Aislamiento de ratón Islet Langerhans utilizando una combinación de colagenasa purificada y proteasa neutra
7 de septiembre de 2012
Una descripción detallada de ratón aislamiento de islotes se describe utilizando la técnica de canulación en pancreático ductal in situ y la perfusión de una combinación de colagenasa purificada y proteasa neutra.
El objetivo general de este procedimiento es aislar con éxito los ojales del páncreas de un ratón. Esto se logra aislando primero el páncreas del tejido circundante. A continuación, se canulada el conducto biliar para que el páncreas pueda inflarse con la mezcla de colagenasa proteasa.
Una vez inflado, se retira el páncreas y se disocian cuidadosamente los ojales. Finalmente, los ojales aislados se filtran y se chapan para su uso futuro. En última instancia, este método de aislamiento de ojales con colagenasa purificada y proteasa neutra se utiliza para obtener el máximo rendimiento de los ojales y una morfología óptima de los ojales.
La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes de aislamiento de ojales es que hemos eliminado la variabilidad de lote a lote mediante el uso de enzimas purificadas. Y además, hemos cambiado o mejorado algunos protocolos para mejorar la morfología de los ojales. Después de la eutanasia, cubra el torso con etanol al 70% antes de abrir la cavidad abdominal por completo desde el ano hasta el diafragma.
A continuación, coloque el ratón en la plataforma de un microscopio de disección. Extraiga el ciego y el colon ascendente y colóquelos fuera de la cavidad corporal hacia la izquierda, desplazando los lóbulos del hígado contra el diafragma. Si no permanecen allí por sí solos, aumente la apertura de la cavidad corporal.
Agarre el duodeno con pinzas curvas y localice la vena porta de la arteria hepática y el haz de conductos biliares que conducen al hígado. Con otro par de pinzas curvas. Inserte una sutura debajo de la arteria, la vena y el haz de conductos y apriétela lo más cerca posible del hígado.
Con dos pares de pinzas curvas, agarre con cuidado el duodeno y encuentre el conducto biliar conectado a la papila, use una pinza de las pinzas para perforar el páncreas y el tejido conectivo justo debajo del conducto biliar y cerca de la papila en funcionamiento. Rápidamente, coloque las pinzas a través del orificio e inserte una sutura. Flojamente. Ata la sutura alrededor del conducto biliar para crear un pequeño círculo con pinzas de 90 grados.
Tire del intestino delgado hasta que el conducto biliar esté tau. Haz un corte horizontal a través de la papila con unas tijeras súper finas sin desalojar el conducto biliar de la papila mientras sostienes el intestino. Inserte una cánula en el conducto biliar y luego apriete suavemente la sutura alrededor de la cánula.
A continuación, llene una jeringa de tres mililitros con 2,0 mililitros de mezcla de colagenasa proteasa. Inyecte esta mezcla en la cánula a un ritmo lento y constante. Una vez completado el inflado del páncreas, retire la cánula del conducto biliar.
Comenzando en el colon descendente, corte el tejido conectivo mientras tira de los intestinos hacia arriba hasta llegar al conducto biliar. A continuación, separe el páncreas del bazo y los tejidos circundantes. Por último, corta las suturas y retira el páncreas.
Una vez extraído, coloque el páncreas en un tubo de 50 mililitros que contenga cinco mililitros de HBSS en hielo. Una vez que se hayan recolectado todas las muestras, coloque los tubos de 50 mililitros que contengan tejido pancreático en un baño de agua a 37 grados centígrados. Durante 15 minutos, balancee suavemente el tubo y verifique si hay disociación del tejido.
Asegúrese de que el pañuelo se deshaga fácilmente sosteniendo el tubo por la tapa. Agite 12 veces para disociar aún más el tejido. No agregue más de 30 mililitros de HBSS y centrifuga.
Aspire el sobrenadante con cuidado y deje una pequeña cantidad de sobrenadante en la parte inferior para no alterar la paleta de celdas. Usando una jeringa de 30 mililitros conectada a una aguja de calibre 14, no agregue más de 10 mililitros de HBSS y aspire la suspensión hacia arriba y hacia abajo dos veces. Filtre la mezcla de células a través de un colador en T de plástico en un tubo de 50 mililitros.
Enjuague con otros 10 mililitros, HBSS y centrífuga. Decantar el sobrenadante e invertir los tubos para escurrir sobre una toalla de papel absorbente durante un minuto. Vuelva a suspender cada tubo en 10 mililitros.
Frío 1100. Su superposición opaca, la su opaca Con 10 mililitros, HBSS y centrífuga. Retire los 20 mililitros completos de sobrenadante con una pipeta de 25 mililitros de diámetro grande y pase el sobrenadante a través de un filtro invertido de 70 micras.
Filtre los ojales directamente en una placa de Petri y enjuague pipeteando 10 mililitros de medios de ojales a través del cultivo de filtros. Los ojales en una incubadora de cultivo de tejidos hasta que estén listos para la experimentación. El rendimiento, la morfología y la calidad de los ojales son los parámetros generales utilizados para juzgar el éxito del aislamiento de los ojales.
Aquí se muestra la morfología típica de los ojales. Los ojales tienen una forma redonda a oblonga con un tamaño relativamente uniforme. Aquí. Los ojales aislados se analizaron para determinar la secreción de insulina estimulada por glucosa.
La estimulación de la insulina fue similar entre los ojales preparados por Sigma Type 11 en comparación con ci zyme TM, MABP que indica una alta calidad de preparación de los ojales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo canular un conducto biliar de ratón. Trabaje con colagenasa zima y proteasas neutro para aislar los párpados para cualquier ensayo.
Visión general
Este artículo describe un procedimiento detallado para aislar los islotes de un páncreas de ratón utilizando la inserción de un tubo en el conducto pancreático in situ y una mezcla de colagenasa y proteasa. El método tiene como objetivo mejorar el rendimiento y la morfología de los islotes mientras se minimiza la variabilidad.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Endocrinología
Antecedentes
- Las células de los islotes son cruciales para la producción de insulina.
- Los métodos de aislamiento tradicionales pueden llevar a variabilidad en los resultados.
- El uso de enzimas purificadas puede mejorar la calidad de los islotes aislados.
- Los protocolos mejorados pueden llevar a una mejor morfología de los islotes.
Propósito del estudio
- Aislar los islotes del páncreas de ratón de manera efectiva.
- Reducir la variabilidad entre lotes en las preparaciones de enzimas.
- Optimizar la morfología de los islotes para aplicaciones de investigación.
Métodos utilizados
- Aislamiento del páncreas de ratón de los tejidos circundantes.
- Inserción de un tubo en el conducto biliar para la infusión de enzimas.
- Inflación del páncreas con una mezcla de colagenasa y proteasa.
- Filtración y sembrado de los islotes aislados para la experimentación.
Principales resultados
- Disociación y aislamiento exitosos de los islotes.
- Mejora en la morfología de los islotes observada después del aislamiento.
- Preparaciones de alta calidad de islotes indicadas por pruebas de secreción de insulina.
- El método demostró una variabilidad reducida en comparación con las técnicas tradicionales.
Conclusiones
- El método descrito es efectivo para aislar islotes de alta calidad.
- El uso de enzimas purificadas mejora la confiabilidad de los resultados.
- Esta técnica puede ser beneficiosa para varios ensayos que involucren islotes.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Isolation of primary pancreatic islets enables physiologically relevant assessment of beta cell function, which is critical for diabetes target validation and mechanistic de-risking. Variability in enzyme lot performance compromises reproducibility across discovery campaigns, impacting lead identification and predictive confidence. This protocol addresses lot-to-lot inconsistency through purified collagenase and neutral protease, supporting scalable, standardized islet preparation for preclinical evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of intracellular signaling pathways and secretory responses in primary islets, improving target hypothesis validation.
- Operational Value: Reduces biological noise from enzymatic variability, increasing confidence in target engagement readouts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides consistent islet yield and morphology for reliable glucose-stimulated insulin secretion assays.
- Operational Value: Standardized enzyme composition supports assay reproducibility across laboratories and screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease-relevant beta cell biology for preclinical efficacy and toxicity studies.
- Operational Value: Facilitates cross-strain comparability when enzyme ratios are adjusted for species-specific tissue characteristics.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, where primary islet function informs go/no-go decisions.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and functional target validation using physiologically relevant human-like islet responses.
- Screening: Enables standardized, quantitative assessment of compound effects on insulin secretion.
- Analytics: Generates measurable dependent variables such as insulin secretion levels and islet yield for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery-phase target modulation to preclinical outcomes through preserved islet morphology and function.
- Enterprise Reuse: Purified enzyme lots allow protocol reuse across projects, reducing re-optimization burden.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through reduced mechanistic ambiguity in beta cell responses.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of islet isolation across sites and studies.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in diabetes programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on reliable islet-derived functional data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine dissection and pancreatic duct cannulation.
- Dependent on access to purified collagenase (CIzyme MA) and neutral protease (CIzyme BP) with characterized activity.
- Necessitates standardization of enzyme ratios (e.g., 35:10 collagenase:protease) for consistent performance.
- Adaptation may be needed for non-C57BL/6 strains or rat models based on tissue density and enzyme accessibility.
- Practical limitation: Manual dissection and inflation steps constrain throughput without automation.
