Name: Análisis in vitro de PDZ-dependientes de complejos macromoleculares de señalización CFTR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Aprende a ensamblar complejos macromoleculares de señalización CFTR dependientes de PDZ in vitro mediante expresión de proteínas recombinantes en bacterias y western blot. Este método permite visualizar directamente las interacciones proteicas.

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Nuestro trabajo ha sido apoyado por becas de la American Heart Association (Gran Afiliado Sureste) 0765185B A partir de la concesión en la ayuda, la Fundación Elsa U. Pardee beca de investigación, y la Universidad Estatal de Wayne fondo de intramuros de inicio y de Investigación Cardiovascular del Instituto premio Iniciativa Isis. Este método de in vitro conjunto complejo macromolecular CFTR fue originalmente iniciado por el Dr. AP Naren (Universidad de Tennessee Health Science Center).

1. Expresión y purificación de proteínas recombinantes de fusión con la etiqueta en las bacterias <ol><li> Amplificar las regiones definidas de la C-colas (en los últimos 50-100 aminoácidos que contienen los motivos PDZ en C-terminal) de CFTR, LPA 2, MRP2, MRP4, β 2 AR, y NHERFs (de larga duración o dominios PDZ1 o PDZ2 ) por el método PCR. </li><li> Clonar los productos de PCR en pGEX4T-1 vector de fusión GST-proteínas (como GST-NHERFs, GST-MRP4 TC), pMAL-C2 vector de las proteínas de fusión MBP-(como MBP-β 2 AR CT, PAM-CFTR CT ), y pET30 para His-S-proteínas de fusión (tales como Su-S-CT CFTR, Su-S-PDZK1). </li><li> Transformación en una E. proteasa deficiente coli cepa (BL21-DE3) para minimizar la posible degradación de proteínas recombinantes. </li><li> Mantener el cultivo durante la noche a 37 ° C en medio Luria-Bertani (pH 7,0) que contenía los antibióticos adecuados (por ejemplo, ampicilina o kanamicina). Diluir el cultivo durante la noche a 1:10 y crecer durante otras 2 horas a 37 ° C. Enducir con 0,5-1 m M IPTG durante los próximos 4 horas a 30 ° C. Precipitar las células por centrifugación a 8.000 × g durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Lisar las células en tampón de sacarosa (50 m M de Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, y 10% de sacarosa) que contenía lisozima (1 mg / ml), 0,2% de Triton X-100, y la proteasa inhibidores. Utilizar 20 ml de sedimento de células procedentes de 1 litro de cultivo. </li><li> Mezclar en un agitador rotatorio durante 30 min a 4 ° C. </li><li> Girar a 20.000 rpm durante 30 min a 4 ° C. Recoger el sobrenadante claro. </li><li> En el sobrenadante claro, añadir 1 ml de los siguientes resina / agarosa bolas (50% suspensión en tampón de sacarosa): <ul><li> Glutatión agarosa para las proteínas de fusión GST. </li><li> Talon cuentas de Sus-S proteínas de fusión. </li><li> La amilosa resina para las proteínas de fusión MBP. </li></ul></li><li> Mezclar durante 4 horas a 4 ° C en un agitador rotatorio. </li><li> Lavar las perlas por resuspensión en PBS 1x (15 ml), mezclando durante 2 millasn, girando a 800 xg durante 2 min, y desechar el sobrenadante. Repita este paso para seis veces. </li><li> Eluir la proteína de las perlas usando tampón de elución respectivo (2 tampón de elución ml por 1 ml de perlas). <ul><li> Tampón de elución de proteínas de fusión GST: 25 m M de Tris-HCl (pH 8,0), 140 m M de NaCl, y 20 m M glutatión reducido. </li><li> La elución de las proteínas tampón Sus fusión: 20 m M de Tris-HCl (pH 8,0), 500 m M de NaCl, y 200 m M imidazol. </li><li> La elución tampón para proteínas de fusión MBP: 20 m M de Tris-HCl (pH 8,0), 200 m M de NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT y 10 m M de maltosa. </li></ul></li><li> Dializar las proteínas eluidas contra 2 l de 1x PBS a 4 ° C (para evitar la degradación de proteínas es posible). Cambio de PBS cada 4 h durante cuatro veces. Concentrar la proteína utilizando un filtro Centricon (10.000 MW de corte, Millipore) y almacena como pequeñas alícuotas a -80 ° C. </li><li> Detarmiño la concentración de proteínas por el método de Bradford. Evaluación de la calidad de proteínas por SDS-PAGE utilizando BSA como estándares. Si la integridad de la proteína no es satisfactoria, los procedimientos secundarios de purificación tales como filtración en gel o intercambio iónico puede ser utilizado. (Por ejemplo, hemos utilizado una columna G-75 para purificar más Sepharosa fusión GST-proteína). </li></ol> 2. Cultivo de células y preparación de lisado celular <ol><li> Cultura de riñón de cría de hámster (BHK), células que sobre-expresan de forma estable CFTR-CFTR en peso y His10-o células BHK que transitoriamente sobre-expresan la bandera-LPA-2 en peso o la bandera de la LPA-2-ΔSTL, y de Madin-Darby de riñón canino (MDCK ) células que sobreexpresan establemente MRP2 en medio esencial mínimo de Eagle (MEM) que contienen 10% de suero fetal de ternero y penicilina / estreptomicina en matraces de poliestireno a 37 ° C con 5% de CO 2. </li><li> Cultura riñón embrionario humano 293 (HEK293) células que sobre-expresan de forma estable CFTR en peso y el CFTR His10 en Dulbecco&#39;S medio de Eagle modificado (DMEM) suplementado con fetal al 10% de suero bovino y penicilina / estreptomicina en matraces de poliestireno a 37 ° C con 5% de CO 2. </li><li> Lisar las células en tampón de lisis (PBS - 0,2% de Triton-X-100 suplementado con una mezcla de inhibidores de proteasas que contienen 1 m M de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 1 mg / ml de aprotinina, 1 mg / ml de leupeptina, 1 mg / ml de pepstatina); uso 500 l de tampón de lisis para cada plato 60-mm de Petri, y 1000 l de tampón de lisis para cada plato de Petri de 100 mm. </li><li> Rock the lisados ​​celulares durante 20 min a 4 ° C, y eliminar el material insoluble por centrifugación a 16.000 xg durante 15 min a 4 ° C. Determinar la concentración de proteína por el ensayo de Bradford. </li></ol> 3. En la Asamblea in vitro de un complejo macromolecular que contiene CFTR (CFTR PDZK1-MRP4) <ol><li> En 200 l de buffer de lisis (PBS - 0,2% de Triton X-100 + inhibidores de la proteasa), añadir 20 g purificado GST-MRP4-C-terminal50 bis (CT50) proteína de fusión. </li><li> Añadir varias cantidades (0-40 g) de su purificada-S-PDZK1 proteína de fusión. </li><li> Mezclar las dos proteínas en un mezclador rotatorio a 22 ° C durante 1-2 h. </li><li> Añadir 20 perlas de glutatión l (50% suspensión) en la mezcla de proteínas, y continuar mezclando durante otras 1. Este paso se conoce también como pares de enlace. </li><li> Durante este tiempo, preparar las HEK293 lisados ​​de células que sobreexpresan Bandera-CFTR (en peso) como se describió anteriormente en el Paso 2). </li><li> Lavar el complejo dos veces con tampón de lisis. Gira a 800 xg durante 1 minuto por cada lavado y cuidado aspirar el sobrenadante después de cada lavado. Tenga cuidado de no chupar las bolas en la parte inferior. </li><li> Añadir los anteriormente preparadas HEK293 lisados ​​celulares a las perlas, y mezcle suavemente a 4 ° C durante 3 horas (o durante la noche). </li><li> Lavar las perlas extensamente tres veces con tampón de lisis tal como se describe en el Paso 3,6). </li><li> Eluir las proteínas con 30 muestras de búfer l (5 x): 0,6 M<html> Tris-HCl (pH 6,8), 50% de glicerol, 2% de SDS, y 0,1% de azul de bromofenol; que contiene 5% β-mercaptoetanol. </li><li> Incubar en baño de agua 37 ° C durante 10-15 minutos, y giran a 5.000 rpm durante 30 s para precipitar las cuentas. </li><li> Cargar todo el eluato en 4-15% de gel. </li><li> Ejecutar SDS-PAGE durante aproximadamente 30-40 min. </li><li> Transferir bandas de proteína a la membrana de PVDF, durante 1,5 horas. </li><li> Bloque de la membrana en TBS-Tween que contenía 5% de leche sin grasa. </li><li> Incubar la membrana con el anticuerpo primario (tales como anti-IgG de CFTR, R1104) a 4 ° C, durante la noche. </li><li> Lavar la membrana con TBS-Tween durante 5 minutos, seis veces. </li><li> Incubar la membrana con el anticuerpo secundario (como cabra anti-ratón conjugado HRP-anticuerpo nd 2) durante 45 min a 22 ° C. </li><li> Lavar la membrana con TBS-Tween durante 5 minutos, seis veces. </li><li> Visualizar las bandas de proteínas a través de ECL. </li><li> Los datos representativos se muestran en la Figura 1. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 4. Los resultados representativos Un ejemplo de complejo macromolecular que contiene CFTR de señalización que se montó en vitro se muestra en la Figura 1. Un complejo macromolecular se formó entre MRP4 C-terminal de 50 aminoácidos (MRP4-CT50), los PDZK1 y de larga duración CFTR (Figura 1, abajo). La formación del complejo mayor dosis-dependiente con cantidades crecientes de la proteína intermediario, PDZK1 (Figura 1, parte inferior) 18. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4091/4091fig1.jpg" /> Figura 1. Una representación pictórica del ensayo complejo macromolecular (arriba). Un complejo macromolecular fue detectado in vitro con tres proteínas (GST-CT50-MRP4, Su-S-PDZK1, y la bandera CFTRwt) de una manera dosis-dependiente (abajo) 18. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td><strong&gt; CFTR NHERF1-β 2 AR (ref. 14) </td><td> CFTR NHERF2-LPA 2 (ref. 15) </td><td> CFTR proteínas PDZ-MRP 2 (ref. 17) </td><td> CFTR PDZK1-MRP4 (ref. 16) </td></tr><tr><td> Cuentas de afinidad </td><td> La amilosa de resina </td><td> S-proteína de agarosa </td><td> La amilosa de resina </td><td> El glutatión agarosa </td></tr><tr><td> Purificada proteína-1 </td><td> MBP-β 2 AR CT </td><td> Su-S-CFTR CT </td><td> MBP-CFTR CT </td><td> GST-MRP4 CT </td></tr><tr><td> Purificada proteína-2 </td><td> GST-NHERF1 </td><td> GST-NHERF2 </td><td> GST-proteínas PDZ </td><td> Su-S-PDZK1 </td></tr><tr><td> Purificada proteína-3 (o lisados ​​celulares) </td><td> CFTR en peso o CFTR His10 (BHK o lisados ​​de células HEK) </td><td> BanderaLPA-2-en peso o la bandera de la LPA-2-ΔSTL (lisados ​​de células BHK) </td><td> MRP2 (lisados ​​de células MDCK) </td><td> Purificada Bandera-CFTR en peso o CFTR His10-(o lisados ​​celulares) </td></tr><tr><td> Anticuerpo </td><td> IgG anti-CFTR </td><td> Anti-Flag HRP </td><td> Anti-IgG MRP2 </td><td> Anti-Flag HRP </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Resumen de diversos complejos macromoleculares que contienen CFTR ensamblados in vitro.

<ol><li>Anderson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+that+CFTR+is+a+chloride+channel+by+alteration+of+its+anion+selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Demonstration that CFTR is a chloride channel by alteration of its anion selectivity.</a> Science. 253, 202-205 (1991).</li>
<li>Bear, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+functional+reconstitution+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+%28CFTR%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Purification and functional reconstitution of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR.</a> Cell. 68, 809-818 (1992).</li>
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<li>Cheng, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+intracellular+transport+and+processing+of+CFTR+is+the+molecular+basis+of+most+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Defective intracellular transport and processing of CFTR is the molecular basis of most cystic fibrosis.</a> Cell. 63, 827-834 (1990).</li>
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<li>Chao, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+intestinal+CFTR+Cl-+channel+by+heat-stable+enterotoxin+and+guanylin+via+cAMP-dependent+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Activation of intestinal CFTR Cl- channel by heat-stable enterotoxin and guanylin via cAMP-dependent protein kinase.</a> Embo. J. 13, 1065-1072 (1994).</li>
<li>Gabriel, S. E., Clarke, L. L., Boucher, R. C., Stutts, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+and+outward+rectifying+chloride+channels+are+distinct+proteins+with+a+regulatory+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">CFTR and outward rectifying chloride channels are distinct proteins with a regulatory relationship.</a> Nature. 363, 263-268 (1993).</li>
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<li>Schreiber, R., Nitschke, R., Greger, R., Kunzelmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+activates+aquaporin+3+in+airway+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator activates aquaporin 3 in airway epithelial cells.</a> J. Biol. Chem. 274, 11811-11816 (1999).</li>
<li>Shumaker, H., Amlal, H., Frizzell, R., Ulrich, C. D. 2nd, Soleimani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+drives+Na%2B-nHCO-3+cotransport+in+pancreatic+duct+cells%3A+a+basis+for+defective+HCO-3+secretion+in+CF%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">CFTR drives Na+-nHCO-3 cotransport in pancreatic duct cells: a basis for defective HCO-3 secretion in CF.</a> Am. J. Physiol. 276, 16-25 (1999).</li>
<li>Ahn, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+interaction+between+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+and+HCO3-+salvage+mechanisms+in+model+systems+and+the+mouse+pancreatic+duct%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulatory interaction between the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator and HCO3- salvage mechanisms in model systems and the mouse pancreatic duct.</a> J. Biol. Chem. 276, 17236-17243 (2001).</li>
<li>Sugita, M., Yue, Y., Foskett, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+Cl-+channel+and+CFTR-associated+ATP+channel%3A+distinct+pores+regulated+by+common+gates%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">CFTR Cl- channel and CFTR-associated ATP channel: distinct pores regulated by common gates.</a> Embo. J. 17, 898-908 (1998).</li>
<li>Naren, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+CFTR+chloride+channels+by+syntaxin+and+Munc18+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulation of CFTR chloride channels by syntaxin and Munc18 isoforms.</a> Nature. 390, 302-305 (1997).</li>
<li>Naren, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syntaxin+1A+is+expressed+in+airway+epithelial+cells%2C+where+it+modulates+CFTR+Cl%28-%29+currents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Syntaxin 1A is expressed in airway epithelial cells, where it modulates CFTR Cl(-) currents.</a> J. Clin. Invest. 105, 377-386 (2000).</li>
<li>Naren, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+macromolecular+complex+of+beta+2+adrenergic+receptor%2C+CFTR%2C+and+ezrin%2Fradixin%2Fmoesin-binding+phosphoprotein+50+is+regulated+by+PKA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">A macromolecular complex of beta 2 adrenergic receptor, CFTR, and ezrin/radixin/moesin-binding phosphoprotein 50 is regulated by PKA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 342-346 (1073).</li>
<li>Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysophosphatidic+acid+inhibits+cholera+toxin-induced+secretory+diarrhea+through+CFTR-dependent+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Lysophosphatidic acid inhibits cholera toxin-induced secretory diarrhea through CFTR-dependent protein interactions.</a> J. Exp. Med. 202, 975-986 (2005).</li>
<li>Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+coupling+of+cAMP+transporter+to+CFTR+chloride+channel+function+in+the+gut+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal coupling of cAMP transporter to CFTR chloride channel function in the gut epithelia.</a> Cell. 131, 940-951 (2007).</li>
<li>Li, C., Schuetz, J. D., Naren, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+carcinogen+NNK+transporter+MRP2+regulates+CFTR+function+in+lung+epithelia%3A+implications+for+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Tobacco carcinogen NNK transporter MRP2 regulates CFTR function in lung epithelia: implications for lung cancer.</a> Cancer Lett. 292, 246-253 (2010).</li>
<li>Hall, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+C-terminal+motif+found+in+the+beta2-adrenergic+receptor%2C+P2Y1+receptor+and+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+determines+binding+to+the+Na%2B%2FH%2B+exchanger+regulatory+factor+family+of+PDZ+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A C-terminal motif found in the beta2-adrenergic receptor, P2Y1 receptor and cystic fibrosis transmembrane conductance regulator determines binding to the Na+/H+ exchanger regulatory factor family of PDZ proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 8496-8501 (1998).</li>
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<li>Cheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Golgi-associated+PDZ+domain+protein+modulates+cystic+fibrosis+transmembrane+regulator+plasma+membrane+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A Golgi-associated PDZ domain protein modulates cystic fibrosis transmembrane regulator plasma membrane expression.</a> J. Biol. Chem. 277, 3520-3529 (1074).</li>
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<li>Li, C., Roy, K., Dandridge, K., Naren, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+assembly+of+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+in+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular assembly of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in plasma membrane.</a> The Journal of biological chemistry. 279, 24673-24684 (2004).</li>
<li>Li, C., Naren, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+CFTR+Interactome+in+the+Macromolecular+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Met.+Molecul.+Med%22%5BJournal%5D)">Analysis of CFTR Interactome in the Macromolecular Complexes.</a> Met. Molecul. Med. 741, 255-270 (2011).</li>
<li>Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemokine+receptor+CXCR2+macromolecular+complex+regulates+neutrophil+functions+in+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A chemokine receptor CXCR2 macromolecular complex regulates neutrophil functions in inflammatory diseases.</a> J. Biol. Chem. , (2011).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

En este protocolo, se demostró un método para ensamblar in vitro y la detección de un complejo macromolecular que contiene CFTR señalización utilizando proteínas purificadas (o fragmentos de proteínas) y / o lisados ​​de células como se informó anteriormente 16-19,29,30. Para lograr los mejores resultados los siguientes puntos críticos durante el proceso de preparación requieren una atención especial: <ul><li> Es importante que el pH del tampón de elución se ajustó a 8,0 después de la adición de ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> pGEX4T-1 vectores </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9545-49 </td><td> anteriormente Amersham Biosciences </td></tr><tr><td> pMAL-C2 vector </td><td> New England BioLabs </td><td></td><td></td></tr><tr><td> pET30 vector </td><td> Merck Chemicals </td><td> 69077-3 </td><td> antes Novagen </td></tr><tr><td> Glutatión agarosa </td><td> BD Biosciences </td><td> 554780 </td><td></td></tr><tr><td> La amilosa de resina </td><td> New England BioLabs </td><td> E8021S </td><td></td></tr><tr><td> Talon cuentas </td><td> Clontech </td><td> 635501 </td><td></td></tr><tr><td> glutatión reducido </td><td> BD Biosciences </td><td> 554782 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> imidazol </td><td> Pescador </td><td> BP305-50 </td><td></td></tr><tr><td> maltosa </td><td> Pescador </td><td> BP684-500 </td><td></td></tr><tr><td> S-proteína de agarosa </td><td> Merck Chemicals </td><td> 69704-3 </td><td> antes Novagen </td></tr><tr><td> Anti-Flag HRP </td><td> Sigma </td><td> A8592 </td><td></td></tr><tr><td> IgG anti-CFTR </td><td> Hechas a medida </td><td> R1104 </td><td> MAB reconociendo CFTR epítopo 722-734 de AA </td></tr><tr><td> Anti-IgG MRP2 </td><td> Chemicon International </td><td> MAB4148 </td><td> Ahora una parte de Millipore </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Reactivos específicos y equipos.

análisis in vitro de pdz-dependientes de complejos macromoleculares de señalización cftr

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

Transmembrana de la fibrosis quística regulador de la conductancia (CFTR), un canal de cloruro encuentra principalmente en la membrana apical de las células epiteliales, juega un papel fundamental en la homeostasis de los fluidos 1-3 transepitelial. CFTR se ha implicado en dos enfermedades importantes: la fibrosis quística (FQ) 4 y la diarrea secretora 5. En CF, la síntesis o la actividad funcional de la CFTR Cl-canal se reduce. Este trastorno afecta a aproximadamente 1 de cada 2,500 caucásicos en los Estados Unidos 6. La actividad del CFTR excesiva también ha sido implicado en casos de toxina inducida diarrea secretora (por ejemplo, por la toxina del cólera y estable al calor enterotoxina de E. coli) que estimula la producción de AMPc o GMPc en el intestino 7. La acumulación de pruebas sugieren la existencia de interacciones físicas y funcionales entre CFTR y un número creciente de otras proteínas, incluyendo transportadores, canales iónicos, receptores, quinasas, fosfatasas, la señalIng. moléculas, y los elementos del citoesqueleto, y estas interacciones entre CFTR y sus proteínas de unión se ha demostrado que ser críticamente involucrada en la regulación mediada por CFTR transporte iónico transepitelial in vitro y también in vivo 8-19. En este protocolo, nos centraremos únicamente en los métodos que ayudan en el estudio de las interacciones entre la cola CFTR carboxilo terminal, que posee un motivo de unión a proteínas [conocido como PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ) motivo], y un grupo de proteínas de andamiaje, que contienen un módulo de unión específica a que se refiere a dominios PDZ. Hasta ahora, varios diferentes PDZ proteínas de andamiaje se ha informado que se unen a la cola carboxilo terminal de CFTR con afinidades diferentes, tales como, las NHERF1 NHERF2, los PDZK1, los PDZK2, Cal (CFTR asociada a ligando), Shank2, y GRASP 20-27. El motivo PDZ en CFTR que es reconocido por PDZ proteínas de andamiaje son los últimos cuatro aminoácidos en el terminal C (es decir, 1477-DTRL-1480 en el ser humano CFTR) 20. Curiosamente,CFTR puede obligar a más de un dominio PDZ de ambos NHERFs y PDZK1, aunque con distintas afinidades 22. Esta multivalencia con respecto a CFTR unión ha demostrado ser de importancia funcional, lo que sugiere que las proteínas PDZ andamio puede facilitar la formación de complejos macromoleculares CFTR señalización para la señalización específicos / selectiva y eficiente en las células 16-18. Múltiples ensayos bioquímicos se han desarrollado para estudiar CFTR que implica interacciones de proteínas, como la co-inmunoprecipitación, ensayo de pull-down, por pares ensayo de unión, colorimétrico pares ensayo de unión, y el ensayo de ensamblaje complejo macromolecular 16-19,28,29 . Aquí nos centramos en las particularidades del procedimiento de montaje de un PDZ motivo dependiente de CFTR que contiene complejo macromolecular in vitro, que se utiliza ampliamente en nuestro laboratorio para estudiar proteína-proteína o de dominio de dominio-interacciones que implican CFTR 16-19,28,29.

Transmembrana de la fibrosis quística regulador de la conductancia (CFTR), un canal de cloro del epitelio, se ha informado de interactuar con varias proteínas y regular procesos celulares importantes, entre ellos los CFTR PDZ mediadas por motivo de las interacciones han sido bien documentados. Este protocolo describe los métodos que hemos desarrollado para montar un macromolecular CFTR PDZ-dependiente de señalización complejos<em&gt; In vitro</em&gt;.

Análisis in vitro de PDZ-dependientes de complejos macromoleculares de señalización CFTR

El regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR), un canal de cloruro localizado principalmente en las membranas apicales de las células epiteliales, desempeña un...

El objetivo general de este procedimiento es ensamblar un complejo macromolecular de señalización dependiente de PDZ del regulador de conductancia transmembranal de la fibrosis quística, o CFTR. Para lograrlo in vitro, se expresan proteínas de fusión recombinantes con etiquetas en bacterias y se purifican. A continuación, se obtienen lisados celulares a partir de cultivos que expresan CFTR o proteínas que se unen a CFTR.Luego, el CFTR y las proteínas de unión se combinan in vitro para ensamblar el complejo macromolecular de señalización que contiene CFTR. A continuación, se realiza un inmunotransferencia, que demuestra la formación de complejos macromoleculares de CFTR y luego se evalúa mediante inmunotransferencia. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes es que podemos detectar y visualizar directamente la formación de un complejo macromolecular individual de alta proteína que contiene CFTR.Por lo tanto, este método puede proporcionar información sobre la formación del complejo macromolecular que contiene CT R. También puede aplicarse en el ensamblaje de complejos no proteicos que no involucran CFTR, como el complejo de señalización macromolecular sexo

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Research

Investigación

JoVE Journal

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Biología

La célula permeable reticulante DSP [ditiobis (propionato de succinimidilo)] estabiliza interacciones transitoria e...

El aislamiento de lábil Multi-complejos de proteínas por In vivo Control Celular entrecruzamiento y Inmuno-cromatografía de afinidad magnética

Para probar la interacción de una proteína con su objetivo de lípidos se utilizó MACS y anexina V conjugada con partículas magnéticas y de las vesículas de lípidos sintetizados a partir de los lípidos de destino y fosfatidilserina anexina V vinculante. Proteínas unidas a los lípidos de destino se co-purificados y analizados después de la elución de las cuentas.

Lípidos vesículas mediada por cromatografía de afinidad utilizando magnética clasificación de células activadas (LIMACS): un nuevo método para analizar la interacción de proteínas y lípidos

Un procedimiento eficaz para evaluar la propensión de oligomerización dominios transmembrana de un solo paso (TTM) se describe. Proteínas quiméricas que consiste en la DTM fundido a toxR se expresan en una cepa de E. coli reportero. TMD inducida por oligomerización causas dimerización de toxR, activación de la transcripción y la producción de la proteína reportera,-galactosidasa.

Dominio transmembrana Oligomerización propensión determinada por el ensayo toxR

Análisis citométrico de flujo de Complementación fluorescencia bimolecular proporciona un método cuantitativo de alto rendimiento para estudiar la interacción proteína-proteína. Esta metodología se puede aplicar a los sitios de unión de proteínas y de mapeo para los factores que regulan la interacción proteína-proteína de cribado.

El análisis por citometría de Complementación fluorescencia Bimolecular: A High Throughput Método cuantitativo para estudiar la interacción proteína-proteína

La expresión heteróloga y purificación del regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) son retos importantes y los factores limitantes en el desarrollo de terapias con medicamentos para la fibrosis quística. Este protocolo describe dos métodos para el aislamiento de cantidades de miligramos de CFTR adecuados para los estudios funcionales y estructurales.

La purificación de la fibrosis quística regulador de conductancia transmembrana de proteínas expresadas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Descrito aquí es un procedimiento rápido y eficaz para la reconstitución funcional de tipo silvestre purificado y proteína CFTR mutante que conserva la actividad de este canal de cloro, que es defectuoso en la fibrosis quística. Flujo de salida de yoduro de proteoliposomas reconstituidas mediadas por CFTR permite estudios de actividad de los canales y los efectos de las moléculas pequeñas.

Reconstitución funcional y la actividad del canal Las mediciones de Purificada Wildtype y mutante CFTR Proteína

Aquí presentamos un protocolo para supervisar el montaje y desmontaje de la toxina del ántrax mediante interferometría de la biocapa (BLI). Tras el montaje y desmontaje en la superficie del biosensor, los complejos de proteínas grandes son liberados de la superficie para la visualización e identificación de componentes de los complejos usando microscopia electrónica y espectrometría de masas, respectivamente.

Análisis complejos de la proteína dinámica montan en y de interferometría de biocapa Biosensor usando espectrometría de masas y microscopia electrónica

Proporcionamos un protocolo para in vitro ensayos de autoorganización de la mente y la mía en una bicapa lipídica apoyado en una cámara abierta. Además, se describe cómo adjuntar el ensayo en lípido-clad PDMS microcompartments imitar en vivo condiciones de confinamiento de la reacción.

In Vitro Reconstitución de la uno mismo-organización de patrones de proteínas en bicapas lipídicas soportadas

Este protocolo describe las técnicas utilizadas para determinar las estructuras de canal de iones por microscopia del cryo-electrón, incluyendo un sistema de baculovirus para expresar eficientemente genes en células de mamíferos con el mínimo esfuerzo y toxicidad, extracción de proteínas, purificación, y comprobación de la calidad, preparación de la red muestra y proyección, así como recopilación de datos y procesamiento.

Expresión y purificación de los humanos sensibles a lípido catiónico canal TRPC3 para la determinación estructural por microscopia del Cryo-electrón de solo-partícula

Aquí se describe un protocolo para un método de Pulso-persiga general que permite el análisis de la cinético de plegamiento, transporte y degradación de proteínas en células vivas.

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Este protocolo presenta un método para medir la unión de nucleótidos de adenina a los receptores en tiempo real en un entorno celular. La unión se mide como transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) entre derivados de nucleótidos de trinitrofenilo y proteínas marcadas con un aminoácido fluorescente no canónico.

Medición de la unión de nucleótidos a proteínas de membrana intactas y funcionales en tiempo real

Aprende a ensamblar complejos macromoleculares de señalización CFTR dependientes de PDZ in vitro mediante expresión de proteínas recombinantes en bacterias y western blot. Este método permite visualizar directamente las interacciones proteicas.

Análisis in vitro de PDZ-dependientes de complejos macromoleculares de señalización CFTR

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