Name: Mal plegamiento de proteínas priones de amplificación cíclica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Aprende la técnica PMCA para amplificar cepas priónicas de hámster in vitro mediante sonificación e incubación cíclica. Este método permite estudiar la conversión priónica y desarrollar ensayos de detección confiables.

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Nos gustaría dar las gracias a la Dra. Marie Ramos Vesper Fe para la lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el Centro Nacional para Recursos de Investigación (P20 RR0115635-6, C06 RR17417-01 y G20RR024001) y el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (2R01 NS052609).

1. Preparación del Equipo <ol><li> Utilice un Misonix 3000 o 4000 sonicador Misonix (Farmingdale, NY) conectado a un baño de Thermo Electron Neslab EX-7 agua (Newington, NH) para mantener una temperatura constante de 37 ° C. Sonicar las muestras en 200 ul de paredes delgadas tiras de tubos de PCR con tapas abovedadas obtenidos de Thermo Scientific (Waltham, MA). </li><li> Un baño de ultrasonidos nueva marca requiere de un &quot;robo&quot; período de operación continua 9. Un robo de dos meses consiste en una ráfaga de sonicación de 40 segundos y 10 minutos ciclos de incubación con el nivel de amplitud establece en 10. Uno debería observar la erosión a lo largo de la superficie del cuerno de titanio de microplacas (Figura 1, panel B). El agua circulante se verá blanca, turbia debido a la erosión de la bocina de titanio microplaca. Cambie el agua diariamente. </li><li> La amplificación de la PrP Sc variará a través de la trompa de microplacas. La mejor eficiencia de amplificación PrP Sc se puede conseguir dentro deun radio de 5 cm desde el centro de la bocina de microplacas (Véase la Figura 1, panel C). </li><li> Una ronda de EPCP consiste en 144 ciclos. Cada ciclo consta de 5 segundos sonicación y 10 min de incubación. Esto implicará aproximadamente a 24 horas por ronda del EPCP. </li><li> La salida de potencia de la sonicación, se muestra en el panel de control del sonicador, varía con el número de tubos de PCR presentes en la rejilla del sonicador, y la temperatura del agua de circulación del baño de agua. Asegúrese de que el agua se equilibra a 37 ° C, y no llene más de 30% de soporte de tubos de la sonicador (Figura 1, panel C). Extienda los tubos de PCR a través de la trompa de microplacas. Tener al menos una fila de espacios vacíos entre las tiras de tubos PCR y no permitir más de cuatro tubos conectados entre sí por tira (Figura 1, panel C). </li><li> La fuerza de la sonicación es crítico para una amplificación prión cepa éxito. Mientras sonicación, ajustar la amplitud de tener una potencia de salidaque oscila entre 155 ~ 170 vatios. En nuestro laboratorio, el nivel de potencia se establece en seis y siete para el 3000 Misonix Misonix y 4000, respectivamente. </li><li> El uso de agua destilada en el baño de agua para evitar la acumulación de manchas de agua dura. Reemplazar esta semana el agua. Durante los ciclos de incubación y sonicación, la condensación de agua se produce en el interior de la tapa del cuerno de microplacas. Para evitar la condensación, coloque una almohadilla de calor pequeño acuario a la parte superior de la caja de la carcasa del aparato de ultrasonidos, como se muestra en la Figura 1, panel A. </li></ol> 2. Preparación de las muestras <ol><li> Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Cuidado de Animales institucional Creighton University y el empleo Comisión y cumplir con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Antes de que cualquier recogida de tejido, el animal debe ser anestesiados y perfundidos transcardialmente con fosfato enfriada con hielo una solución salina tamponada con 5 mM de EDTA a pH 7,4 para eliminar la sangre desde el cerebro y evitar la inhibición de laEPCP reacción por la sangre 7. Recoge los tejidos animales rápidamente utilizando una técnica aséptica y tienen herramientas específicas para cada cepa de disección prión. Después de la disección, colocar el tejido en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, flash que se congele en hielo seco, y almacenar a -80 ° C hasta la homogeneización. </li><li> Para preparar el sustrato EPCP (PrP C) solución, homogeneizar un cerebro de hámster infectado (ONU BH) a un 10% peso / volumen (w / v) de solución con tampón de conversión enfriado con hielo (véase la parte 3), utilizando un triturador de tejidos Tenbroeck. Mientras homogeneizar, tenga cuidado de no tener aire en el interior del molino para evitar una excesiva formación de espuma en la solución. Aclarar la solución por centrifugación a 500 xg durante 30 seg y alícuota del sobrenadante en tubos de 1,5 ml de microcentrífuga. Almacenar a -80 ° C hasta su uso posterior. </li><li> Para preparar la semilla EPCP (PrP Sc) solución, homogeneizar un material infeccioso (nodos cerebro, bazo, linfáticos, otros tejidos o el suelo contaminado) a un 10% w / v solución con wate hielo fríor y alícuota de la solución en tubos de microcentrífuga de 0,6 ml. Almacenar a -80 ° C hasta su uso posterior. </li></ol> 3. Preparación de Buffer de conversión <ol><li> Pesar 0,5093 g de Triton X-100 en un matraz aforado de 50 ml (el resultado es una concentración final de 1% de Triton X-100) (Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim, Alemania). </li><li> Añadir una inhibidor de proteasa completo Tablet (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania). </li><li> Añadir 0,0931 g de EDTA (esto dará lugar a una concentración final 5 mM de EDTA) (Mallinckrodt Baker, Inc.; Phillipsburg, NJ). </li><li> Ajustar el pH a 7,4 con NaOH 1N. </li><li> Ajustar el volumen a 50 ml con fosfato de Dulbecco Buffered Saline (DPBS) (Mediatech Inc.; Manassas, VA). </li><li> Filtrar la solución a través de una membrana de 0,45 micras de nitrocelulosa con un aparato de filtración a vacío. El tampón de conversión se puede almacenar a 4 ° C durante no más de un mes. </li></ol> 4. La amplificación de las cepas de priones mediante el EPCP <ol><li>Diluir la semilla EPCP en el sustrato EPCP en una proporción de 1:20 (es decir, mezcla de 5 l de la semilla EPCP y 95 l de sustrato de la PMCA) en un tubo de PCR. Retirar y almacenar una parte alícuota de 15 l a -80 ° C para el control de unsonicated; este control unsonicated se utiliza para cuantificar la amplificación PrP Sc través de proteinasa K (PK) seguido por la digestión de Western (WB) análisis. Un control unsonicated adicional podría ser generada por la colocación de una segunda alícuota de 15 l a 37 ° C durante la duración de la reacción EPCP. Un mínimo de tres repeticiones se requiere para fines estadísticos. </li><li> Se somete el resto de la muestra (70 l) a una ronda de EPCP como se representa en la Figura 1, Panel A. Se mezcla tubos cada 5 hr para evitar la condensación de agua en la tapa abovedada del tubo de PCR. </li><li> Tubos de la muestra deben ser centrifugadas y suavemente vortex (teniendo cuidado de que la solución no va en la tapa abovedada) antes de abrir después de cualquier procedimiento que garantice Homogeneity y evitar la contaminación potencial. </li><li> Para serie EPCP (sPMCA) de corto cepas período de incubación (es decir, HY TME, HaCWD, o 263K), diluir el material sonicado en una proporción de 1:20 mediante la transferencia de 5 l de la muestra sometida a ultrasonidos desde la primera ronda en 95 l de fresco no infectada homogeneizado de cerebro (Figura 2, panel B). </li><li> Para sPMCA de largos cepas período de incubación (es decir, DY TME, 139H, 22CH, 22AH, o ME7H), diluir el material sonicado en una proporción de 1:1 por transferencia de 50 l de la muestra sometida a ultrasonidos desde la primera ronda en 50 l de fresco no infectada homogeneizado de cerebro (Figura 2, panel B). </li><li> 15 Retire los dos alícuotas de la mezcla previamente diluido sonicado (de pasos 4,4 o 4,5) y almacenar uno de ellos a -80 ° C y el otro a 37 ° C (soluciones de control para unsonicated EPCP la segunda ronda). Someter a los restos de una ronda EPCP dos. </li><li> Este procedimiento se puede repetir indefinidamente. En nuestro laboratorio, hemoshan realizado hasta quince rounds EPCP, con las propiedades de deformación permanecerán invariables. </li><li> PK digerir las muestras. Para un típico WB, mezclar 5 l de PK 80 ug / ml a 5 l de muestra (esta solución tendrá una concentración final de PK de 40 mg / ml) e incubar a 37 ° C durante una hora. Añadir 10 l de tampón de carga de gel. Hervir esta solución durante 10 min. Deje que la solución se enfríe y cargar 10 l en el gel. </li><li> Para calcular el éxito de la amplificación de realizar un análisis de WB en las muestras digeridas PK-para estimar la cantidad de PrP Sc amplificado por comparación a cualquiera, los controles unsonicated 20,21 Figura 2, panel C o a cantidades conocidas de PK-sin digerir recombinante PrP. </li></ol> 5. Evitar la contaminación cruzada Los pasos críticos tienen que ser tomadas para reducir al mínimo la contaminación cruzada y la ocurrencia de falsos positivos debido a la formación de novo de productos resistentes a la proteasa. </p&gt; <ol><li> Utilice un conjunto dedicado de herramientas de disección (es decir, fórceps, pinzas, tijeras) para la recolección de la muestra para cada cepa de prión. </li><li> Antes de homogeneización de los cerebros no infectadas para ser utilizados como un sustrato de PMCA, limpiar las pipetas con 1% de lejía. Remoje la cremallera sonicador de PCR tubo, homogeneizadores de tejidos, y bastidores de almacenamiento de tubos PCR con 1% de lejía durante 10 minutos y enjuagar con agua destilada. </li><li> Cubra el área de trabajo con un Soaker Lab fresco Versi-Dry cada vez que una nueva muestra se homogeneiza, un nuevo experimento EPCP es estar preparado, o cuando alícuotas entre rondas sPMCA. </li><li> Use guantes nuevos cada vez que nuevas muestras se manejan (especialmente cuando se transfieren alícuotas entre rondas sPMCA). </li><li> Utilice descargas cortas sonicación durante cada ciclo del EPCP. Los ciclos de sonicación 5 sec combinado con 10 minutos de incubación es suficiente para amplificar los priones sin generar de novo PrP Sc 1,20,21,23,24. Como otros laboratorios han demostrado, el aumento de latiempo de sonicación, el aumento de la amplitud de sonicación, y aumentando el número de ciclos de PMCA aumenta la probabilidad de novo de PrP Sc formación 2. </li></ol>

<ol><li>Ayers, J. I., Schutt, C. R., Shikiya, R. A., Aguzzi, A., Kincaid, A. E., Bartz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+strain-encoded+relationship+between+PrP+replication%2C+stability+and+processing+in+neurons+is+predictive+of+the+incubation+period+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">The strain-encoded relationship between PrP replication, stability and processing in neurons is predictive of the incubation period of disease.</a> PLoS pathogens. 7, e1001317(2011).</li>
<li>Barria, M. A., Mukherjee, A., Gonzalez-Romero, D., Morales, R., Soto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+generation+of+infectious+prions+in+vitro+produces+a+new+disease+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">De novo generation of infectious prions in vitro produces a new disease phenotype.</a> PLoS Pathog. 5, e1000421(2009).</li>
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<li>Hadlow, W. J., Race, R. E., Kennedy, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+distribution+of+transmissible+mink+encephalopathy+virus+in+mink+inoculated+subcutaneously%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Temporal distribution of transmissible mink encephalopathy virus in mink inoculated subcutaneously.</a> J. Virol. 61, 3235-3240 (1987).</li>
<li>Kocisko, D. A., Come, J. H., Priola, S. A., Chesebro, B., Raymond, G. J., Lansbury, P. T., Caughey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+formation+of+protease-resistant+prion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell-free formation of protease-resistant prion protein.</a> Nature. 370, 471-474 (1994).</li>
<li>Kurt, T. D., Telling, G. C., Zabel, M. D., Hoover, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-species+amplification+of+PrP%28CWD%29+and+correlation+with+rigid+loop+170N%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Trans-species amplification of PrP(CWD) and correlation with rigid loop 170N.</a> Virology. 387, 3235-3240 (2009).</li>
<li>Maddison, B. C., Baker, C. A., Terry, L. A., Bellworthy, S. J., Thorne, L., Rees, H. C., Gough, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+sources+of+scrapie+prions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Environmental sources of scrapie prions.</a> J. Virol. 84, 11560-11562 (2010).</li>
<li>Nichols, T. A., Pulford, B., Wyckoff, A. C., Meyerett, C., Michel, B., Gertig, K., Hoover, E. A., Jewell, J. E., Telling, G. C., Zabel, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+protease-resistant+cervid+prion+protein+in+water+from+a+CWD-endemic+area%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Detection of protease-resistant cervid prion protein in water from a CWD-endemic area.</a> Prion. 3, 171-183 (2009).</li>
<li>Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+proteinaceous+infectious+particles+cause+scrapie%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie.</a> Science. 216, 136-144 (1982).</li>
<li>Saborio, G. P., Permanne, B., Soto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+detection+of+pathological+prion+protein+by+cyclic+amplification+of+protein+misfolding%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sensitive detection of pathological prion protein by cyclic amplification of protein misfolding.</a> Nature. 411, 810-813 (2001).</li>
<li>Saunders, S. E., Bartz, J. C., Vercauteren, K. C., Bartelt-Hunt, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzymatic+treatment+of+soil-bound+prions+effectively+inhibits+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">An enzymatic treatment of soil-bound prions effectively inhibits replication.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 4313-4317 (2011).</li>
<li>Saunders, S. E., Shikiya, R. A., Langenfeld, K., Bartelt-Hunt, S. L., Bartz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+efficiency+of+soil-bound+prions+varies+with+soil+type%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Replication efficiency of soil-bound prions varies with soil type.</a> Journal of virology. , (2011).</li>
<li>Schutt, C. R., Bartz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+interference+with+multiple+prion+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Prion interference with multiple prion isolates.</a> Prion. 2, 61-63 (2008).</li>
<li>Shikiya, R. A., Ayers, J. I., Schutt, C. R., Kincaid, A. E., Bartz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-infecting+prion+strains+compete+for+a+limiting+cellular+resource%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of%22%5BJournal%5D)">Co-infecting prion strains compete for a limiting cellular resource.</a> Journal of. 84, 5706-5714 (2010).</li>
<li>Shikiya, R. A., Bartz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+generation+of+high+titer+prions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">In vitro generation of high titer prions.</a> Journal of virology. , (2011).</li>
<li>Weber, P., Giese, A., Piening, N., Mitteregger, G., Thomzig, A., Beekes, M., Kretzschmar, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+genuine+prion+infectivity+by+serial+PMCA%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+microbiology%22%5BJournal%5D)">Generation of genuine prion infectivity by serial PMCA.</a> Veterinary microbiology. 123, 346-357 (2007).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Desafíos de la amplificación de las proteínas priónicas infecciosas son los períodos de incubación largos y los gastos de los experimentos in vivo. La técnica EPCP es un medio rentable para amplificar los agentes infecciosos de priones. Varios laboratorios han confirmado la capacidad de PMCA para amplificar con precisión las cepas de priones in vitro 7, 9, 12, 14, 19,24. Las enfermedades por priones se pueden transmitir entre especies. Bessen y Marsh han...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reactivo / Equipo </td><td> Fabricante </td><td> Cat. Número </td></tr><tr><td> Misonix 3000 </td><td> Misonix </td><td> S-3000 </td></tr><tr><td> Misonix 4000 </td><td> Misonix </td><td> S-4000 </td></tr><tr><td> Tenbroeck triturador de tejidos </td><td> Kontes </td><td> 885000-0007 </td></tr><tr><td> Neslab EX-7 Water Bath </td><td> Thermo Electron </td><td> Neslab EX-7 </td></tr><tr><td> PCR de 0,2 ml tiras de tubos </td><td> Thermo Scientific </td><td> AB-0451 </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> T9284-100ML </td></tr><tr><td> Inhibidor de Proteasa Completo </td><td> Roche </td><td> 11 697 498 001 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> JT Baker </td><td> 4040-00 </td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Mallinckrodt Baker Mediatech </td><td> 21-031-CV </td></tr><tr><td> Versi-Dry Lab Soakers </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14 206 28 </td></tr><tr><td> Repti Therm calentador </td><td> Zoo Med Laboratories, Inc. </td><td> RH-4 </td></tr></tbody></table>

mal plegamiento de proteínas priones de amplificación cíclica

Protein Misfolding Cyclic Amplification of Prions

Los priones son los agentes infecciosos causantes de la encefalopatía espongiforme transmisible inevitablemente fatal (EET) en los animales y los seres humanos 9,18. La proteína prión tiene dos isoformas distintas, la no infecciosa proteína codificada por el hospedador (PrP C) y la proteína infecciosa (PrP Sc), una isoforma anormal de PrP plegado en C 8. Uno de los retos de trabajar con agentes de priones es el largo período de incubación antes de la aparición de los signos clínicos después de la inoculación de acogida 13. Este mandato tradicionalmente los estudios en animales largos y caros de bioensayo. Además, las propiedades bioquímicas y biofísicas de PrP Sc están pobremente caracterizados debido a su conformación inusual y estados de agregación. PrP Sc puede sembrar la conversión de PrP C y PrP Sc in vitro 14. El EPCP es una técnica in vitro que se Advantage de esta capacidad utilizando ciclos de sonicación y la incubación para producir grandes cantidades de PrP Sc, a un ritmo acelerado, a partir de un sistema que contiene cantidades en exceso de PrP C y pequeñas cantidades de la semilla PrP Sc 19. Esta técnica ha demostrado ser eficaz para recapitular la especificidad de especie y cepa de PrP Sc conversión de PrP C, para emular interferencia cepa de priones, y para amplificar los niveles muy bajos de PrP Sc partir de tejidos infectados, fluidos y muestras ambientales 6,7,16, 23. Este documento detalla el protocolo EPCP, incluyendo recomendaciones para minimizar la contaminación, generando resultados consistentes, y la cuantificación de los resultados. También se discuten varias aplicaciones del EPCP, incluyendo la generación y caracterización de cepas de priones infecciosos, la interferencia cepa de prión, y la detección de priones en el medio ambiente.

Misfolding proteína amplificación cíclica (PMCA) se utiliza para amplificar PrP Sc in vitro 7, 12, 14, 19, 24. El éxito de la amplificación PrP Sc se muestra por un aumento en la intensidad de la banda en las transferencias Western de la proteína priónica PK-resistente (migrando entre 19 y 30 kDa para las cepas de priones de hámster derivados) como se muestra en la Figura 3. El aumento de la intensidad de la banda después de su EPCP indica la amplificación del m...

Misfolding proteína amplificación cíclica (EPCP) es un ensayo in vitro para el estudio de la conversión de priones y barreras cepa y especie. También se puede utilizar como un ensayo de detección de priones.

Mal plegamiento de proteínas priones de amplificación cíclica

Los priones son agentes infecciosos que causan la encefalopatía espongiforme transmisible (EET), la cual es inevitablemente fatal, en animales y humanos9,18. La proteína priónica...

El objetivo de este procedimiento es amplificar con éxito cepas PreOn adaptadas a hámster in vitro. Esto se logra primero homogenizando cerebro de hámster no infectado para usarlo como sustrato, y luego preparando el tejido infectado para usarlo como inóculo. El segundo paso consiste en mezclar el sustrato y el inóculo en tubos para PCR, y luego realizar la amplificación cíclica de mal plegamiento proteico o PMCA mediante ciclos de sonicación e incubación.A continuación, el material amplificado se diluye con sustrato fresco y se amplifica en serie in vitro, y luego se realiza la AMCP. Finalmente, las muestras se digieren con proteinasa K y luego se analizan mediante inmunotransferencia. En última instancia, el aumento en la intensidad de las bandas en la inmunotransferencia puede utilizarse para determinar la amplificación in vitro de la cepa del prión.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de PreOn, como por ejemplo, ¿cuáles son los cofactores importantes implicados en la amplificación de PreOn? En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades con pequeños detalles, aunque importantes, relacionados con la técnica, así como para evitar la contaminación cruzada de muestras. Antes de homogeneizar, limpie las pipetas con lejía al 1%, y sature con lejía el portamuestras de tubos PCR, los homogeneizadores de tejidos y los estantes de almacenamiento de tubos PCR.Después de 10 minutos, enjuague cada pieza de equipo cuidadosamente con agua destilada y luego cubra el área de trabajo con una nueva almohadilla absorbente Verly dry lab. A continuación, utilice un homogenizador de tejidos de 10 buric y tampón de conversión recién preparado y frío con hielo para homogenizar un cerebro de hámster no infectado hasta obtener una solución al 10% peso por volumen. Para usos con la solución sustrato PMCA, coloque el homogenado en tubos cónicos de 15 mililitros y clarifique la solución homogenizada mediante centrifugación a 500 ×g durante 30 segundos.A continuación, teniendo cuidado de evitar la alícuota del gran pellet, transfiera el sobrenadante resultante a tubos microcentrífugos de 1,5 mililitros. Para preparar la solución semilla de PMCA, homogenice el material infeccioso recolectado hasta obtener una solución al 10% peso por volumen como se acaba de demostrar, pero utilizando suero salino tamponado con fosfato de daros o DPBS en lugar de tampón de conversión, y luego distribuya la solución en tubos microcentrífugos de 0,6 mililitros. Antes de comenzar el procedimiento de amplificación, cubra el área de trabajo con una servilleta de laboratorio seca y nueva, agregue el sustrato de PMCA a una tira de tubos PCR de paredes delgadas de 200 microlitros y diluya la semilla de PMCA en ella en una proporción de uno a 20; coloque un total de cuatro réplicas en tubos etiquetados con color rojo.Coloque dos réplicas de una alícuota de 15 microlitros de cada muestra en tubos PCR etiquetados en azul para usar como control no saturado a menos 80 grados Celsius. Coloque otras dos réplicas de una alícuota de 15 microlitros de cada muestra en tubos PCR para almacenarlos a 37 grados Celsius como un control no saturado adicional. A continuación, coloque los controles no saturados a menos 80 grados Celsius en un congelador a menos 80 grados Celsius y coloque los otros controles no saturados en un incubador a 37 grados Celsius durante toda la duración de la reacción de PMCA.Ahora comience la primera ronda de amplificación por PMCA colocando la tira de tubos PCR que contiene los 70 microlitros restantes de cada muestra en un sonicador conectado a un baño de agua recirculante ajustado a una temperatura constante de 37 grados Celsius. Puede incluirse un tubo PCR que contenga solo sustrato PMCA como control simulado para verificar la contaminación cruzada. No llene más del 30 % de los tubos del cabezal del sonicador distribuyendo los tubos PCR por toda la placa. Deje al menos una fila de espacio vacío entre las tiras de tubos PCR y no conecte más de cuatro tubos por tira.La amplificación de P-R-P-S-C varía a lo largo del cuerno de la microplaca. La mayor eficiencia de amplificación de P-R-P-S-C se obtiene dentro de un radio de cinco centímetros desde el centro del cuerno de la microplaca. Una ronda de PMCA consta de 144 ciclos con cinco segundos de sonicación y 10 minutos de incubación por ciclo, durante aproximadamente 24 horas por ronda de PMCA, mientras que durante la sonicación se ajusta la amplitud para tener una potencia de salida que oscile entre 155 y 170 vatios.Coloque una almohadilla calefactora para acuario sobre la tapa del sonicador para evitar la condensación de agua, la cual podría provocar contaminación cruzada de las muestras. Agite los tubos cada cinco horas para evitar la condensación de agua en las tapas abovedadas de los tubos PCR después de completar la ronda. Retire la tira de tubos del ator y centrifugue las muestras.Luego, vortexee suavemente los tubos, manteniendo la solución lejos de la tapa para evitar contaminación al abrirlos, minimizando así aún más la contaminación durante la apertura de los tubos. Evite tocar el borde y coloque la tapa sobre una toalla limpia de Kim. A continuación, para la PMCA en serie de la cepa PreOn, transfiera cinco microlitros de la muestra sonicada a 95 microlitros de sustrato PMCA fresco.Utilice guantes nuevos para cada muestra. A continuación, retire dos alícuotas de 15 microlitros de cada una de las muestras sonicadas y almacene una alícuota a menos 80 grados Celsius y la otra a 37 grados Celsius. Para las soluciones control no saturadas para la segunda ronda de PMCA, someta los residuos a una segunda ronda de PMCA como se acaba de demostrar.Este paso se puede repetir tantas veces como se desee. Se puede incluir un tubo de PCR que contenga solo sustrato PMCA del cerebro no infectado para verificar la contaminación cruzada después de haber realizado el número deseado de ciclos. En tubos de PCR separados, mezcle cinco microlitros de proteinasa K a 18 microgramos por mililitro con cinco microlitros de la muestra sonicada, la muestra control a menos 80 grados Celsius y la muestra control a 37 grados Celsius. Incube las muestras a 37 grados Celsius durante una hora para su digestión.Luego, agregue 10 microlitros de tampón de carga para geles a la muestra digerida y hierva la solución durante 10 minutos. Después de que se enfríe, cargue 10 microlitros de la mezcla de muestra y tampón de carga en un gel tipo bloque Western. Para determinar la cantidad de P-R-P-S-C amplificado, compare la cantidad de muestra digerida con proteinasa K en el blot de Western con los controles no saturados o con cantidades conocidas de proteinasa.K recombinante no digerido. P-R-P-C-P-M-C-A se utiliza para amplificar P-R-P-S-C in vitro; la amplificación exitosa de la proteína PreOn adaptada al hámster, CWD del hámster y TME somnoliento, puede observarse en este análisis western BLO mediante la comparación de las intensidades de las bandas antes y después de la digestión con proteinasa K de P-R-P-S-C seguida de análisis western BLO, que muestra una banda superior, media e inferior correspondientes a la proteína priónica di, mono y glucosilada, respectivamente. Algunas cepas de PreOn pueden diferenciarse por su movilidad electroforética.Por ejemplo, existe una diferencia de migración de dos kilodaltons entre las cepas de CWD del hámster y de TME somnoliento PreOn. Esta amplificación de alta fidelidad se observa mediante una migración electroforética similar de la cepa PreOn de CWD del hámster amplificada por PMCA en comparación con su semilla correspondiente de CWD del hámster, así como también para la cepa de TME somnoliento en comparación con su semilla de TME somnoliento. Si no ocurre contaminación cruzada ni formación de novo de P-R-P-S-C, el análisis por inmunotransferencia, las muestras de control de OFM de PMCA deben permanecer limpias tras la digestión con proteinasa K.Al intentar realizar este procedimiento, es importante recordar limpiar cada pieza de equipo antes de usar una nueva muestra, evitando así la contaminación cruzada.

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Research

Investigación

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Mal plegamiento de proteínas priones de amplificación cíclica

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