El Protocolo para la identificación de las interacciones proteína-proteína base de ¹⁵ N metabólico Etiquetado, inmunoprecipitación, cuantitativa Espectrometría de Masas y Modulación Affinity

El objetivo general del siguiente experimento es identificar proteínas que interactúan específicamente con una proteína diana determinada en extractos celulares que contienen proteínas solubles y de membrana. En primer lugar, lograr el marcaje metabólico completo de las células de chlamydomonas con nitrógeno 14 y nitrógeno 15 y generar lisados celulares que contengan y carezcan de TP. Un paso opcional de reticulación ayuda a estabilizar las interacciones transitorias entre proteínas y proteínas. A continuación, separe los lisados celulares en fracciones, proteínas insolubles enriquecidas y proteínas de membrana a partir de las cuales la proteína objetivo, sus socios de interacción específicos.

Una proteína de control y las proteínas contaminantes son inmunoprecipitadas y aludidas. Ahora, mezcle las proteínas inmunoprecipitadas y digiera y analice tres veces mediante LCMS en tándem. Los resultados distinguieron entre socios de interacción verdaderos y falsos al mostrar diferentes proporciones de nitrógeno, 14 nitrógeno y 15 péptidos para las proteínas que interactúan específicamente con la proteína objetivo y nitrógeno igual.

14 Nitrógeno 15 proporciones de péptidos para la proteína objetivo, la proteína de control y las proteínas contaminantes. El método de elección para el análisis de las interacciones proteína-proteínas es la inmunoprecipitación de la proteína elegida directamente con su interacción. Socios de extractos celulares donde ambos se producen en su confirmación y concentraciones nativas.

Sin embargo, al hacerlo, también se precipitan proteínas contaminantes principalmente porque interactúan con los anticuerpos utilizados, ya que los espectrómetros de masas modernos son extremadamente sensibles. También identificarán inequívocamente las proteínas contaminantes y, por lo tanto, es imposible distinguir los errores de los verdaderos socios de interacción. Este problema se supera con la técnica que se muestra aquí, que se basa en la modulación de la afinidad de la inmunoprecipitación del marcaje metabólico de 15 N aquí mediada por el estado A TP y la espectrometría de masas cuantitativa.

La técnica será mostrada por Stefan SCH Malinger, quien es un estudiante de doctorado en mi laboratorio. Después de marcar las células durante 10 generaciones, transfiera dos alícuotas de cada una de las células de Chlamydomonas marcadas con nitrógeno 14 y nitrógeno 15 a los tubos 4G SA recolectados por centrifugación Resus, suspenda los gránulos en dos mililitros de tampón de lisis helado y para transferir las suspensiones a tubos Falcon de 15 mililitros, recoja las células restantes con un mililitro adicional de tampón de lisis cada uno a cada Eloqua. Agregue 50 microlitros de inhibidor de proteasa 25 x y 12,5 microlitros de muestras de sonitrato de cloruro de magnesio molar cuatro veces y 20 segundos en hielo para ISIS de celda completa con 22 pausas intermedias para enfriamiento.

Prepare cuatro cojines de sacarosa de seis mililitros en tubos de pared delgada SW 41 TI. Coloque con cuidado todo el volumen de los lisados celulares sobre las almohadillas de sacarosa. Equilibre con lisis, tampón y centrífuga para separar los complejos de proteínas solubles de las membranas.

Transfiera los complejos de proteínas solubles de la parte superior del gradiente a cuatro tubos de halcón de 15 mililitros. Asegúrese de evitar transferir partes de la almohadilla de sacarosa. A continuación, añada a cada muestra un 10%Triton X 100 hasta una concentración final de 0,5%Mezcle cuidadosamente y añada tampón de lisis hasta un volumen total de siete mililitros.

Para la página SDS y análisis de sangre inmunológicos. Reserve 70 microlitros de cada extracto de células solubles en un tubo cónico nuevo de 1,5 mililitros y agregue 70 microlitros de dos tampones de muestra XSDS. A continuación, deseche las almohadillas de sacarosa de los tubos de pared delgada SW 41 TI y agregue tres mililitros de tampón de lisis a cada pellet.

Añadir un mililitro de 10%tritton X 100 a una concentración final de 2%Después de disolver cada pellet por sonicación, añadir tampón de lisis hasta un volumen total de cinco mililitros y centrifugar. Como antes, coseche las fracciones superiores de los complejos de proteínas de membrana en tubos de halcón de 15 mililitros. Añadir tampón de lisis que contenga un 2%tritton X 100 hasta un volumen final de siete mililitros.

Utilice 70 microlitros de estas muestras para análisis de sangre inmunológica y de página SDS. En primer lugar, equilibrar la proteína acoplada al anticuerpo. Un sero perlas con dos lavados de cuatro mililitros de tampón de lisis diluido a ocho mililitros y alícuota.

Un mililitro de la suspensión a cada uno de los ocho tubos de halcón de 15 mililitros que contienen complejos de proteínas solubles o de membrana de una célula de nitrógeno 14 y nitrógeno 15 repleta de TP y una empobrecida en TP incuban durante dos horas a cuatro grados centígrados en un rodillo de tubo para precipitar complejos de proteínas que granulan las perlas por centrifugación, Deseche los sobrenadantes, dejando un pequeño volumen de líquido encima de las perlas para evitar la contaminación por las proteínas que se adhieren a las paredes de plástico. Transfiera las muestras a tubos cónicos nuevos de 1,5 mililitros para recoger todas las cuentas restantes en los tubos de halcón. Añadir otros 0,8 mililitros de tampón de lisis que contenga 0,1%tritton a cada vórtice, centrifugar suavemente y transferir el tampón con perlas residuales a los tubos de einor Después de varios pasos de lavado, centrifugar las muestras durante 15 segundos a 16, 100 veces G y cuatro grados centígrados.

Retire primero los sobrenadantes de la muestra con una pipeta normal. A continuación, elimine por completo cualquier sobrenadante restante con la jeringa Hamilton de 50 microlitros. A cada muestra, agregue 100 microlitros de tampón de elución recién preparado e incube en un termomezclador a 800 RPM, centrifugue las muestras durante 15 segundos a 16, 100 veces G y 25 grados Celsius.

Ahora transfiera cada sobrenadante a un tubo nuevo usando una jeringa Hamilton limpia de 50 microlitros. También agregue 50 microlitros de tampón de elución al proceso de perlas como con las muestras anteriores y agrupe los elates respectivos. Recuerde reservar 30 microlitros de todas las muestras de EIT para la página SDS y los análisis de sangre inmunológicos.

Ahora combine los precipitados eluidos de más y menos A nitrógeno 14 tratado con TP y proteínas solubles y de membrana marcadas con nitrógeno 15. A continuación, realice la alquilación de reducción y la digestión inicial con alto contenido de urea como se describe en el manuscrito adjunto. Proceda a un resumen del tríptico en una rueda de rotación durante al menos 16 horas.

A 37 grados centígrados. Granular los tripin con una centrifugación de cinco minutos a 16, 100 veces G y cuatro grados centígrados. Transfiera los sobrenadantes a tubos frescos de einor de dos mililitros.

Lavar los tubos viejos con 50 microlitros de bicarbonato amónico de 20 milimolares, ácido acético al 0,5% y piscina con los primeros sobrenadantes. Con el fin de preparar puntas caseras de C 18 para desalar las muestras, corte dos discos de material emcor C 18 con una aguja de jeringa e insértelos en una punta de pipeta de 200 microlitros. A continuación, perfore las tapas de cuatro tubos de einor de dos mililitros e inserte las puntas de preacondicionar las puntas de la etapa C 18 con 50 microlitros de centrífuga de solución B durante tres minutos a 800 G y 25 grados centígrados.

A continuación, equilibre las puntas de la etapa C 18 con 100 microlitros de solución, una centrífuga durante tres minutos a 800 G y 25 grados centígrados. Repita este paso de equilibrio una vez más. Proceda a cargar 100 microlitros de los sobrenadantes de la muestra de las digestiones del tríptico en la centrífuga de puntas de etapa C 18 durante tres minutos a 800 G y 25 grados centígrados.

Repita la carga de la columna para la aplicación completa de los sobrenadantes de muestra. Después de lavar las puntas de la etapa C 18, eluya los péptidos trípticos en un tubo de einor fresco de 1,5 mililitros con 50 microlitros de centrífuga de solución B durante tres minutos a 800 G y 25 grados Celsius. Repita el paso elucian una vez y luego seque los péptidos hasta el final en un reus de velocidad VAC.

Suspender los péptidos secos en 20 microlitros de solución A e incubar durante al menos una hora en hielo, interrumpida por dos incubaciones de 15 minutos en una centrífuga de baño sónico durante 20 minutos a 16, 100 veces G y cuatro grados Celsius y aplicar Senna a nano C-M-S-M-S HSP 70. Se sabe que las proteínas de choque térmico interactúan con chaperonas y sustratos específicos solo en ausencia de un TP en estos extractos celulares marcados con nitrógeno 14 hs P 70 B y CGE uno se localizan casi exclusivamente en la fracción soluble independiente del estado A TP. Por el contrario, CF one beta se localiza tanto en la fracción soluble como en la enriquecida con membrana.

Dado que la sonicación corta parte de CF una beta de la membrana A TP Synthes, sirve como control de carga para ambas fracciones. Se precipitaron cantidades similares de H HSP 70 B con los anticuerpos anti HSP 70 B de extractos solubles marcados con nitrógeno 14 y nitrógeno 15 independientemente del estado A TP. Por el contrario, los niveles bajos de la proteína HS P 70 B precipitaron a partir de fracciones de membrana con cantidades ligeramente mayores originadas en fracciones de membrana agotadas por TP en comparación con fracciones repletas de TP como afinidad esperada de CGE E uno para hs.

P 70 B depende del contexto. Ninguno de los CGE fue coprecipitado con HS P 70 B.In fracciones solubles o de membrana repletas de TP. Las cantidades de CGE una proteína coprecipitada con HS P 70 B a partir de fracciones solubles empobrecidas en TP y fracciones de membrana empobrecidas en TP se correlacionan cuantitativamente con la cantidad de HSP 70 B precipitada. La interacción de CGE one con HS P 70 B solo en el estado A DP también se observa en el análisis por espectrometría de masas.

En este experimento, se prepararon precipitados para mezclas de 14 extractos marcados con nitrógeno que carecían de un TP y nitrógeno, 15 extractos marcados que contenían A TP. Mientras que las formas marcadas pesadas y ligeras del péptido HS P 70 B se detectaron a intensidades iguales, solo se detectó la forma marcada ligera del péptido CGE one de los extractos empobrecidos en A TP. Aquí se muestran los mismos péptidos del precipitado anti HS P 70 D DB derivados de mezclas de extractos de células solubles marcados recíprocamente. En consecuencia, solo se detectó la forma pesada marcada del péptido CGE one en extractos agotados con TP, así como los péptidos HSP 70 B marcados ligeros y pesados.

Después de ver este video, debería tener una buena impresión de cómo realizar un experimento de precipitación de colores con preparación de muestras para el análisis de espectrometría de masas. No olvide que las contaminaciones con proteínas humanas, especialmente queratina, perturbarán sus mediciones de profilaxis en el espectrómetro de masas y, por lo tanto, las precauciones de seguridad, como los guantes, el entorno limpio y las regiones de grado LCMS, son cruciales al realizar este procedimiento.