El Protocolo para la identificación de las interacciones proteína-proteína base de ¹⁵ N metabólico Etiquetado, inmunoprecipitación, cuantitativa Espectrometría de Masas y Modulación Affinity

El objetivo general del siguiente experimento es identificar proteínas que interactúen específicamente con una proteína diana determinada en extractos celulares que contienen proteínas solubles y de membrana. Primero, logre la marcación metabólica completa de células de Chlamydomonas con nitrógeno 14 y nitrógeno 15 y genere lisados celulares que contengan y carezcan de una TP. Un paso opcional de reticulación ayuda a estabilizar las interacciones transitorias entre proteínas. A continuación, separe los lisados celulares en fracciones, enriqueciendo las proteínas insolubles y de membrana a partir de las cuales se obtiene la proteína diana y sus socios específicos de interacción.

Una proteína control y proteínas contaminantes se inmunoprecipitan y se eluyen. Ahora, mezcle las proteínas inmunoprecipitadas, digiérales tres veces y analícelas mediante LCMS en tándem. Los resultados distinguieron entre socios de interacción verdaderos y falsos al mostrar diferentes proporciones de nitrógeno, péptidos de nitrógeno 14 y 15 para proteínas que interactúan específicamente con la proteína diana e igual nitrógeno.

Proporciones de péptidos de nitrógeno 15 para la proteína diana, la proteína de control y las proteínas contaminantes. El método de elección para analizar las interacciones proteína-proteína consiste en inmunoprecipitar directamente la proteína de interés junto con sus socios de interacción a partir de extractos celulares donde ambas se encuentran en su conformación y concentraciones nativas.

Sin embargo, al hacerlo, también se precipitan proteínas contaminantes principalmente porque interactúan con los anticuerpos, ya que los espectrómetros de masas modernos son extremadamente sensibles. Ellos identificarán inequívocamente también las proteínas contaminantes y, por lo tanto, es imposible distinguir entre errores y verdaderos socios de interacción. Este problema se supera mediante la técnica mostrada aquí, que se basa en el etiquetado metabólico con 15 N, la inmunoprecipitación, la modulación de afinidad mediada aquí por el estado de A TP y la espectrometría de masas cuantitativa.

La técnica será mostrada por Stefan SCH Malinger, quien es un estudiante de doctorado avanzado en mi laboratorio. Después de marcar las células durante 10 generaciones, transfiera dos alícuotas de células de Chlamydomonas marcadas con nitrógeno-14 y nitrógeno-15 a tubos 4G SA, recupérelas por centrifugación, resuspenda los pellets en dos mililitros de tampón de lisis frío con hielo y transfiera las suspensiones a tubos Falcon de 15 mililitros. Recolecte las células restantes con un mililitro adicional de tampón de lisis para cada tubo Eloqua. Añada 50 microlitros de inhibidor de proteasas 25x y 12,5 microlitros de cloruro de magnesio uno molar, y someta las muestras a sonicación cuatro veces durante 20 segundos en hielo para lograr una lisis celular completa, con descansos de 22 segundos entre cada ciclo para enfriamiento.

Prepare cuatro cojinetes de sacarosa de seis mililitros en tubos de pared delgada SW 41 TI. Deposite cuidadosamente todo el volumen de los lisados celulares sobre los cojinetes de sacarosa. Equilibre con tampón de lisis y centrifugue para separar los complejos proteicos solubles de las membranas.

Transfiera los complejos de proteínas solubles desde la parte superior del gradiente a cuatro tubos cónicos de 15 mililitros. Asegúrese de evitar transferir partes del cojín de sacarosa. Luego, agregue Triton X-100 al 10% a cada muestra hasta una concentración final del 0,5%. Mezcle cuidadosamente y añada tampón de lisis hasta un volumen total de siete mililitros.

Para análisis de inmunotransferencia SDS-PAGE y de sangre. Reservar 70 microlitros de cada extracto celular soluble en un tubo cónico nuevo de 1,5 mililitros y agregar 70 microlitros de tampón de muestra SDS al doble. A continuación, desechar los cojinetes de sacarosa de los tubos delgados SW 41 TI y agregar tres mililitros de tampón de lisis a cada precipitado.

Añada un mililitro de Triton X-100 al 10 % para obtener una concentración final del 2 %. Después de disolver cada pellet mediante sonicación, añada tampón de lisis hasta un volumen total de cinco mililitros y centrifugue. Como antes, recoja las fracciones superiores de los complejos de proteínas de membrana en tubos cónicos de 15 mililitros. Añada tampón de lisis que contenga Triton X-100 al 2 % hasta un volumen final de siete mililitros.

Utilice 70 microlitros de estas muestras para los análisis de electroforesis SDS-PAGE e inmunoensayo sanguíneo. Primero, equilibre la proteína acoplada al anticuerpo. Lleve a cabo dos lavados de cuatro mililitros con tampón de lisis en perlas de sero, diluya hasta ocho mililitros y alícuoteo.

Un mililitro de la suspensión a cada uno de los ocho tubos cónicos de 15 mililitros que contienen complejos de proteínas solubles o de membrana procedentes de células marcadas con nitrógeno 14 y nitrógeno 15, repletas y agotadas de TP, incubar durante dos horas a cuatro grados Celsius en un agitador rotatorio para tubos con el fin de precipitar los complejos proteicos. Pelletizar las perlas mediante centrifugación, desechar los sobrenadantes dejando un pequeño volumen de líquido sobre las perlas para evitar contaminación por proteínas adheridas a las paredes de plástico. Transferir las muestras a tubos cónicos nuevos de 1,5 mililitros para recoger todas las perlas restantes en los tubos falcon. Añadir otros 0,8 mililitros de tampón de lisis que contenga 0,1 % de Triton a cada uno, vortexear, centrifugar suavemente y transferir el tampón con las perlas residuales a los tubos eppendorf. Tras varios pasos de lavado, centrifugar las muestras durante 15 segundos a 16.100 × g y a cuatro grados Celsius.

Retire primero los sobrenadantes de la muestra con una pipeta normal. Luego, elimine completamente cualquier sobrenadante restante con la jeringa Hamilton de 50 microlitros. A cada muestra, añada 100 microlitros de tampón de elución recién preparado e incube en un mezclador térmico a 800 RPM, centrifugue las muestras durante 15 segundos a 16.100 veces G y 25 grados Celsius.

Ahora transfiera cada sobrenadante a un tubo nuevo utilizando una jeringa Hamilton de 50 microlitros limpia. También agregue 50 microlitros de tampón de elución a las perlas, siguiendo el mismo procedimiento que con las muestras anteriores, y reúna los eluidos respectivos. Recuerde reservar 30 microlitros de todos los EIT de muestra para análisis mediante electroforesis SDS-PAGE e inmunodetección.

Ahora combine los precipitados eluidos de las proteínas solubles y de membrana tratadas con ATP más y menos, marcadas con nitrógeno 14 y nitrógeno 15. Luego realice la reducción, alquilación y digestión inicial en alta concentración de urea según se describe en el manuscrito adjunto. Proceda a una digestión triptíca en una rueda rotatoria durante al menos 16 horas.

A 37 grados Celsius. Precipite las perlas de tripsina mediante una centrifugación de cinco minutos a 16.100 × g y 4 grados Celsius. Transfiera los sobrenadantes a tubos eppendorf nuevos de dos mililitros.

Lave los tubos antiguos con 50 microlitros de bicarbonato de amonio 20 milimolar, 0,5 % de ácido acético y reúna con los primeros sobrenadantes. Para preparar puntas C 18 caseras para desalar las muestras, corte dos discos del material C 18 emcor con una aguja de jeringa e insértelos en una punta de pipeta de 200 microlitros. Luego, haga agujeros en las tapas de cuatro tubos einor de dos mililitros e inserte las puntas. Precione las puntas de etapa C 18 con 50 microlitros de la solución B, centrifugue durante tres minutos a 800 ×g y 25 grados Celsius.

A continuación, equilibre las puntas tipo C 18 con 100 microlitros de solución, centrifugue durante tres minutos a 800 G y 25 grados Celsius. Repita este paso de equilibración una vez más. Proceda a cargar 100 microlitros de los sobrenadantes de la muestra procedentes de las digestiones triplicadas en las puntas tipo C 18, centrifugue durante tres minutos a 800 G y 25 grados Celsius.

Repita la carga en la columna para la aplicación completa de los sobrenadantes de la muestra. Después de lavar las puntas de fase C18, eluya los péptidos tripsínicos en un tubo Eppendorf nuevo de 1,5 mililitros con 50 microlitros de la solución B, centrifugue durante tres minutos a 800 ×g y 25 °C. Repita el paso de elución una vez y luego seque completamente los péptidos en un evaporador Speed VAC.

Suspenda los péptidos secos en 20 microlitros de solución A e incube durante al menos una hora en hielo, interrumpiendo con dos incubaciones de 15 minutos en baño ultrasónico, seguido de centrifugación durante 20 minutos a 16.100 × g y cuatro grados Celsius, y aplique Senna a nano C-M-S-M-S HSP 70. Se sabe que las proteínas de choque térmico interactúan con co-chaperonas específicas y sustratos únicamente en ausencia de ATP; en estos extractos celulares marcados con nitrógeno-14, hsP70B y CGE1 se localizan casi exclusivamente en la fracción soluble, independientemente del estado de ATP. En contraste, CF1β se localiza tanto en las fracciones soluble como enriquecida en membrana.

Dado que la sonicación rompe parte de CF una beta de la A TP Sintetasa ubicada en la membrana, sirve como control de carga para ambas fracciones. Cantidades similares de H HSP 70 B se precipitaron con los anticuerpos anti HSP 70 B a partir de extractos solubles marcados con nitrógeno 14 y nitrógeno 15, independientemente del estado de A TP. En contraste, se precipitaron bajos niveles de la proteína HS P 70 B a partir de las fracciones de membrana, con cantidades ligeramente mayores procedentes de fracciones de membrana desprovistas de A TP en comparación con fracciones de membrana repletas de A TP, tal como se esperaba por la afinidad de CGE E uno por hs.

P 70 B depende del contexto. En fracciones solubles o de membrana repletas de TP, ninguna CGE uno fue coprecipitada con HS P 70 B. Las cantidades de proteína CGE uno coprecipitadas con HS P 70 B a partir de fracciones solubles y de membrana agotadas de TP se correlacionan cuantitativamente con la cantidad de HSP 70 B precipitada. La interacción de CGE uno con HS P 70 B únicamente en estado A DP también se observa en el análisis mediante espectrometría de masas.

En este experimento, se prepararon precipitados a partir de mezclas de extractos marcados con nitrógeno 14 que carecían de TP y extractos marcados con nitrógeno 15 que contenían A TP. Aunque las formas marcadas pesada y ligera del péptido HS P 70 B se detectaron con intensidades iguales, solo se detectó la forma marcada ligera del péptido CGE uno en extractos agotados de A TP. Los mismos péptidos del precipitado anti HS P 70 D DB derivado de mezclas de extractos celulares solubles marcados recíprocamente se muestran aquí. En consecuencia, solo se detectó la forma marcada pesada del péptido CGE uno en extractos agotados de A TP, así como también las formas marcadas ligera y pesada del péptido HSP 70 B.

Después de ver este video, debería tener una buena idea de cómo realizar un experimento de co-inmunoprecipitación con preparación de muestras para análisis por espectrometría de masas. No olvide que las contaminaciones con proteínas humanas, especialmente queratina, alterarán sus mediciones de perfiles en el espectrómetro de masas, por lo tanto, las medidas de seguridad, como el uso de guantes, un ambiente limpio y reactivos de grado LCMS, son fundamentales al realizar este procedimiento.