in+Tropical+Countries%22">District Laboratory Practice in Tropical Countries</a>. , Cambridge University Press. Cambridge. (2006).</li>
<li>Brolin, K. J., Ribacke, U., Nilsson, S., Ankarklev, J., Moll, K., Wahlgren, M., Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+transcription+of+duplicated+var2csa+gene+copies+in+individual+Plasmodium+falciparum+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous transcription of duplicated var2csa gene copies in individual Plasmodium falciparum parasites.</a> Genome Biol. 10, R117(2009).</li>
<li>Epp, C., Li, F., Howitt, C. A., Chookajorn, T., Deitsch, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+associated+sense+and+antisense+noncoding+RNAs+are+transcribed+from+the+var+gene+family+of+virulence+genes+of+the+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Chromatin associated sense and antisense noncoding RNAs are transcribed from the var gene family of virulence genes of the malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> RNA. 15, 116-127 (2009).</li>
<li>Freitas-Junior, L. H., Hernandez-Rivas, R., Ralph, S. A., Montiel-Condado, D., Ruvalcaba-Salazar, O. K., Rojas-Meza, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeric+heterochromatin+propagation+and+histone+acetylation+control+mutually+exclusive+expression+of+antigenic+variation+genes+in+malaria+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Telomeric heterochromatin propagation and histone acetylation control mutually exclusive expression of antigenic variation genes in malaria parasites.</a> Cell. 121, 25-36 (2005).</li>
<li>Obernosterer, G., Martinez, J., Alenius, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locked+nucleic+acid-based+in+situ+detection+of+microRNAs+in+mouse+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protoc%22%5BJournal%5D)">Locked nucleic acid-based in situ detection of microRNAs in mouse tissue sections.</a> Nature Protoc. 2, 1508-1514 (2007).</li>
<li>Li, F., Sonbuchner, L., Kyes, S. A., Epp, C., Deitsch, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+non-coding+RNA+are+transcribed+from+the+centromeres+of+Plasmodium+falciparum+and+are+associated+with+centromeric+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Nuclear non-coding RNA are transcribed from the centromeres of Plasmodium falciparum and are associated with centromeric chromatin.</a> J. Biol. Chem. 283, 5692-5698 (2008).</li>
<li>Thompson, J., Sinden, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+Pbs21+mRNA+during+sexual+development+of+Plasmodium+berghei%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biochem.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">In situ detection of Pbs21 mRNA during sexual development of Plasmodium berghei.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 68, 189-196 (1994).</li>
<li>Thompson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+RNA+in+blood-+and+mosquito-stage+malaria+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mole+Med%22%5BJournal%5D)">In situ detection of RNA in blood- and mosquito-stage malaria parasites.</a> Methods Mole Med. 72, 225-235 (2002).</li>
<li>Arnot, D. E., Ronander, E., Bengtsson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+progression+of+the+intra-erythrocytic+cell+cycle+of+Plasmodium+falciparum+and+the+role+of+the+centriolar+plaques+in+asynchronous+mitotic+division+during+schizogony%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">The progression of the intra-erythrocytic cell cycle of Plasmodium falciparum and the role of the centriolar plaques in asynchronous mitotic division during schizogony.</a> Int. J. Parasitol. 41, 71-80 (2011).</li>
<li>Osborne, C. S., Chakalova, L., Brown, K. E., Carter, D., Horton, A., Debrand, E., Goyenechea, B., Mitchell, J. A., Lopes, S., Reik, W., Fraser, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+genes+dynamically+colocalize+to+shared+sites+of+ongoing+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Active genes dynamically colocalize to shared sites of ongoing transcription.</a> Nat. Genet. 36, 1065-1071 (2004).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Análisis de ARN FISH, en contraste con los métodos tales como transferencia Northern y RT-PCR, permite la discriminación de los transcritos de ARNm específicos en el nivel de célula única. Esto hace que sea posible discriminar entre células transcripcionalmente activos e inactivos, en este ejemplo, P. falciparum protozoos parásitos dentro de los glóbulos rojos. Tales células enteras observaciones son a menudo necesarias y puede desentrañar los patrones transcripcionales importantes y novedosas 1. </p...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Ácido Acético </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> 338826-100ml </td><td></td></tr><tr><td> Albumax medios de comunicación: RPMI 1640 Glutamina solución </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 500 ml de medio RPMI 1640 5 ml de solución de glutamina </td></tr><tr><td> Albumax medios de comunicación: Gentamicina sulfato Albumax-solución </td><td> Lonza </td><td> BE02-012E </td><td> 2,5 ml de gentamicina sulfato 50 ml de solución de Albumax </td></tr><tr><td> Albumax-solución: hipoxantina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H9377 </td><td> 0,8 g de hipoxantina </td></tr><tr><td> Albumax-solución: Albumax II </td><td> Yonvitrogen </td><td> 11021-037 </td><td> 200 g Albumax </td></tr><tr><td> Albumax-solución: RPMI 1640 </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 4 litros RPMI 1640 Disolver con el imán en el máximo. 50 ° C. Filtrar esterilizar y almacenar a -20 ° C en alícuotas. </td></tr><tr><td> Amberlite </td><td> Sigma </td><td> A5710-110G </td><td> Resina para desionizar formamida. </td></tr><tr><td> Anti-biotina peroxidasa de cabra pAb </td><td> Calbiochem </td><td> 203206 </td><td></td></tr><tr><td> Anticuerpo anti-DIG </td><td> Novus Productos Biológicos </td><td> NB100-41330 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-fade reactivo con DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P36931 </td><td> Los medios de montaje tiene que curar durante 24 h antes de sellar la corredera completamente. </td></tr><tr><td> La biotina RNA Labeling Mix </td><td&gt; Roche </td><td> 11685597910 </td><td></td></tr><tr><td> Cámara digital de </td><td> Digital Nikon vista DC-F11 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cubreobjetos </td><td> Menzel-Glaser </td><td> 631-1570 </td><td></td></tr><tr><td> frasco de cultivo de 25 cm 2 de superficie Nunclon </td><td> Nunc </td><td> 156340 </td><td></td></tr><tr><td> DEPC </td><td> Fluka / Sigma </td><td> 32490-100ml </td><td> 1 ml DEPC en 1000 ml de agua deinonized. Añadir una barra de agitación y se agita durante 12 h. Esterilizar en autoclave durante 30 min. </td></tr><tr><td> Cámara digital </td><td> Digital Nikon vista DC-F11 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dynabeads Proteína A </td><td> Invitrogen </td><td> 10002D </td><td></td></tr><tr><td> DynaMaq-15 Imán </td><td> Invitrogen </td><td> 123-01D </td><td></td></tr><tr><td> Bioultra formamida 99% </td><td> Fluka/ Sigma </td><td> 47671-1l-F </td><td> Formamida desionizada: 5 g de resina de intercambio iónico por 100 ml de formamida. Se agita 30 min. Filtrar a través de papel Whatman. </td></tr><tr><td> . 0 Gelatina solución al 75%: Gelatina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G2500 </td><td> 3,75 g de gelatina en 500 ml de RPMI 1640. Calentar a 56 ° C para disolver. Filtrar esterilizar cuando 56 ° C. Almacenar a -20 ° C en alícuotas. </td></tr><tr><td> . Gelatina 0 solución de 75%: RPMI 1640 </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 3,75 g de gelatina en 500 ml de RPMI 1640. Calentar a 56 ° C para disolver. Filtrar esterilizar cuando 56 ° C. Almacenar a -20 ° C en alícuotas. </td></tr><tr><td> La glutamina solución: L-glutamina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G3126 </td><td> 14,6 g L-glutamina en 500 ml de NaCl al 0,9%. Disolver, filtro sterilize y almacenar a -20 ° C en alícuotas. </td></tr><tr><td> Glutamina solución: HCl </td><td> Sigma </td><td> H1758 </td><td> 14,6 g L-glutamina en 500 ml de NaCl al 0,9%. Disolver, filtrar esterilizar y almacenar a -20 ° C en alícuotas. </td></tr><tr><td> Solución de hibridación: formamida al 99% de ultra Bio SSC 20x </td><td> Fluka / Sigma </td><td> 47671-1l-F </td><td> Total 20 ml, mantener congelado a -20 ° C en alícuotas 10 ml de formamida desionizada </td></tr><tr><td> Solución de hibridación: el concentrado 50x de Denhardt </td><td> Sigma </td><td> D2532 </td><td> 5ml 20xSSC </td></tr><tr><td> Solución de hibridación: Levadura tRNARoche reactivo de bloqueo </td><td> Sigma </td><td> R-6750 </td><td> 2 ml 50x Denhardt 250 l 20 mg por ml de ARNt de levadura </td></tr><tr><td><strong&gt; Solución de Hibridación: DNA de esperma de salmón </td><td> Fluka / Sigma </td><td> 31149-106GF </td><td> 0,4 g Roche reactivo de bloqueo 1 ml de 10 mg por ml de ADN de esperma de salmón (Critical: desnaturalizan salmón spermDNA a 96 ° C durante 5 min antes de añadir a la solución de hibridación) </td></tr><tr><td> Hybridizer Thermostar 100 HC4 </td><td> Quantifoil Instruments GmbH </td><td> 1004-0011 </td><td> Puede ser reemplazado por el horno de hibridación y las cámaras de RNasa libre de hibridación rellenados con agua DEPC. </td></tr><tr><td> Inmersión en aceite UV transparente, libre de fluorescencia </td><td> Sigma </td><td> 10976-1EA </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio confocal de inmunofluorescencia o </td><td> Nikon D-Eclipse TE2000C </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nailpolish </td><td> Disponible en cualquier farmacia </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 20x PBS: NaCl KCl Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O KH 2 PO 4 DEPC desionizada H 2 O </td><td></td><td></td><td> Adecuar el pH a 7,4 160 g 4 g 23 g 4 g 1 l </td></tr><tr><td> Paraformaldehído al 4% </td><td> Fluka / Chemika </td><td> 76240 </td><td> 4 g PFA en 80 ml de PBS / DEPC. Calentar a 65 ° C hasta que se disuelve el PFA. Añadir 20 ml de PBS, permitir que la solución se enfríe. Ajustar el pH a 7,4. Filtrar. Almacenar en alícuotas a -20 ° C. </td></tr><tr><td> Paraformaldehído al 4% / ácido acético 5% </td><td></td><td></td><td> 950 paraformaldhyde l de ácido acético + 50 l </td></tr><tr><td> Pepsina </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> P7000 </td><td></td></tr><tr><td> Conjugado con peroxidasa anti-biotina </td><td> Calbiochem </td><td> 203206 </td><td></td></tr><tr><td> RBC-wash medios de comunicación: RPMI 1640 Glutamina solución </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 500 ml de RPMI 1640 5 ml de solución de glutamina </td></tr><tr><td> RBC-wash medios de comunicación: Sulfato de Gentamicina </td><td> Lonza </td><td> BE02-012E </td><td> 2,5 ml de gentamicina sulfato </td></tr><tr><td> RNasa </td><td> Sigma / Aldrich </td><td></td><td> Hacer una dosis de 10 mg / ml de solución madre. </td></tr><tr><td> RNasa libre de 1,5 ml tubo </td><td> Ambion </td><td> AM12450 </td><td></td></tr><tr><td> RNasa Zap </td><td> Ambion </td><td> AM9780 </td><td></td></tr><tr><td> Diapositivas 4 pozos de 11 mm </td><td> Thermo Scientific </td><td> MENZXER306W </td><td></td></tr><tr><td> 20x SSC: NaCl </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> S9625 </td><td> 3 M NaCl (175 g / l) 0,3 M Na citrato x 3 H 2 O (88 g / l) Ajustar a pH 7,0 con HCl 1M </td></tr><tr><td> SSC 20x: Citrato de sodio dihidrato </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> W302600 </td><td> 3 M NaCl (175 g / l) 0,3 M Na citrato x 3 H 2 O (88 g / l) Ajustar a pH 7,0 con HCl 1M </td></tr><tr><td> SSPE 20x: NaCl </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> S9625 </td><td> 175,3 g de NaCl </td></tr><tr><td> SSPE 20x: NaH 2 PO 4 </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> S0751 </td><td> 27,6 g NaH 2 PO 4. </td></tr><tr><td> SSPE 20x: 4 EDTA en polvo </td><td></td><td></td><td> 9,4 g de EDTA en polvo Añadir agua DEPC, ajustar el pH 7,4. AutoHendió durante 20 min </td></tr><tr><td> TNB buffer: tampón TNT </td><td></td><td></td><td> 10 ml tampón TNT </td></tr><tr><td> TNB búfer: reactivo de bloqueo </td><td></td><td></td><td> 0,05 g de reactivo de bloqueo Para disolver el reactivo de bloqueo, se calienta la solución a 60 ° C durante una hora con agitación. Conservar a -20 ° C. (Derivado de la Perkin Elmer TSA-protocolo). </td></tr><tr><td> TNT tampón: Tris / HCl </td><td> Sigma </td><td> T1503 </td><td> 1 M Tris / HCl, pH 8,0 </td></tr><tr><td> TNT buffer: NaCl </td><td> Sigma Aldrich </td><td> S9625 </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> TNT buffer: Tween20 </td><td> Sigma </td><td> 93773 </td><td> 5 M NaCl 30 ml 1 ml DEPC dH 2 O869 Ml Ajustar el pH a 7,5 a temperatura ambiente. (Derivado de la Perkin Elmer TSA-protocolo). </td></tr><tr><td> TSA más Cyanine3 / fluoresceína sistema </td><td> Perkin Elmer </td><td> NEL753000IKT </td><td> Leer el protocolo de la TSA Plus sistema de fluorescencia paleta cuidadosamente antes de iniciar el experimento. </td></tr><tr><td> Tubos de 14 ml estéril </td><td> Almeco - CM Aps LAB </td><td> 91016 </td><td></td></tr></tbody></table>

análisis de la transcripción de genes de una sola célula de arn fluorescente<em&gt; in situ</em&gt; la hibridación (fish)

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

La adhesión de Plasmodium falciparum eritrocitos infectados (IE) a receptores humanos endoteliales durante las infecciones de malaria está mediada por la expresión de PfEMP1 variantes de proteínas codificadas por los genes var. El P. haploide falciparum genoma alberga aproximadamente 60 genes diferentes var de que ha sido único que se cree que ser transcrito por célula en un momento durante la fase sanguínea de la infección. Como tal regulación mutuamente excluyente de la transcripción de genes var que se logra es clara, ya que es la identificación de los genes var individuales o subgrupos de genes var asociados con diferentes receptores y la consecuencia de unión diferencial sobre el resultado clínico de P. infecciones por P. falciparum. Recientemente, el paradigma de la transcripción mutuamente excluyentes ha sido puesta en duda por los ensayos de transcripción basado en individuo P. falciparum identificación única transcripción en infeja células eritrocitarias utilizando ARN hibridación in situ fluorescente (FISH) El análisis de la transcripción de genes var por el parásito en los núcleos individuales de P. falciparum IE 1. Aquí, se presenta un protocolo detallado para llevar a cabo la metodología de ARN-FISH para el análisis de la transcripción de genes var en un solo núcleo de P. falciparum infecta los eritrocitos humanos. El método se basa en el uso de digoxigenina y biotina marcado con sondas de ARN antisentido utilizando el TSA Plus fluorescencia sistema de paletas 2 (Perkin Elmer), los análisis microscópicos y recién seleccionado P. falciparum IE. El método de hibridación in situ se puede utilizar para controlar la transcripción y la regulación de una variedad de genes expresados ​​durante las diferentes etapas de la P. ciclo de vida falciparum y es adaptable a otras especies de parásito de la malaria y otros organismos y tipos de células.

La Figura 1 ilustra un diagrama de flujo de los pasos principales y el tiempo de duración de la metodología de ARN FISH. Una serie de imágenes representativas de bien y mal conservados experimentos manchadas de ARNm de peces utilizando solo P. falciparum IE se muestra en la Figura 2. Este protozoo intracelular tiene un pequeño (1-1.5 m de diámetro) núcleo que se tiñe de azul con DAPI. Veinticuatro horas después de la invasión de los eritrocitos en <...

Fluorescente<em&gt; In situ</emHibridación&gt; (FISH) para identificar las transcripciones de mRNA en células individuales permite el análisis de la actividad poligénica tales como la transcripción simultánea de más de un miembro de la<em&gt; Var</em&gt; Multigene familia en<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Eritrocitos infectados<sup&gt; 1</sup&gt;. La técnica es adaptable y puede ser utilizado en diferentes tipos de genes, células y organismos.

Análisis de la transcripción de genes de una sola célula de ARN fluorescente<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación (FISH)

La adhesión de eritrocitos infectados (EI) por Plasmodium falciparum a los receptores endoteliales humanos durante las infecciones por malaria está mediada por la expresión de variantes de la proteína PfEMP1 codificadas por los genes var. Se cree que el genoma haploide de P. falciparum alberga aproximadamente 60 genes var diferentes, de los cuales solo uno se transcribe por célula a la vez durante la fase sanguínea de la infección. No está claro cómo se logra dicha regulación mutuamente excluyente de la transcripción de los genes var, así como tampoco la identificación de genes var individuales o subgrupos de genes var asociados con diferentes receptores y la consecuencia de la unión diferencial en el desenlace clínico de las infecciones por P. falciparum. Recientemente, el paradigma de la transcripción mutuamente excluyente ha sido cuestionado mediante ensayos de transcripción basados en la identificación de transcritos individuales de P. falciparum en células eritrocíticas infectadas individuales, utilizando el análisis de hibridación in situ fluorescente (FISH) de ARN de la transcripción de los genes var por el parásito en núcleos individuales de EI de P. falciparum. Aquí presentamos un protocolo detallado para llevar a cabo la metodología de RNA-FISH para el análisis de la transcripción de los genes var en núcleos individuales de eritrocitos humanos infectados por P. falciparum. El método se basa en el uso de sondas de ARN antisentido marcadas con digoxigenina y biotina utilizando el TSA Plus Fluorescence Palette System (Perkin Elmer), análisis microscópicos y EI de P. falciparum seleccionados recientemente. El método de hibridación in situ puede utilizarse para monitorizar la transcripción y regulación de una variedad de genes expresados durante las diferentes etapas del ciclo de vida de P. falciparum y es adaptable a otras especies de parásitos de la malaria y a otros organismos y tipos celulares.

Mi nombre es Elena Rand y trabajo en el Centro de Patología Médica de la Universidad de Copenhague en Dinamarca. Aquí, aproximadamente 60 personas de diversas partes del mundo trabajan con malaria. Nuestro grupo trabaja con parásitos del género Plasmodium.Son los más virulentos que causan la enfermedad de la malaria en humanos, además del modo. Los focos expresan proteínas de superficie que albergan diversas funciones, como la adhesión a las células del huésped. El grupo más grande de proteínas de adhesión son las llamadas proteínas de membrana eritrocítica de *Plasmodium falciparum* uno, conocidas como PfEMP1.Existe al menos 60 variantes, de las cuales se cree que solo una se transcribe por célula a la vez durante la etapa sanguínea de la infección. En nuestro departamento, creemos que más de una proteína puede transcribirse simultáneamente en los parásitos. Un método para detectar dicha actividad es la hibridación fluorescente de ARNm en sitio (FISH).Aquí presentamos un método personalizado para la detección de ARNm, transcritos de dos genes diferentes en un único núcleo de eritrocitos infectados con odum FCI. El método requiere dos días para completarse. El primer día comprende la preparación de sondas de ARN, su adición a los parásitos fijados sobre portaobjetos de vidrio e hibridación sobre agitadores rotatorios.El segundo día comprende la congregación de anticuerpos, la amplificación de fluorocromos y la visualización de los parásitos teñidos mediante microscopio confocal. Para ofrecer una visión general del experimento, se muestra un diagrama de flujo de las operaciones y los reactivos y materiales críticos utilizados en el experimento. Kit de etiquetado de RNAs zap dig con biotina, mezcla de etiquetado de ARN, paraformaldehído, ácido acético glacial, anticuerpo anti-dig, anticuerpo anti-biotina, sistema de paleta de fluorescencia TSA PL plus, DPI de ARNs, tubos microfónicos libres, etanol ETH, portaobjetos de vidrio limpios, cubreobjetos autoclavados y equipo estéril como tijeras y pinzas, así como un frasco de vidrio acoplado.Es necesario revisar los eritrocitos infectados mediante frotis para asegurarse de que se encuentren en la etapa de desarrollo adecuada. Es decir, los estadios en anillo de VAR transcribiéndose de forma sincrónica y en buen estado. Es fundamental elegir la etapa exacta del ciclo vital en la que tiene lugar la transcripción.Dado que las especies individuales de ARN se encuentran en etapas específicas, transcritas específicamente y degradadas rápidamente, las células deben lavarse suavemente antes de realizar frotis de sangre muy delgados y de alta calidad sobre portaobjetos limpios; luego, se fija una monocapa uniforme de glóbulos rojos infectados sobre el portaobjeto en una solución de paraformaldehído al 4% y ácido acético glaciar al 5% durante 10 minutos. A continuación, los portaobjetos se lavan dos veces con PBS, eliminando suavemente el líquido de los portaobjetos con un papel absorbente. Luego, se permeabilizan las células con una solución precalentada de ácido clorhídrico de 10 milimolar antes de añadir la Pepsi.Incube esto a 37 grados centígrados durante dos minutos antes de la hibridación. Las sondas se desnaturalizan a 65 grados centígrados durante cinco minutos, se enfrían rápidamente en hielo y luego se añaden a las células, que ahora están fijadas sobre el portaobjetos. Coloque un cubreobjetos encima de las células y elimine cualquier burbuja de aire con la punta pequeña de una pipeta. Humedezca la cámara de hibridación añadiendo gotas de agua doblemente destilada en el perímetro de la cámara para que los portaobjetos permanezcan húmedos dentro de ella.Durante el procedimiento de hibridación, coloque las laminillas de vidrio en la cámara e incube toda la noche a 48 grados centígrados. Después de 16 a 17 horas de hibridación, se retiran cuidadosamente las laminillas de la cámara de hibridación. A partir de este paso, no existe un requisito absoluto de un ambiente libre de ARN.Lave los portaobjetos en un frasco de vidrio lleno con tampón TNT, asegurándose de que las cubreobjetos se desprendan del portaobjetos de vidrio. Repita el procedimiento de lavado tres veces, luego bloquee en tampón TNB durante media hora. Añada los anticuerpos anti-dig marcados con HRP o con anti-biotina a las células.Se pueden agregar ambos tipos de anticuerpos marcados simultáneamente. Si el experimento tiene como objetivo detectar dos transcritos de ARNm en las células, los anticuerpos deben diluirse previamente. Incubar durante una a dos horas en tampón TNB, lavar tres veces con tampón TNT y luego agregar un fluorocromo a las células lavadas, FSE diluido o cian. Es necesario preparar tres soluciones frescas. A partir de este paso, es importante no exponer las láminas directamente a la luz intensa. Incube las láminas de vidrio durante 10 a 15 minutos con el fluorocromo.Si se detectan dos transcritos de ARNm después de la primera incubación, elimine el primer colorante y agregue el segundo. Realice un lavado final en tampón TNT. Sumerja las laminillas en agua doblemente destilada antes de secarlas al aire.Agregue el medio y coloque un cubreobjetos sobre la preparación. Elimine cualquier burbuja de aire y selle los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas de secado rápido. Aquí observamos un eritrocito infectado individual que contiene un parásito.El azul representa el ADN del parásito, y el verde representa el ARNm de un gen que se está transcribiendo. En la otra imagen, el color rojo representa el ARNm del otro gen, y en la tercera imagen se puede observar la tinción dual de ambas transcripciones génicas. Las imágenes también revelan que los ARNm asociados están superpuestos al ADN nuclear y no se sitúan generalmente encima o al lado de este.En el 99 % de los eritrocitos infectados, podemos detectar el ARNm de dos genes que están siendo transcritos. Un aspecto importante de este experimento consiste en verificar que las sondas no se están hibridando con otros genes. En esta imagen, hemos incubado los eritrocitos infectados con ambas sondas, pero solo una sonda corresponde a un IE en posición de rodillas. Los otros genes no están siendo transcritos aquí.Esta situación se invierte en estas otras imágenes de los eritrocitos infectados visualizados. Los parásitos de *odium phos palm* tienen generalmente membranas bien conservadas con una tinción bien definida tanto del ADN como del ARN. Si las células son, por alguna razón, de mala calidad, la tinción también será deficiente.Como se muestra en esta imagen, el ADN y el ARN aparecerán difusos, turbios y relativamente indefinidos. En conclusión, se puede decir que este método puede aplicarse fácilmente a otros parásitos transmitidos por la sangre. Nuestros datos de transcripción también han sido respaldados por experimentos para detectar las proteínas traducidas a partir de los ARNm analizados utilizando anticuerpos específicos dirigidos contra las proteínas pf EMP1 expresadas en la superficie de las células infectadas.

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Investigación

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