Transferencia de genes en embriones de pollo por los mayores Ex ovo La electroporación
27 de julio de 2012
Un método de transferencia de genes en embriones de pollo en las etapas posteriores de incubación (de más de Hamburger y Hamilton etapa (HH) 22) se describe. Este método supera las desventajas de In ovo se aplica a los embriones de pollo y de más edad es una técnica útil para estudiar la función génica y regulación de los últimos estadíos de desarrollo.
El objetivo general de este procedimiento es realizar la transferencia de genes en embriones de pollo más viejos in vivo para estudiar la función y la regulación de los genes en las etapas de desarrollo más avanzadas. Esto se logra rompiendo primero un huevo alrededor del día de incubación 2.5 y transfiriendo todo el embrión a un sistema de placa de Petri. El segundo paso es inyectar el plásmido, codificando el gen de interés en la parte apropiada del embrión.
Después de inyectar el plásmido, colocar electrodos al lado del embrión y realizar la electroporación X ovo electroporation, el paso final es recolectar los embriones electroporados para su análisis. En última instancia, la inmunohistoquímica se utiliza para detectar la expresión de genes transferidos en el embrión. Hoy te mostraremos cómo hacer la electroporación ovalada X usando BULs de pollo.
La principal ventaja de esta técnica es que la sobreelectroporación X puede superar los problemas de sobreelectroporación utilizada para la transferencia de genes en embriones de pollo más viejos. El cultivo X ovo exitoso de embriones de pollo requiere el uso de óvulos frescos fertilizados. No use huevos almacenados a 12 grados centígrados durante más de una semana.
Ponga los huevos sobre sus lados largos en una incubadora de tiro forzado a 37,5 grados centígrados con 60% de humedad después de la incubación durante 2,5 días. Cuando los embriones están en alrededor de hamburguesa y Hamilton. Etapa 17, saque los huevos de la incubadora.
Etiquete la parte superior de cada huevo con un lápiz para indicar la dirección en la que se rompe cada huevo. Vierta unos 20 mililitros de agua destilada estéril en una placa de Petri grande y limpia con un diámetro de 145 milímetros. Coloque una pequeña placa de Petri estéril con un diámetro de 94 milímetros en la placa de Petri grande.
A continuación, rompe cada huevo de la parte inferior contra un borde metálico afilado. Abra con cuidado el huevo y transfiera todo su contenido a la pequeña placa de Petri. Para garantizar la buena calidad del embrión, todo el contenido del óvulo debe mantenerse en una forma normalmente redonda en un sistema de placa de Petri sin ninguna lesión en la membrana de Vilin.
Después de transferir el contenido de cada huevo al plato pequeño, cubra el plato grande con una tapa. Coloque los sistemas de placas de Petri en otra incubadora para su posterior cultivo a 37,5 grados Celsius con aproximadamente un 60% de humedad antes de la electroporación X. Utilice un microelectrodo polar para extraer capilares de vidrio de tubos de vidrio de 1,0 milímetros de diámetro.
Rompa la punta de los capilares de vidrio en un diámetro apropiado. A continuación, configure los parámetros apropiados para la electroporación, como diferentes voltajes para el tejido y el tamaño distintivos de los embriones. Conecte los electrodos apropiados al electro de acuerdo con el tejido objetivo y el tamaño de los embriones.
Prepare una solución de plásmido que contenga plásmidos, que codifican un gen diana y un gen marcador. En esta demostración, la cadherina siete o CAD siete es el objetivo y la proteína fluorescente verde o GFP es el marcador. Agregue verde rápido a una concentración final de 0.1% para etiquetar la solución de plásmido como verde.
Por último, utilice una pipeta bucal para cargar el capilar de vidrio con la solución plásmida. Los embriones de pollo del cultivo X ovo que han sido incubados durante seis días se utilizan para la electroporación X ovo. Para comenzar este procedimiento, use pinzas finas para rasgar cuidadosamente las membranas de tileno y amnios sobre el tectum óptico y agregue tres gotas de solución estéril de cloruro de sodio al 0,9% sobre la superficie del tectum.
Con una pipeta bucal, inyecte la solución plásmida del capilar de vidrio en la cavidad del tectum. Coloque los electrodos con un cátodo de aguja de tungsteno y un ánodo de placa rectangular al lado del tectum. Utilice inmediatamente el electro para aplicar pulsos eléctricos al tectum.
Cubra la placa de Petri grande con la tapa y devuélvala a la incubadora dos o tres días después de la electroporación de los plásmidos que codifican GFP y CAD siete en el tectum de pollo en E seis, los tectum se recogen y fijan para la inmunotinción. Los resultados se muestran en esta figura en E ocho. La proteína GFP se expresa fuertemente en el tumor, como lo indican estas imágenes de montaje completo aquí.
El panel A es una imagen de campo claro. El panel B es una imagen GFP y el panel C emerge. Imagen además, en las secciones del tectum en E, nueve proteínas GFP visualizadas en verde en el panel D y CAD, siete proteínas visualizadas en rojo en el panel E se coexpresan como lo representa el color amarillo en el panel F. Cuando se realiza correctamente, la eficiencia de la electroporación X ovo es del 60 al 100%. Estos resultados sugieren que la electroporación X ovo es un método exitoso para la transferencia de genes a embriones de pollo más viejos in vivo.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la transferencia de genes en embriones de pollo más viejos y la buena suerte con su experimento.
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Visión general
Este artículo describe un método para la transferencia de genes en embriones de pollo más antiguos, específicamente aquellos más allá de la etapa 22 de Hamburger y Hamilton. La técnica tiene como objetivo facilitar el estudio de la función y regulación de genes durante las etapas de desarrollo posteriores.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Técnicas de transferencia de genes
- Desarrollo embrionario
- Métodos de electroporación
Antecedentes
- La transferencia de genes es crucial para estudiar la función de los genes.
- Los embriones de pollo más antiguos presentan desafíos únicos para la electroporación in ovo.
- Los métodos mejorados pueden mejorar los resultados de la investigación.
- Este estudio se centra en un enfoque novedoso para superar las limitaciones existentes.
Propósito del estudio
- Realizar transferencia de genes en embriones de pollo más antiguos in vivo.
- Investigar la función y regulación de genes en etapas de desarrollo avanzadas.
- Demostrar la eficacia de la electroporación X ovo.
Métodos utilizados
- Abrir el huevo en el día 2.5 de incubación.
- Transferir el embrión a un sistema de placa de Petri.
- Inyectar plásmido que codifique el gen de interés en el embrión.
- Realizar electroporación X ovo usando electrodos.
Principales resultados
- Transferencia exitosa de genes en embriones de pollo más antiguos.
- Detección de la expresión génica mediante inmunohistoquímica.
- Demostración de la técnica de electroporación X ovo.
- Posibles aplicaciones para el estudio de la regulación génica.
Conclusiones
- El método proporciona una alternativa viable para la transferencia de genes en embriones más antiguos.
- Mejora la capacidad para estudiar la función génica en etapas posteriores del desarrollo.
- La investigación futura puede basarse en esta técnica para diversas aplicaciones.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Studying gene function in later developmental stages is critical for target validation in developmental biology and disease modeling. The ex ovo electroporation method enables mechanistic de-risking by overcoming limitations of in ovo approaches in older embryos, supporting predictive confidence in gene regulation studies. This approach enhances translational continuity from discovery to preclinical validation in vertebrate systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses and pathway clarification in older chicken embryos.
- Operational Value: Supports biological de-risking and functional target validation at advanced developmental stages.
- Strategic Value: Improves predictive confidence and portfolio triage by allowing gene transfer when in ovo methods fail.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by enabling plasmid transfection in specific embryonic regions.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through controlled ex ovo culture and electroporation parameters.
- Strategic Value: Enhances screening readiness and scalability for compound evaluation in later-stage embryonic models.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance and translational biomarker alignment through gene expression detection in developing tissues.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation via immunohistochemistry-based readouts.
- Strategic Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by demonstrating successful gene transfer and expression in older embryos.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from Early Discovery to Lead Identification, supporting hypothesis testing and biological de-risking in vertebrate models.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing, pathway clarification, and biological de-risking in older embryos.
- Screening: Describes assay readiness, reproducibility, and quantitative outputs via plasmid injection and electroporation in cultured embryos.
- Analytics: Highlights measurements, readouts, or statistical outputs that help teams compare conditions, including immunohistochemistry for gene expression detection.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity or biomarker alignment through co-expression analysis of target and marker genes.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability rather than a single-use technique, applicable across developmental timepoints.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in gene function studies.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of gene transfer in older embryos.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in target validation.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on successful gene expression data.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in embryology, microsurgery, and electroporation techniques.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs include electrodes, pulse generators, and immunohistochemistry systems.
- Cross-team standardization requirements for embryo staging, plasmid preparation, and electroporation parameters.
- Adaptation considerations across model systems, including tissue-specific targeting and embryo age optimization.
- Practical limitations supported by source material: dependence on fresh fertilized eggs and precise staging for successful ex ovo culture.
