Name: C. elegans Seguimiento y Medición del Comportamiento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: Aprende a rastrear el comportamiento de C. elegans con un microscopio de alta velocidad y software de análisis. Este método reduce la dimensionalidad de datos complejos para estudiar locomoción y funciones neuronales.

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1. Descripción de Microscopio de seguimiento <ol><li> Una placa de agar es iluminado por una fuente de luz de fibra y con imágenes de una cámara. Este sistema está montado en una X, Y etapa de traducción. </li><li> La etapa se desplaza por estándar de motores paso a paso, que están conectados a un controlador de motor paso a paso. </li><li> El controlador y la cámara están conectados al ordenador y controlados por programas personalizados escritos en LabVIEW. </li><li> La cámara de las imágenes de la superficie de una placa de agar e identifica objetos oscuros sobre un fondo claro. </li><li> La calidad de la imagen se ajusta de modo que el programa de ordenador puede cuantificar objetos en tiempo real. La ganancia, el brillo y la velocidad del obturador de la cámara se puede ajustar para proporcionar un objeto oscuro sobre un fondo blanco. </li><li> Una marca de calibración para la calibración automática se realiza por meter la superficie de agar con un pico gusano. </li><li> La imagen filtrada, binario que es utilizado por el programa de seguimiento puede ser comprobado. </li><li> El modoftware tiene una función de auto-calibración que calcula la matriz de calibración moviendo un objeto de prueba a una distancia fija. </li><li> Las distancias en píxeles está calibrado a los pasos dados por el motor paso a paso por la matriz de calibración. </li><li> Después de la calibración, el sistema está listo para funcionar y no es necesario volver a calibrar a menos que el aumento se cambia o si la cámara está reposicionado. </li></ol> 2. Preparación de las placas de Seguimiento y C. elegans para el rastreo <ol><li> Un anillo de cobre se usa para acorralar los gusanos y evitar que la migración hasta el borde de la placa. El cobre proporciona una barrera química local, y no afecta el movimiento del gusano de otro modo para la duración del experimento (&lt;1 h). Calentar el anillo primero colocándolo en un bloque de calor o equivalente. </li><li> Colocar el anillo sobre una placa de agar fresco (1,7% de agar Bacto, 0,25% de Bacto-peptona, 0,3% de NaCl, 1 mM CaCl 2, 1 mM MgSO 4, 25 mM de tampón de fosfato de potasio, 5 g / mlcolesterol) y presione ligeramente para incrustarlo en la superficie del agar. </li><li> Elige L4 etapa o gusanos adultos jóvenes en una placa de agar lleno de algún buffer de NGM (0,3% NaCl, 1 mM CaCl 2, 1 mM MgSO 4, 25 mM tampón fosfato de potasio) para lavarlos de residuos de comida. Deje que los gusanos nadar durante unos minutos. </li><li> Cuidadosamente coloque un solo gusano sobre la placa de seguimiento de cerca del centro del anillo. Y a continuación, coloque la placa sobre el seguimiento de gusano. </li></ol> 3. Gusano de seguimiento <ol><li> Ejecute el programa LabVIEW y seleccione las opciones si es necesario (la ubicación de las imágenes, los tipos de imágenes, mediciones, ajustes de la cámara). </li><li> Uso de la palanca de mando mover el microscopio hasta que una imagen de el gusano está en el campo de visión (pantalla de ordenador). Pulse el botón &quot;pista&quot; para activar el programa de seguimiento. </li><li> El programa de ordenador en realidad mide los movimientos de un imágenes binarias filtradas tal como se muestra y puede hacer mediciones en esta imagen en tiempo real </li><li> En popaer el seguimiento de una reconstrucción de la trayectoria global puede hacerse a partir de los movimientos de motor paso a paso, mientras que los cambios en la forma locales del gusano se puede ver en detalle. </li></ol> 4. Análisis de Datos <ol><li> Ejecutar script skeletonizing (MATLAB) para parametrizar las formas del gusano. (Figura 2) </li><li> Cálculo de los modos propios de los datos esqueletizados. (Figura 3,4) </li><li> Mostrar la Figura 5. Lea leyenda de la figura o resultados representativos. </li></ol>

<ol><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-79 (1974).</li>
<li>de Bono, M., Maricq, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+substrates+of+complex+behaviors+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal substrates of complex behaviors in C. elegans.</a> Annu. Rev. Neurosci. (28), 451-501 (2005).</li>
<li>Pierce-Shimomura, J. T., Morse, T. M., Lockery, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fundamental+role+of+pirouettes+in+Caenorhabditis+elegans+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The fundamental role of pirouettes in Caenorhabditis elegans chemotaxis.</a> J. Neurosci. 19 (21), 9557-9569 (1999).</li>
<li>Gray, J. M., Hill, J. J., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+circuit+for+navigation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A circuit for navigation in Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (9), 3184-3191 (2005).</li>
<li>Baek, J. H., Cosman, P., Feng, Z., Silver, J., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+machine+vision+to+analyze+and+classify+Caenorhabditis+elegans+behavioral+phenotypes+quantitatively%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Using machine vision to analyze and classify Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes quantitatively.</a> J. Neurosci. Methods. 118 (1), 9-21 (2002).</li>
<li>Stephens, G. J., Johnson-Kerner, B., Bialek, W., Ryu, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimensionality+and+Dynamics+in+the+Behavior+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dimensionality and Dynamics in the Behavior of C. elegans.</a> PLoS Comput. Biol. 4 (1), e1000028(2008).</li>
<li>Stephens, G. J., Johnson-Kerner, B., Bialek, W., Ryu, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+modes+to+movement+in+the+behavior+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">From modes to movement in the behavior of C. elegans.</a> PLoS One. 5 (11), e13914(2010).</li>
<li>Feng, Z., Cronin, C. J., Wittig, J. H. Jr, Sternberg, P. W., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+imaging+system+for+standardized+quantitative+analysis+of+C.+elegans+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">An imaging system for standardized quantitative analysis of C. elegans behavior.</a> BMC Bioinformatics. (5), 115(2004).</li>
<li>Ramot, D., Johnson, B. E., Berry, T. L. Jr, Carnell, L., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Parallel+Worm+Tracker%3A+A+Platform+for+Measuring+Average+Speed+and+Drug-Induced+Paralysis+in+Nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The Parallel Worm Tracker: A Platform for Measuring Average Speed and Drug-Induced Paralysis in Nematodes.</a> PLoS One. 3 (5), e2208(2008).</li>
<li>Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+behavioral+analysis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput behavioral analysis in C. elegans.</a> Nat. Methods. 8 (7), 592-598 (2011).</li>
<li>Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+manipulation+of+neural+activity+in+freely+moving+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans.</a> Nat. Methods. 8 (2), 147-152 (2011).</li>
<li>Stirman, J. N., Crane, M. M., Husson, S. J., Wabnig, S., Schultheis, C., Gottschalk, A., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+multimodal+optical+control+of+neurons+and+muscles+in+freely+behaving+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time multimodal optical control of neurons and muscles in freely behaving Caenorhabditis elegans.</a> Nat. Methods. 8 (2), 153-158 (2011).</li>
<li>Ben Arous, J., Tanizawa, Y., Rabinowitch, I., Chatenay, D., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+imaging+of+neuronal+activity+in+freely+behaving+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated imaging of neuronal activity in freely behaving Caenorhabditis elegans.</a> J Neurosci Methods. 187 (2), 229-234 (2010).</li>
<li>Wittenburg, N., Baumeister, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+avoidance+in+Caenorhabditis+elegans%3A+an+approach+to+the+study+of+nociception%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Thermal avoidance in Caenorhabditis elegans: an approach to the study of nociception.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (18), 10477-10482 (1999).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El estudio de la locomoción y el comportamiento natural requiere técnicas no invasivas de seguimiento en pareja con las técnicas de reducción de datos. Aquí hemos demostrado un fácil utilizar el sistema de rastreo que registra imágenes detalladas de C. elegans comportamiento, ya que se arrastra sobre la superficie de una placa de agar. La cantidad de información contenida en estas imágenes es muy amplio y alto-dimensional, por lo que también han desarrollado métodos para reducir la dimensionalidad de los datos ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre de la parte </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> CCD cámara </td><td> Basler </td><td> A601f </td><td></td></tr><tr><td> Lente </td><td> Edmund Optics </td><td> MMS serie </td><td></td></tr><tr><td> Fibra de iluminación </td><td> Dolan Jenner </td><td> DC-950H </td><td></td></tr><tr><td> Traducción etapa </td><td> Deltron </td><td> LS3-4 </td><td></td></tr><tr><td> Motor paso a paso </td><td> EE.UU. digitales </td><td> MS23C </td><td></td></tr><tr><td> Stepper motor de accionamiento </td><td> Geco </td><td> G201 </td><td></td></tr><tr><td> Control de motor paso a paso </td><td> SimpleStep </td><td> SSXYZ </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Todo el código de programación está disponible. Por favor, envíe un correo electrónico a petición del autor correspondiente. </td></tr></tbody></table>

c. elegans seguimiento y medición del comportamiento

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

Hemos desarrollado técnicas de instrumentación, procesamiento de imágenes, y los datos de análisis para cuantificar el comportamiento locomotor de C. elegans como se arrastra sobre la superficie de una placa de agar. Para el estudio de la base genética, bioquímica, y neuronal de la conducta, C. elegans es un organismo ideal, ya que es genéticamente tratable, susceptible de microscopía, y muestra una serie de comportamientos complejos, incluidos los taxis, el aprendizaje y la interacción social 1,2. El análisis del comportamiento basado en el seguimiento de los movimientos de los gusanos que se arrastran sobre placas de agar han sido particularmente útiles en el estudio del comportamiento sensorial 3, 4 locomoción, y fenotipificación generales mutacional 5. Nuestro sistema funciona moviendo el sistema de cámara e iluminación como los gusanos se arrastra en una placa de agar estacionaria, que asegura que no se estímulo mecánico se transmite al gusano. Nuestro sistema de seguimiento es fácil de usar e incluye una función de calibración semi-automática. Un challenge de todos los sistemas de vídeo de seguimiento es que genera una enorme cantidad de datos que es intrínsecamente alta dimensional. Nuestro procesamiento de imágenes y programas de análisis de datos de resolver este problema mediante la reducción de la forma de gusanos en un conjunto de componentes independientes, que comprensiblemente reconstruir el comportamiento gusanos como una función de solamente dimensiones 3-4 6,7. Como un ejemplo del proceso se muestra que el gusano entra y sale de su estado de revocación de una manera específica de fase.

Ejemplo: Al forrajear, C. elegans transiciones de marcha adelante a marcha atrás, a menudo realizando una reorientación (giro omega) antes de volver al estado de movimiento hacia adelante. La cuantificación de esta transición es importante para entender los patrones de alimentación de los movimientos y también en el control motor del gusano. El poder para revelar los detalles sutiles de comportamiento locomoción puede ser visto usando nuestro dispositivo rastreador. Como ejemplo, po...

Hemos desarrollado un sistema de seguimiento de vídeo de tasa microscopio que puede registrar y cuantificar<em&gt; C. elegans</em&gt; Comportamiento a alta resolución y alta velocidad. También se han desarrollado métodos computacionales para reducir la dimensionalidad de las imágenes de gusano a un conjunto fundamental de mediciones que describen completamente la forma del gusano.

C. elegans Seguimiento y Medición del Comportamiento

Hemos desarrollado instrumentación, procesamiento de imágenes y técnicas de análisis de datos para cuantificar el comportamiento locomotor de C. elegans mientras se desplaza sobre el...

Fenotipificación. La locomoción de Caenorhabditis elegans es una herramienta importante para el descubrimiento de genes y neuronas implicados en el comportamiento de Caenorhabditis elegans. Caenorhabditis elegans realiza comportamientos locomotores estereotipados, como movimientos hacia adelante y hacia atrás, y diversos tipos de giros, al cambiar su forma. Para cuantificar estos movimientos a largas distancias y con alta resolución espacial y temporal, hemos desarrollado un sistema de seguimiento de nematodos para capturar el movimiento de Caenorhabditis elegans mientras se desplaza sobre la superficie de una placa de agar.También hemos desarrollado software para aislar y analizar cuantitativamente estos movimientos mediante programas personalizados escritos en LabVIEW y MATLAB. Un desafío de todos los sistemas de seguimiento por video es que generan una cantidad enorme de datos altamente dimensionales. Nuestro programa de procesamiento de imágenes y análisis de datos aborda este desafío reduciendo las formas del gusano a un conjunto de componentes independientes, habiendo reconstruido exhaustivamente el comportamiento del gusano como una función de solo tres a cuatro dimensiones.

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Investigación

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Neurociencia

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Este video describe el uso de software de video y seguimiento para registrar el movimiento de los gusanos en una arena. El protocolo de ejemplo mide el efecto de la exposición al etanol en la locomoción de los gusanos.

C. elegans Seguimiento del movimiento: un método para evaluar la locomoción en gusanos

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Evaluación de la discapacidad motora en modelos de C. elegans mediante el ensayo de locomoción radial

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C. elegans es un modelo útil para estudiar los efectos del etanol en el comportamiento. Presentamos un ensayo de comportamiento que cuantifica los efectos del etanol en la velocidad de locomoción de los gusanos rastreros; tanto la sensibilidad inicial como el desarrollo de tolerancia funcional aguda al etanol pueden medirse con este ensayo.

Un ensayo para medir los efectos del etanol sobre la velocidad de locomoción<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Aquí se muestra cómo rastrear y cuantificar los procesos de desarrollo en C. elegans. Los métodos presentados se basan en herramientas de código abierto que se pueden implementar fácilmente. Se demuestra cómo reconstruir modelos 3D de forma de células, cómo rastrear manualmente las estructuras subcelulares y cómo analizar el flujo contráctil cortical.

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