C. elegans Seguimiento y Medición del Comportamiento

Fenotipificación. La locomoción de Caenorhabditis elegans es una herramienta importante para el descubrimiento de genes y neuronas implicados en el comportamiento de Caenorhabditis elegans. Caenorhabditis elegans realiza comportamientos locomotores estereotipados, como movimientos hacia adelante y hacia atrás, y diversos tipos de giros, al cambiar su forma. Para cuantificar estos movimientos a largas distancias y con alta resolución espacial y temporal, hemos desarrollado un sistema de seguimiento de nematodos para capturar el movimiento de Caenorhabditis elegans mientras se desplaza sobre la superficie de una placa de agar.

También hemos desarrollado software para aislar y analizar cuantitativamente estos movimientos mediante programas personalizados escritos en LabVIEW y MATLAB. Un desafío de todos los sistemas de seguimiento por video es que generan una cantidad enorme de datos altamente dimensionales. Nuestro programa de procesamiento de imágenes y análisis de datos aborda este desafío reduciendo las formas del gusano a un conjunto de componentes independientes, habiendo reconstruido exhaustivamente el comportamiento del gusano como una función de solo tres a cuatro dimensiones.

Una placa de agar se ilumina mediante una fuente de luz de fibra y se captura con una cámara. Este sistema está montado en una plataforma de traslación XY. La plataforma se mueve mediante motores paso a paso estándar, que están conectados a un controlador de motor paso a paso.

El controlador y la cámara están conectados al ordenador y son controlados por programas personalizados escritos en LabVIEW. La cámara capta la superficie de una placa de agar e identifica objetos oscuros sobre un fondo claro. Una marca de calibración para el proceso de calibración automática se realiza pinchando la superficie del agar.

Con un punzón para gusanos, se ajusta la calidad de la imagen para que el programa informático pueda cuantificar objetos en tiempo real. Se pueden ajustar la ganancia, el brillo y la velocidad de obturación de la cámara para obtener un objeto oscuro sobre un fondo blanco. Se puede verificar la imagen binaria filtrada, que es utilizada por el programa de seguimiento.

El software tiene una función de calibración automática que calcula la matriz de calibración al mover un objeto de prueba una distancia fija. La distancia en píxeles se calibra según los pasos realizados por el motor paso a paso mediante la matriz de calibración.

Después de la calibración, el sistema está listo para usarse y no necesita ser recalibrado a menos que se cambie la magnificación o se reposicione la cámara. Se utilizará un anillo de cobre para contener los gusanos y evitar que migren hacia el borde de la placa. Caliente primero el anillo colocándolo sobre un bloque calefactor o equivalente.

El anillo debe calentarse durante aproximadamente un minuto. Coloque el anillo sobre una placa de agar fresca y presiónelo ligeramente para incrustarlo en la superficie del agar. Y se utilizará una placa de agar con tampón NGM para lavar los residuos de alimento de los gusanos en estadio L4 y adultos jóvenes.

Después de colocar los gusanos en el tampón NGM, déjelos nadar durante unos minutos. Coloque cuidadosamente uno de los gusanos lavados sobre la placa de seguimiento cerca del centro del anillo. Esta placa se utilizará posteriormente para el rastreador de gusanos.

Coloque la placa preparada sobre la plataforma del rastreador de gusanos. Ejecute el programa de lab view y seleccione las opciones necesarias, como la ubicación de las imágenes, los tipos de imágenes, las mediciones y la configuración de la cámara. Utilizando la palanca de control, mueva el microscopio hasta que una imagen del gusano aparezca en el campo de visión de la pantalla del ordenador.

Luego presione seguimiento para activar el programa de rastreo. Aquí mostramos un gusano rastreado en tiempo real. El programa informático mide los movimientos de imágenes filtradas binarias como se muestra y puede realizar mediciones de esta imagen en tiempo real.

Después de rastrear, se puede realizar una reconstrucción de la trayectoria global a partir de los movimientos del motor paso a paso, mientras que los cambios locales de la forma del gusano pueden observarse en detalle. Los gusanos se desplazan realizando movimientos ondulatorios. Capturamos estos movimientos mediante la esqueletización del gusano en una única curva central, y luego describimos esta curva como un conjunto de ángulos.

Luego descomponemos los esqueletos en sus formas fundamentales, también conocidas como vectores propios. Con estos modos propios, podemos reconstruir las formas del gusano y cuantificar sus movimientos. Utilizando los dos primeros modos, podemos capturar específicamente la posición de fase del ciclo ondulatorio del gusano, como se observa en el segundo panel.

El primer panel muestra la distribución conjunta de los modos uno y dos, destacando un ciclo límite circular. El movimiento de fase en una dirección corresponde al movimiento hacia adelante, y el movimiento de fase en la otra dirección corresponde al movimiento hacia atrás. Por lo tanto, la velocidad de fase corresponde a la velocidad del gusano.

En el espacio real, la fuerte correlación entre la fase y la velocidad del mundo real se puede observar en el último panel. Utilizando la velocidad de fase derivada del modo propio, podemos descubrir algunos detalles sutiles del comportamiento de la elegancia marina que pasarían desapercibidos al ojo humano. Por ejemplo, la distribución conjunta de la velocidad de fase y la fase indica claramente que los gusanos abandonan y entran al estado de avance preferentemente en fases específicas del movimiento.

Aquí hemos demostrado un sistema de seguimiento fácil de usar que registra imágenes detalladas del comportamiento de los silicónidos mientras se desplazan sobre la superficie y las placas de ACA. La cantidad de información contenida en estas imágenes es vasta y altamente dimensional, por lo que también hemos creado un método para reducir la dimensionalidad de los datos en cuatro medidas fundamentales. Estas medidas son fáciles de interpretar con respecto al comportamiento del gusano.

Este trabajo se genera para medir los comportamientos de los gusanos con modificaciones menores, y el sistema también puede utilizarse para medir la actividad neuronal mediante regiones genéticamente codificadas. El sistema en su conjunto tiene un diseño flexible y puede usarse con otros sistemas de desplazamiento, como Doof law, LOEs.