Creación de ambientes definidos de gases para el Estudio de los efectos de la hipoxia en el C. elegans

El objetivo del siguiente experimento es establecer y mantener una cámara de hipoxia utilizando un método de flujo continuo. Esto se logra mediante la obtención y fabricación de los tubos, matraces y cámaras necesarios para el procedimiento. Como segundo paso, conecte el tanque de oxígeno y seleccione el caudal para crear el nivel deseado de hipoxia.

Hidrata el gas pasándolo a través de un matraz de burbujas lleno de agua desionizada. Conecte el gas hidratado a la cámara de hipoxia y coloque las muestras de prueba en la cámara para exponerlas a condiciones hipóxicas. Se obtienen resultados que muestran letalidad embrionaria dependiente de Hi F1 en hipoxia a partir de la observación de viabilidad hasta la edad adulta.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como las guanteras, es que es fácil y económica de fabricar en el laboratorio y proporciona una concentración precisa y reproducible de gases en la cámara ambiental. Si bien este método proporciona información sobre la respuesta hipóxica en el nematodo C, también se puede adaptar a otros sistemas, incluidos los organismos modelo más grandes y el cultivo celular. Además, se puede utilizar para estudiar otros gases, como el dióxido de carbono y el sulfuro de hidrógeno.

Este protocolo demuestra cómo construir una cámara de hipoxia. El gas se almacena en tanques de gas comprimido con concentraciones de oxígeno definidas y se conecta un regulador de dos etapas. El gas entra en la parte inferior del tubo de flujo y sale por la parte superior al caudal correcto.

A continuación, el gas fluye hacia el matraz de burbujas hidratando el gas. Luego, el gas hidráulico pasa a la cámara de hipoxia en la válvula de entrada, exponiendo las muestras a hipoxia. El gas finalmente se ventila en la habitación a través de un orificio de escape perforado en la cámara.

Se puede utilizar un plato de cristalización Pyrex o en una caja de paquete de flechas como cuerpo de la cámara ambiental. El volumen del recipiente debe mantenerse al mínimo y el material debe ser impermeable al gas. Taladre un agujero en un lado del recipiente con una punta de carbono o diamante, taladre y colóquelo con un accesorio de lengüeta de manguera de plástico.

Mezcle el epoxi antes de la aplicación a la caja y al ajuste. Luego repita el mismo procedimiento en el lado opuesto del recipiente con el segundo orificio desplazado del primero. Para aumentar la mezcla turbulenta, use un tubo de nylon o FEP de un octavo de pulgada de diámetro exterior para conectar los tanques de gas comprimido a un dispositivo de control de flujo, como un controlador de flujo másico o un medidor de rotor.

Los tanques de gas deben tener concentraciones de oxígeno definidas equilibradas con nitrógeno que cumplan con un estándar certificado para el contenido de oxígeno o para condiciones anóxicas. El nitrógeno puro utiliza un regulador de dos etapas con la segunda etapa ajustada a la presión deseada. Consulte las instrucciones en el protocolo escrito para seleccionar un caudal adecuado.

Luego, conecte la tubería del regulador de dos etapas al tubo de flujo que controla el caudal de gas que ingresa a la cámara. Las salidas del tubo de flujo están conectadas a una botella de lavado de gas con un cilindro fritado que contiene agua destilada. A continuación, conecte el tubo del otro lado de la botella de lavado a uno de los accesorios de la cámara ambiental.

Esto hidratará el gas que ingresa a la cámara ambiental. Use grasa de vacío para sellar la cámara. A continuación, coloque las pesas en la tapa de la cámara para garantizar un sellado hermético.

Pruebe el sello sosteniendo una pequeña cantidad de agua en la palma de una mano enguantada contra el accesorio de escape de gas en la cámara y verificando si hay burbujas. En primer lugar, generar poblaciones sincronizadas de Elgan marino. Coloque de uno a 100 GR de adultos en una gota de solución de lejía alcalina en la superficie de una placa de medio de crecimiento de nematodos sin semillas.

Deje que la solución de lejía se absorba en la placa después de un período de incubación de al menos ocho horas. Transfiera las larvas L one sincronizadas a un plato sembrado con bacterias OP 50 vivas. Alternativamente, permita que los adultos de GRA pongan huevos en el plato durante dos o tres horas para generar un grupo de gusanos que se desarrollarán sincrónicamente o elija cuatro larvas de una población mixta para recolectar embriones jóvenes.

En la etapa de dos a cuatro células, use una cuchilla de afeitar para cortar adultos GR en un pequeño volumen de agua y luego transfiera los embriones con una pipeta bucal antes de transferir los gusanos a la placa para exponerlos a condiciones hipóxicas. Coloque un anillo de 10 miligramos por mililitro de ácido palmítico en etanol alrededor del borde de las placas. Para evitar que los gusanos se escapen de la superficie de la placa de agar.

El ácido palmítico saldrá de la solución. A medida que el etanol se evapora formando una barrera física para garantizar la uniformidad, asegúrese de reemplazar el agua en la botella de lavado de gas antes de la exposición en la cámara ambiental. Después de transferir los gusanos a las placas, selle las placas en la cámara ambiental, inicie el flujo de gas y mantenga la exposición durante el tiempo deseado para el ensayo.

Para la viabilidad de los embriones hasta la edad adulta, permita que los gusanos se desarrollen 48 horas después de que regresen al aire ambiente, momento en el que deberían estar. Las larvas de la cuarta etapa o los adultos de un día puntúan la viabilidad hasta la edad adulta. Para visualizar que los gusanos presentan una exposición hipóxica, transfiera los gusanos a una gota de M nueve en un cubreobjetos cuadrado de 22 milímetros e inviértalos en una almohadilla de 2%aros en M nueve si es necesario.

Se pueden usar 25 milimolares de amol o 10 milimolares de azida de sodio como anestésico. Alternativamente, después de la exposición a la hipoxia, la cámara ambiental transparente se puede colocar directamente en la platina de un telescopio de disección. Se muestran dos vistas, una, que incluye toda la configuración del flujo de gas.

El otro con solo la cámara en la platina del microscopio. Cultive Bristol N dos lombrices en cuatro placas de crecimiento de 10 centímetros de altura hasta que la mayoría de las lombrices sean adultas GR. Lave las lombrices en un tubo cónico de 15 mililitros con una solución de lejía alcalina de una a cinco y cocine con rotación hasta que las lombrices comiencen a disolverse.

No más de cinco minutos. Lave los gusanos tres veces con M nueve girando hacia abajo a 1, 500 veces G entre cada lavado sin placa de rotura. Los embriones blanqueados se colocan en 8 placas de NGM de 150 milímetros y permiten que los embriones se desarrollen en larvas L cuatro durante unas 48 horas.

A 22 grados centígrados, mueva las placas a la cámara ambiental y expóngalas a condiciones hipóxicas y anóxicas durante cuatro horas o durante el tiempo especificado por el diseño experimental. Para recolectar muestras, retire rápidamente la tapa de la cámara hipóxica. Tome una placa de muestra y vuelva a sellar el tiempo de la cámara y registre los pasos.

Después de eliminar los gusanos de la hipoxia, todo este proceso debería durar menos de dos minutos. Use agua destilada para lavar los gusanos en un filtro de nailon y luego viértalos en un tubo cónico etiquetado de 15 mililitros que contenga 100 microlitros de centrífuga SDS al 1%. Los gusanos en SDS en una centrífuga de escritorio son 1.500 veces G durante 15 a 20 segundos.

Con la rotura, use una aspiradora para eliminar la mayor parte del supinato del tubo, dejando la bolita de gusano intacta. Con una pipeta, transfiera el gránulo de gusano con un volumen predeterminado de líquido a un tubo de 1,5 microrresiduos etiquetado. Si la muestra se va a utilizar para la página SDS, este tubo puede contener un volumen igual de dos veces la carga de proteína, sellar el tubo y sumergirlo en nitrógeno líquido.

Repita hasta que se hayan aislado todas las muestras. Siga estos procedimientos para las muestras de control de aire doméstico para obtener consistencia, las muestras se pueden almacenar a menos 20 grados centígrados. Esta cifra muestra la viabilidad de los embriones expuestos a 1000 partes por millón de oxígeno, 5.000 partes por millón de oxígeno y normoxia alrededor de 210.000 partes por millón de oxígeno.

Los embriones se exponen a cada condición durante 24 horas en cámaras de oxígeno de flujo continuo. Los gusanos se trasladaron a condiciones normóxicas, se les permitió desarrollarse hasta la edad adulta durante 48 horas, y luego se evaluó su viabilidad hasta la edad adulta. Siguiendo este procedimiento, se pueden recoger muestras para su posterior análisis mediante QPCR de Western blot o ensayos fisiológicos como la esperanza de vida o la producción de progenie.

Después de ver este video, debería tener una buena idea de cómo configurar una cámara de hipoxia de flujo continuo en su propio laboratorio.