Análisis in vitro de PDZ-dependientes de complejos macromoleculares de señalización CFTR

El objetivo general de este procedimiento es ensamblar un complejo macromolecular de señalización dependiente de PDZ del regulador de conductancia transmembranal de la fibrosis quística, o CFTR. Para lograrlo in vitro, se expresan proteínas de fusión recombinantes con etiquetas en bacterias y se purifican. A continuación, se obtienen lisados celulares a partir de cultivos que expresan CFTR o proteínas que se unen a CFTR.

Luego, el CFTR y las proteínas de unión se combinan in vitro para ensamblar el complejo macromolecular de señalización que contiene CFTR. A continuación, se realiza un inmunotransferencia, que demuestra la formación de complejos macromoleculares de CFTR y luego se evalúa mediante inmunotransferencia. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes es que podemos detectar y visualizar directamente la formación de un complejo macromolecular individual de alta proteína que contiene CFTR.

Por lo tanto, este método puede proporcionar información sobre la formación del complejo macromolecular que contiene CT R. También puede aplicarse en el ensamblaje de complejos no proteicos que no involucran CFTR, como el complejo de señalización macromolecular sexo C dos. Más recientemente, utilizando este mismo método, hemos demostrado que nuestro quimiorreceptor CXCR dos forma físicamente un complejo proteico con el efector descendente.

PRC beta tres median el nervio salvaje uno en neutrófilos utilizando PCR. Amplifique el ADN que codifica los últimos 50 a 100 aminoácidos que contienen los motivos PDZ en el extremo C. Para el transportador CAMP, MRP cuatro y el dominio PDZ uno del factor regulador del intercambiador de sodio-hidrógeno o N-H-E-R-F.

A continuación, clone los cuatro productos de PCR RP en PGE X cuatro T uno para generar proteínas de fusión GST y el dominio PDZ uno de N-H-E-R-F en PET 30. Para generar proteínas de fusión hiss s, transforme las bacterias mediante choque térmico. En medio SOC, en una cepa de e coli deficiente en proteasas, cultive la muestra durante la noche a 37 grados Celsius en un incubador con agitación en 50 mililitros de medio LB que contenga los antibióticos adecuados para el vector.

Al día siguiente, diluya el cultivo uno a 10 en 500 mililitros de medio Luria Bertani. Luego incube el cultivo nuevamente con agitación a 37 grados Celsius durante dos horas. Induzca la transcripción de la proteína recombinante con 0,5 a 1 milimolar de IPTG durante cuatro horas a 30 grados Celsius.

Tras la incubación, transfiera los cultivos a tubos de centrífuga de 250 mililitros y haga un pellet de las células mediante centrifugación a 8.000 ×g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. Tras la centrifugación, deseche el sobrenadante y añada 20 mililitros de tampón de sacarosa que contenga lisozima. Añada un miligramo por mililitro de 0,2 % Triton X-100 y los inhibidores de proteasas para lisar las células, y transfiera la suspensión bacteriana a un tubo de centrífuga de 50 mililitros limpio.

Mezcle en un agitador rotatorio durante 30 minutos a cuatro grados Celsius. Luego, centrifugue a 20.000 ×g durante 30 minutos a cuatro grados Celsius. Después de la centrifugación, el sobrenadante estará claro y habrá un pellet insoluble de app en el fondo del tubo.

Recoger el sobrenadante claro en un nuevo tubo cónico de 50 mililitros. Luego, al sobrenadante, añadir un mililitro de la resina adecuada. Perlas aero suspendidas como una suspensión al 50 % en tampón de sacarosa glutatión.

Las perlas aero deben usarse para proteínas de fusión GST y las perlas talon para proteínas de fusión hiss S. Incubar durante cuatro horas a cuatro grados Celsius en un agitador rotatorio. Luego, centrifugar las perlas a 800 ×g durante dos minutos.

Luego, lávelos mediante resuspensión, suspendiéndolos en 15 mililitros de PBS y mézclelos en un rotador durante dos minutos. Finalmente, deseche el sobrenadante. Repita el paso seis veces más después del sexto lavado.

Para eluir la proteína de las perlas, agregue dos mililitros del tampón de elución apropiado por cada mililitro de perlas y mezcle durante 10 minutos a temperatura ambiente. Vierta toda la proteína eluida con las perlas en una columna y recoja el flujo que atraviesa como proteína eluida. A continuación, transfiera la proteína UD a un tubo de diálisis.

Dialice las proteínas eluidas frente a dos litros de PBS mientras agita a cuatro grados Celsius. Cambie el PBS cada cuatro horas durante cuatro veces tras la diálisis. Concentre la proteína hasta 0,5 a un mililitro.

Usando un filtro centrífugo con un corte de 10,000 megavatios. Aliquotar la muestra en 200 microlitros cada una. Guardar una para análisis y colocar las demás a menos 80 grados Celsius para almacenamiento.

Determine la concentración de proteína mediante el método de Bradford. Evalúe la calidad de la proteína mediante electroforesis SDS-PAGE utilizando los estándares de BSAS. Si la integridad de la proteína no es satisfactoria, se pueden emplear procedimientos de purificación secundaria como filtración en gel o intercambio iónico.

Las células HEK 293 que expresan CFTR con marca flag de tipo silvestre deben cultivarse según se describe en el documento adjunto. Retire el medio de las células y lávese con PBS. A continuación, para lisar las células, agregue 500 microlitros de tampón de lisis por cada placa de cultivo de 60 milímetros y agite suavemente los lisados celulares durante 20 minutos a cuatro grados Celsius.

Transfiera los lisados a nuevos tubos de microcentrífuga. Luego, para eliminar las proteínas insolubles, centrifugue a 16.000 ×g durante 15 minutos a cuatro grados Celsius y recoja los sobrenadantes. Determine la concentración de proteína mediante el ensayo de Bradford para ensamblar in vitro los complejos macromoleculares que contienen CFTR.

Comience combinando 20 microgramos de la proteína de fusión purificada G-S-T-M-R-P cuatro de los 50 aminoácidos carboxi-terminales y cantidades crecientes que van desde cero hasta 40 microgramos de la proteína de fusión purificada hiss S PD zk uno en 200 microlitros de tampón de lisis y en un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros. Mezcle las dos proteínas en un mezclador rotatorio a 22 grados Celsius durante una a dos horas. A continuación, agregue 20 microlitros de una suspensión al 50 % de perlas de glutatión a la mezcla de proteínas y continúe mezclando durante otra hora.

Este paso también se conoce como unión por pares, en el cual G-S-T-M-R-P cuatro CT 50 se une a SPD zk uno. Durante este tiempo, prepare los lisados de células HEK 293 que sobreexpresan CFTR con marcaje flag de tipo silvestre, como se describió en la sección anterior del video, tras el paso de unión por pares. Lave el complejo dos veces con tampón de lisis span a 800 veces G durante un minuto por cada lavado y aspire cuidadosamente el sobrenadante tras cada lavado.

Tenga cuidado de no aspirar las perlas del fondo. Añada los lisados de células HT K 2 93 a las perlas y mezcle suavemente en un mezclador rotatorio a cuatro grados Celsius durante tres horas o durante la noche tras la incubación. Lave las perlas tres veces con tampón de lisis, centrifugando después de cada lavado como antes, tras el último lavado.

Para eluir las proteínas, agregue 30 microlitros de tampón de muestra cinco x e incube en un baño de agua a 37 grados Celsius durante 10 a 15 minutos. Luego, centrifugue a 5.000 × g durante un minuto para precipitar las perlas. A continuación, cargue todo el eluato en un gel SDS-PAGE del 4 al 15 % y corra a 200 voltios hasta el final del gel. Posteriormente, transfiera las bandas de proteína a una membrana de PVDF durante 1,5 horas a 60 voltios en un equipo de transferencia BioRad.

Una vez finalizada la transferencia, bloquee la membrana en TBS tween que contenga leche descremada al 5 % durante una hora. Continúe con el análisis por inmunotransferencia tal como se describe en el documento adjunto para visualizar las proteínas que interactúan con CFTR. El complejo macromolecular de señalización que contiene A-C-F-T-R se ensambló in vitro según lo descrito en este video, como se muestra en esta representación pictórica.

Un complejo macromolecular formado entre los 50 aminoácidos terminales C de Mr.RRP cuatro PD zk uno y CFTR completo para determinar la dependencia de dosis en la formación del complejo macromolecular. Se incluyeron cantidades crecientes de la proteína intermedia PD ZK uno, como se muestra aquí. El complejo aumentó de manera dependiente de la dosis, lo que sugiere que la proteína intermedia PD ZK uno medió la interacción entre CCF TR y Mr.Rrp cuatro.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar no hervir las muestras del complejo de micro moléculas del FTR preparadas para el inmunotransferencia, ya que la agregación del FTR es un problema común. En su lugar, las muestras deben calentarse a 37 grados durante 10 a 15 minutos antes de cargarlas en el gel siguiendo este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como la precipitación conjunta, para evaluar los complejos endógenos de CFTR en células como las células de las vías respiratorias, células epiteliales y células epiteliales intestinales.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo ensamblar in vitro un complejo de señalización macromolecular dependiente de PTC CFDR.