Name: Aislamiento de ratón Islet Langerhans utilizando una combinación de colagenasa purificada y proteasa neutra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Aprende el aislamiento de islotes de Langerhans en ratón mediante canulación ductal y enzimas purificadas. Este protocolo mejora el rendimiento y la morfología celular para estudios endocrinológicos.

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Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones del NIH R01 DK060581, R01 DK083583 (tanto para RGM).

A. Materiales necesarios: Véase la Tabla 1 (reactivos) antes de la preparación <ol><li> HBSS (P / S): 100 ml de HBSS 10X + 900 ml de H 2 0 + 1% de penicilina / estreptomicina (almacenado en el refrigerador o se mantuvieron en hielo). </li><li> 20% stock de BSA se hace en agua y se dividió en alícuotas y se almacenó a -20 ° C. </li><li> HBSS (BSA): 200 ml 1X HBSS (P / S) + 3 ml de 20% de BSA (concentraciones finales de 0,3% de BSA es) </li><li> Islet medio: RPMI + 10% de FBS + glutamina 1% + 1% penicilina / estreptomicina </li><li> Histopaque 1100: 240 ml Histopaque 1119 + 200 ml 1077 Histopaque </li><li> Sutura 4-0 (McKesson): cortado en 2 ¾ pulgadas piezas y almacenado en una caja de Petri 10 cm </li><li> Instrumentos: Doble las pinzas de herramientas de la ciencia Artes a 90 °, y limar los dientes de sierra de los tres pares de pinzas. El objetivo es opaco a los dientes, no para eliminarlos. </li><li> Cánula para la administración de la mezcla de colagenasa / proteasa: 27G ½ pulg aguja, 30 ½ pulgadasaguja, PE50 tubo cortado en piezas de 12 pulgadas. Presentar dos agujas a un final suave y redondeada que no tiene bordes afilados. Insertar la aguja 27G en un extremo de una pieza de 12 pulgadas de tubo de PE50. Retire la aguja 30G de la caja por la rotura de la carcasa con un par de alicates, girando la carcasa de ¼ de vuelta cada vez. Retire la aguja con las pinzas de la carcasa y la inserta en el otro extremo de la tubería PE50 bajo un microscopio de disección. Asegúrese de no doblar la tubería como se inserta la aguja en el tubo PE50. La aguja 27G es el extremo que va a conectar la jeringa de la colagenasa. </li><li> La colagenasa (CI zyme MA) y Neutral Protease (CI zyme BP). Reconstituir la TDE según instrucciones del fabricante. Consulte el Certificado lote específico de análisis para calcular la concentración de la actividad enzimática. Transferencia de un total de 350.000 colágeno degradantes actividad (CDA) unidades de la colagenasa reconstituido y 100.000 unidades de proteasa neutral de la reconstitbuido Proteasa BP en un tubo cónico y se completa hasta 15 ml en total en HBSS (P / S) </li></ol> B. Paso a Paso Protocolo 1. La inflación del páncreas con la mezcla colagenasa / Proteasa <ol><li> Eutanasiar ratón por dislocación cervical, saturar el torso ratón con 70% de EtOH, la cavidad abdominal abierta completamente del ano a diafragma con las tijeras de disección y pinzas. </li><li> Coloque el mouse sobre la plataforma de un microscopio de disección. </li><li> Tire el ciego y el colon ascendente hacia fuera y puso fuera de la cavidad del cuerpo hacia la izquierda. Véase la Figura 1 para un resumen de los pasos siguientes. </li><li> Coloque los lóbulos del hígado contra el diafragma, sino que debe permanecer allí si la cavidad corporal es lo suficientemente abierto. Encontrar la arteria hepática, vena portal y el haz del conducto biliar que conduce al hígado agarrando el duodeno con pinzas curvas. Con otro par de pinzas curvas, llegar debajo de la arteria, vena, y bu conductondle y saque un 2 ¾ pulgadas pedazo de sutura 4-0 en la arteria, vena conducto biliar, y lo atan una vez y tire con fuerza tan cerca del hígado como sea posible. </li><li> Utilizando dos pares de pinzas curvas, cuidadosamente agarrar el duodeno y encontrar el conducto biliar unido al duodeno en la papila. Utilice una tenaza de la pinza para perforar el páncreas y el derecho del tejido conectivo debajo de la estrecha vía biliar a la papila. Mete la pinza rápidamente a través del órgano para hacer un agujero y luego puso las dos pinzas de fórceps medio y coge otro trozo de 2 ¾ pulgadas de sutura 4-0 y atarlo a través de una vez y tire de ella a un pequeño círculo, pero NO tire fuertemente. </li><li> Cambiar a los 90 ° fórceps y las tijeras Vannas superfinas. Con las pinzas de 90 °, con cuidado apretar y tirar del intestino delgado hasta el conducto biliar es tensa. Hacer un corte horizontal a través de la papila con las tijeras por apuñalamiento las tijeras abiertas en el intestino y después cortando con un solo movimiento. Trate de hacer solo one cortar a través de la papila sin desplazar el conducto de la bilis desde la papila. </li><li> Mientras mantiene el intestino con los fórceps 90 °, inserte la cánula en el conducto biliar hasta la mitad de la longitud de la vía biliar, a continuación, tire suavemente de la sutura apretada alrededor de la cánula. </li><li> Llene una jeringa de 3 ml con 2,0 ml de la mezcla de colagenasa / proteasa y se inyecta dentro de la cánula a un ritmo lento y constante. </li><li> Después de inflación del páncreas, retire la cánula de la vía biliar y el uso de las pinzas curvas y tijeras curvas de primavera para extirpar el páncreas hinchado comenzando en el colon descendente y cortando el tejido conectivo como usted tira los intestinos hacia arriba. Continuar para extirpar el páncreas de los intestinos hasta llegar a la vía biliar, a continuación, retire el páncreas del bazo, el estómago y de las vísceras de la cavidad abdominal. Termine de retirar al cortar lejos las suturas. Añadir el páncreas a un tubo de 50 ml que contiene 5 ml de HBSS(P / S). Este tubo debe ser en hielo. </li><li> Repetir el procedimiento anterior para cada animal de hasta cuatro animales. Para obtener resultados óptimos, se disocian sólo cuatro pancreata de una sola vez. Por lo general, mientras que los cuatro primeros están en el baño a 37 ° C, inflamos otro pancreata cuatro. </li></ol> 2. Páncreas La disociación <ol><li> Colocar los tubos de 50 ml que contienen la pancreata en un baño a 37 ° C durante 15 min. </li><li> Agite suavemente el tubo y compruebe que la disociación del tejido, asegúrese de tejido se deshace fácilmente, entonces remolino de los tubos 12 veces mientras que usted está sosteniendo el tubo con la tapa. </li><li> Añadir no más de 30 ml de HBSS (BSA) (esta puede ser una cantidad menor, dependiendo de cuánto se requiere para equilibrar los tubos para el paso de centrifugación), y se centrifuga a 290 xg durante un minuto. </li><li> Aspirar el sobrenadante cuidadosamente y dejar una pequeña cantidad de sobrenadante (2-3 ml) en la parte inferior a fin de no perturbar el sedimento celular. </li><li> Uso de una jeringa de 30 ml attached a 14G aguja, añadir no más de 10 ml de HBSS (BSA) y se aspira la suspensión arriba y hacia abajo 2 veces. </li><li> Filtrar la mezcla de células a través de un colador de té de plástico en un tubo de 50 ml y enjuague con otro HBSS 10 ml (BSA). </li><li> Centrifugar a 330 xg durante 2 min. </li><li> Decantar el sobrenadante e invertir los tubos para drenar en una toalla de papel absorbente durante 1 min. </li><li> Resuspender cada tubo 10 ml en frío 1100 histopaque. </li><li> Superponer el histopaque con 10 ml de HBSS (BSA) y se centrifuga a 900 xg durante 18 min. </li><li> Retire el completo de 20 ml de sobrenadante utilizando un gran taladro 25 ml pipeta y pasar el sobrenadante a través de un filtro invertido 70 micras. </li><li> Enjuague los islotes en una placa de Petri de 10 cm por 10 medios de comunicación de pipeteo islotes ml a través del filtro mientras la mantiene boca arriba sobre el plato. </li><li> Cultura los islotes en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora de cultivo de tejido hasta que esté listo para la experimentación. Por lo general, los islotes son recogidos a mano y contó antes de experimentation. </li></ol> 3. Los resultados representativos Los rendimientos de los islotes, la morfología y la calidad son los parámetros generales utilizados para juzgar el éxito de aislamiento de islotes. En nuestras manos, los rendimientos de los islotes a partir de la media de C57BL / 6 mouse están en el intervalo de 150-250 islotes que utilizan este protocolo (véase la Tabla 2), y son comparables con los obtenidos mediante optimizada Sigma tipo XI colagenasa. Sin embargo, los rendimientos pueden variar dependiendo de la cepa de ratón utilizada y la edad del ratón. La mayoría de los animales que utilizamos son en el rango de edad de 8-16 semanas Este protocolo ha sido probado en múltiples cepas de ratón, incluyendo C57BL / 6 (180 a 250 islotes / ratón), CD1 (200-300 islotes / ratón), 129 / B6 (200-300 islotes / ratón), BLKS-db/db (120-200 islotes / ratón), NOD (10 semanas de edad, 100-150 islotes / ratón), y NOD-SCID (100-150 islotes / ratón ). Morfología de los islotes típico se muestra en la Figura 2, en la que los islotes tienen una forma redonda a oblonga con un tamaño relativamente uniforme (aunque el tamaño UNIFormity puede variar de una cepa a otra). La Figura 3 muestra el análisis típico de la glucosa estimulada por la secreción de insulina de ratones C57BL / 6 islotes aislados de ratón purificados utilizando TDEs vs Sigma colagenasa tipo XI. Típicamente, una alta calidad de los resultados de la preparación de islotes en una estimulación de la insulina a la glucosa 25 mM que es 6-20 veces mayor que la observada en glucosa 2,5 mM. Otras aplicaciones también puede ser utilizado para probar la calidad de los islotes aislados, y éstos incluyen el uso de técnicas de perifusión, Ca 2 + de imágenes (con Fura2), y la transcripción inversa-PCR, entre otros 11. <img src="/files/ftp_upload/4137/4137fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Un resumen de la canulación del conducto biliar. <img src="/files/ftp_upload/4137/4137fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Aspecto típico de islotes C57BL / 6 a las 24 horas aislamiento siguiente. Las imágenes fueron adquiridas en una deverted microscopio con un aumento de 40X. <img src="/files/ftp_upload/4137/4137fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Glucosa estimulada por la secreción de insulina de ratones C57BL / 6 islotes. En aislamiento hr 24 siguiente, 100 islotes se incubaron en una placa de 12-así durante 1 hora a 37 ° C en solución de Krebs-Ringer tamponada con HEPES solución que contiene 2,5 mM de glucosa. Los islotes se transfirieron entonces a Krebs-Ringer HEPES a 2,5 mM de glucosa por una hora adicional, después de lo cual se recogió el sobrenadante para la medición de la insulina utilizando una de dos sitios inmunoespecífica ligado a enzimas (ELISA) (Crystal Chem). Los islotes mismos posteriormente se transfirieron a solución de Krebs-Ringer tamponada con HEPES que contiene 25 mM de glucosa, y la liberación de insulina en el medio se midió por ELISA después de 1 h de incubación.

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</ol>

NDS, SAT, y RGM no tienen nada que revelar. AGB autor es empleado por VitaCyte. Autor RCM tiene un interés de propiedad en VitaCyte.

En este protocolo, hemos descrito nuestro procedimiento para la canulación, la perfusión de colagenasa, y la disociación del páncreas murino, con el objetivo de aislar los islotes de Langerhans. Técnicamente, nuestro método, una vez dominado, debe permitir el aislamiento páncreas dentro de 4 min de la eutanasia al animal, y por 1 hr debe resultar en el aislamiento de islotes de un solo animal. La rapidez de la técnica nos permite aislar islotes de hasta 12 ratones en un estiramiento típica, lo que resulta en el aislamiento de hasta 3.000 islotes. A diferencia de otros protocolos que utilizan preparaciones crudas de colagenasa, nuestro protocolo incluye el uso de proteasas purificadas, IC del enzima colagenasa MA y CI proteasa enzima BP. Las variaciones en la consistencia de los preparados TDE que están disponibles comercialmente requiere que cada lote se prueba individualmente y optimizado antes de uso general. Esta variabilidad lote a lote que nos llevó a considerar el uso de puriTDE cados de VitaCyte. Estos TDEs altamente purificados se caracterizan por varios métodos incluyendo el uso de ensayos sensibles de fluorescencia sustrato marcado. El ensayo de fluorescencia CDA es más sensible a las diferentes formas moleculares de la colagenasa que tienen diferentes cinéticas en colágeno nativo degradantes. Históricas ensayos de sustrato péptido proporcionar una evaluación incompleta de la colagenasa. Caracterización de colagenasa por múltiples métodos garantiza una mayor actividad de la enzima entre lotes. Basado en nuestro propio ensayo utilizando una variedad de preparaciones de colagenasa comercialmente disponibles, se encontró que las combinaciones de enzimas purificadas dio reproducibles de lote a lote resultados. Las principales ventajas de usar TDEs altamente purificado y caracterizado rigurosamente en esta solicitud se una vez que la composición de enzima óptima se define, la consistencia del rendimiento de lote a lote está asegurada. Esta consistencia elimina el proceso de trabajo intensivo de capacitación se requiere normalmente muchopara productos de colagenasa crudo o enriquecido. TDEs purificado también permitir modificaciones adicionales de la composición para mejorar el rendimiento y la calidad de los islotes se recuperaron de diferentes cepas de ratón. Reporting composiciones óptimas de enzimas para el aislamiento de islotes a partir de cepas diferentes de ratones pueden ser más eficazmente comunicada. Esto, a su vez, conduce a un uso más productivo de los recursos y una mayor flexibilidad en el diseño experimental. Hay muchos pasos críticos que pueden afectar el resultado de los aislamientos islote utilizando nuestro protocolo. La primera es la necesidad de lograr una inflación efectiva del páncreas durante la perfusión de la preparación enzimática. Es importante comenzar la inflación con fuerza suave de la jeringa, y aumentar la fuerza como se infla el páncreas. Es útil para mover los intestinos y levantar el páncreas durante el inflado de modo que la colagenasa perfunde el órgano entero. Otro paso importante es la fuerza con la que se mueve el afte tubosr incubación a 37 ° C (paso 2,2). Se ha encontrado que la agitación páncreas duro contra la tapa del tubo provoca la fragmentación de los islotes, pero sin ningún tipo de disociación mecánica en este paso, el rendimiento de los islotes puede caer drásticamente. También es imperativo que durante la etapa de disociación con la jeringa (paso 2,5), una fuerza de nivel medio se aplica durante el movimiento hacia arriba y hacia abajo con el émbolo, lo que asegura la disociación adecuada de tejido antes de la etapa de filtración (2,6), donde muy poco tejido debe ser retenido en el filtro colador de té. Finalmente, el último paso a seguir con atención es la aspiración de todo 20 ml de HISTOPAQUE los islotes fraccionadas. Aunque islotes son típicamente en la interfase del histopaque y HBSS, se ha encontrado que se pierde islotes cuando tratamos de eliminar sólo la interfaz, sino que ahora quitar toda la 20 ml usando una pipeta de calibre grande 25 ml. Hemos añadido la filtración a través del filtro de 70 micras invertido (paso 2,11) para eliminar la necesidad de centrifuge los islotes varias veces para lavar el histopaque.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre de Reactivo </td><td> Empresa </td><td></td><td> Catálogo # </td></tr><tr><td> HBSS 10 veces </td><td> Life Technologies </td><td> 14065 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> Fisher Scientific </td><td> 10-040 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma Aldrich </td><td> cualquier </td><td></td></tr><tr><td> Histopaque 1077 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 10771 </td><td></td></tr><tr><td> Histopaque 1119 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 11191 </td><td></td></tr><tr><td> Sutura 4-0 100 m rollo </td><td> McKesson </td><td> 451521 </td><td></td></tr><tr><td> 14 g contundente extremo de la aguja </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-8216M </td><td></td></tr><tr><td>Vannas Sciss Superfine </td><td> Fisher Scientific </td><td> 501778 </td><td></td></tr><tr><td> Tijera curva de primavera </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14127 </td><td></td></tr><tr><td> Pinzas curvas (2) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 15914G </td><td></td></tr><tr><td> Fórceps curvo (para 90 °) </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 11052-10 </td><td></td></tr><tr><td> 27G 1/2 pulgada aguja </td><td> Fisher Scientific </td><td> 305109 </td><td></td></tr><tr><td> 30G 1/2 pulgada aguja </td><td> Fisher Scientific </td><td> 305106 </td><td></td></tr><tr><td> PE tubería </td><td> Becton Dickinson </td><td> 427411 </td><td></td></tr><tr><td> La colagenasa MA </td><td> Vitacyte, LLC </td><td> 001-2030 </td><td></td></tr><tr><td> BP proteasa </td><td> Vitacyte, LLC </td><td> 003-1000 </td><td></td></tr><tr><td> 3 ml jeringa </td><td> Fisher Scientific </td><td> 309585 </td><td></td></tr><tr><td> 30 ml jeringa </td><td> Fisher Scientific </td><td> 309650 </td><td></td></tr><tr><td> 70 micras filtro </td><td> Fisher Scientific </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> 10 cm 2 Placa de Petri </td><td> Fisher Scientific </td><td> 351005 </td><td></td></tr><tr><td> Colador de té de plástico </td><td> Cualquier fuente de cocina </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabla 1. Reactivos y Equipos </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" width="510"><tbody><tr><td> Sigma tipo XI (L010M8618) </td><td> MA (100615) BP (110.329) </td><td> MA (081104) BP (100.823) </td><td> MA (091211) BP (101.109) </td></tr><tr><td> 216 (± 74) </td><td> 260 (± 45) </td><td> 157 (± 37) </td><td> 200 (± 4) </td></tr></tbody></table></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabla 2. Islotes rendimientos promedio (± DE) utilizando diferentes lotes TDE * * Los datos representan los rendimientos medios de islotes procedentes de al menos 10 ratones. Los números de lote entre paréntesis </td></tr></tbody></table>

aislamiento de ratón islet langerhans utilizando una combinación de colagenasa purificada y proteasa neutra

Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease

La interrogación de expresión génica de células beta y la función in vitro se ha desplazado en ángulo recto en los años del estudio de líneas celulares de roedores tumorigénicas al estudio de islotes aislados de roedores. Islotes primarias ofrecen la ventaja de que más fielmente refleja la biología de las vías de señalización intracelular y respuestas secretoras. Considerando que el método de aislamiento de islotes usando tejido de disociación de enzimas (TDE) preparaciones ha sido bien establecido en muchos laboratorios de 1-4, las variaciones en la consistencia de rendimiento y calidad de los islotes de cualquier cepa de roedor dado que limiten el alcance y la viabilidad de los islotes estudios primarios. Estas variaciones ocurren a menudo como resultado de los TDEs crudo parcialmente purificadas utilizadas en el procedimiento de aislamiento de islotes; TDES exhiben frecuentemente de lote a lote variaciones en la actividad y a menudo requieren ajustes en la dosis de enzima utilizada. Un pequeño número de informes han utilizado purificó TDEs para aislamientos de células de roedores 5, 6 </sup&gt;, pero la práctica no está muy extendida a pesar del uso de rutina y las ventajas de purificar TDEs para aislamientos islotes humanos. En colaboración con VitaCyte, LLC (Indianápolis, IN), se desarrolló un islote modificada ratón protocolo de aislamiento basado en el descrito por Gotoh 7, 8, en el que los TDEs se someten a perfusión directamente en el conducto pancreático de ratones, seguido por fraccionamiento tejido crudo a través un gradiente Histopaque 9, y el aislamiento de islotes purificados. Una diferencia significativa en nuestro protocolo es el uso de colagenasa purificada (CI zyme MA) y neutral combinación proteasa (CI zyme BP). La colagenasa se ​​caracteriza por el uso de un 6 colágeno fluorescencia actividad degradante (CDA) de ensayo que utiliza la etiqueta fluorescente fibrillas solubles en piel de ternera como sustrato 6. Este sustrato es más predictiva de la cinética de degradación del colágeno en la matriz del tejido ya que depende de colágeno nativo como el sustrato. La proteasa fue characterized con un ensayo fluorescente sensible cinética 10. Utilizando estos ensayos mejorados junto con el análisis bioquímico más tradicional habilitar el TDE a fabricar más consistente, lo que conduce a un rendimiento mejorado la consistencia entre los lotes. El protocolo descrito en el aquí se ha optimizado para un rendimiento máximo de islotes y morfología de los islotes óptima utilizando ratones C57BL / 6. Durante el desarrollo de este protocolo, varias combinaciones de colagenasa y proteasas neutras se evaluaron a diferentes concentraciones, y la proporción final de colagenasa: proteasa neutra de 35:10 representa el desempeño de enzima comparable a Sigma Tipo XI. Debido a la variabilidad significativa en los rendimientos promedio de los islotes de diferentes cepas de ratas y ratones se ha informado, modificaciones adicionales de la composición TDE debe hacerse para mejorar el rendimiento y la calidad de los islotes se recuperaron de diferentes especies y cepas.

Una descripción detallada de ratón aislamiento de islotes se describe utilizando la técnica de canulación en pancreático ductal in situ y la perfusión de una combinación de colagenasa purificada y proteasa neutra.

Aislamiento de ratón Islet Langerhans utilizando una combinación de colagenasa purificada y proteasa neutra

El análisis de la expresión génica y la función de las células beta in vitro ha evolucionado significativamente a lo largo de los años, pasando del estudio de líneas celulares tumorogénicas de roedores...

El objetivo general de este procedimiento es aislar con éxito los islotes de un páncreas de ratón. Esto se logra primero aislando el páncreas del tejido circundante. A continuación, se canula el conducto biliar para que el páncreas pueda inflarse con la mezcla de colagenasa y proteasa.Una vez inflado, se extrae el páncreas y los islotes se disocian cuidadosamente. Finalmente, los islotes aislados se filtran y siembran para su uso futuro. En definitiva, este método de aislamiento de islotes con colagenasa purificada y proteasa neutra se utiliza para obtener un rendimiento máximo de islotes y una morfología óptima de los mismos.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes de aislamiento de anillos traqueales es que hemos eliminado la variabilidad entre lotes mediante el uso de enzimas purificadas. Además, hemos modificado o mejorado algunos protocolos para mejorar la morfología de los anillos traqueales. Tras la eutanasia, cubra el torso con etanol al 70 % antes de abrir completamente la cavidad abdominal desde el ano hasta el diafragma.A continuación, coloque el ratón sobre la plataforma de un microscopio de disección. Saque el ciego y el colon ascendente y colóquelos fuera de la cavidad corporal hacia el lado izquierdo; desplace los lóbulos del hígado contra el diafragma. Si no permanecen en esa posición por sí solos, aumente la abertura de la cavidad corporal.Sujete el duodeno con fórceps curvos y localice el haz de la arteria hepática, la vena porta y el conducto biliar que conduce al hígado. Con otro par de fórceps curvos, inserte una sutura debajo del haz de la arteria, la vena y el conducto, y apriétela lo más cerca posible del hígado.Utilizando dos pares de pinzas curvas, agarrar cuidadosamente el duodeno y localizar el conducto biliar en la papila. Con una punta de la pinza, perforar el páncreas y el tejido conectivo justo debajo del conducto biliar y cerca de la papila. Rápidamente, pasar la pinza a través del orificio e insertar una sutura, de forma suelta. Amarar la sutura alrededor del conducto biliar para formar un pequeño círculo utilizando pinzas de 90 grados.Extraiga el intestino delgado hasta que el conducto biliar quede tenso. Realice un corte horizontal a través de la papila con tijeras muy finas sin desalojar el conducto biliar de la papila mientras sostiene el intestino. Introduzca una cánula en el conducto biliar y luego tense suavemente la sutura alrededor de la cánula.A continuación, llene una jeringa de tres mililitros con 2,0 mililitros de la mezcla de colagenasa y proteasa. Inyecte esta mezcla en la cánula a un ritmo lento y constante. Una vez completada la inflación del páncreas, retire la cánula del conducto biliar.Comenzando en el colon descendente, corte el tejido conectivo mientras se tira de los intestinos hacia arriba hasta alcanzar el conducto biliar. A continuación, separe el páncreas del bazo y de los tejidos circundantes. Finalmente, corte las suturas y retire el páncreas.Una vez extraído, coloque el páncreas en un tubo de 50 mililitros que contenga cinco mililitros de HBSS sobre hielo. Una vez recolectadas todas las muestras, coloque los tubos de 50 mililitros que contengan tejido pancreático en un baño de agua a 37 grados Celsius. Agite suavemente el tubo durante 15 minutos y verifique la disociación del tejido.Asegúrese de que el tejido se separe fácilmente sosteniendo el tubo por la tapa. Agite girando 12 veces para disociar aún más el tejido. Añada no más de 30 mililitros de HBSS y centrifugue.Aspire cuidadosamente el sobrenadante y deje una pequeña cantidad de sobrenadante en el fondo para no perturbar la paleta celular. Utilizando una jeringa de 30 mililitros conectada a una aguja de calibre 14, agregue no más de 10 mililitros de HBSS y aspire la suspensión hacia arriba y hacia abajo dos veces. Filtre la mezcla celular a través de un colador plástico en forma de T hacia un tubo de 50 mililitros.Lave con otros 10 mililitros de HBSS y centrifugue. Deseche el sobrenadante e invierta los tubos para drenar sobre una toalla de papel absorbente durante un minuto. Reuspenda cada tubo en 10 mililitros.Frío 1100. Su capa opaca, la capa opaca con 10 mililitros, HBSS y centrifugar. Retire los 20 mililitros completos del sobrenadante utilizando una pipeta grande de 25 mililitros y pase el sobrenadante a través de un filtro invertido de 70 micrones.Filtre los organoides oculares directamente en una placa de Petri y enjuáguelos pipeteando 10 mililitros de medio para organoides oculares a través del cultivo filtrado. Mantenga los organoides oculares en un incubador de cultivo de tejidos hasta que estén listos para el experimento. Los rendimientos, la morfología y la calidad de los organoides oculares son los parámetros generales utilizados para evaluar el éxito del aislamiento de organoides oculares.Se muestra aquí la morfología típica de los islotes. Los islotes tienen una forma redonda a oblonga con un tamaño relativamente uniforme. Aquí, los islotes aislados fueron analizados para la secreción de insulina estimulada por glucosa.La estimulación con insulina fue similar entre los islotes preparados con Sigma Type 11 en comparación con ci zyme TM, MABP, lo que indica una alta calidad en la preparación de los islotes. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo canular el conducto biliar de un ratón. Trabaje con colagenasa zyme y neutroproteasas para aislar sus islotes para cualquier ensayo.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Páncreas murino aislamiento Islet

Los islotes pancreáticos, también llamados islotes de Langerhans, son un grupo de células endocrinas que producen hormonas para la regulación de la glucosa y otras funciones biológicas importantes. Este protocolo explica un método para aislar los islotes pancreáticos mediante la perfusión de colagenasa a través de la ampolla de Vater para digerir el tejido pancreático exocrino y una centrifugación en gradiente de densidad simplificada para purificar los islotes de ratones.

Aislamiento de islotes pancreáticos mediante perfusión de colagenasa: un método enzimático para aislar células de islotes pancreáticos

El ensayo in vitro función de las células β usando islotes aislados de ratones de Langerhans es un componente importante en el estudio de la fisiopatología de la diabetes y la terapéutica. Mientras que muchas aplicaciones posteriores están disponibles, este protocolo se describe específicamente la medición de intracelular de adenosina monofosfato cíclico (cAMP) como un parámetro esencial para determinar la función de las células β.

Un método para ratón islotes pancreáticos Aislamiento y cAMP intracelular Determinación

Presentamos aquí un protocolo para el aislamiento de islotes del modelo de ratón de diabetes tipo 2, Leprdb y detalles de un ensayo de células vivas para la medición de la secreción de insulina de islotes intactos que utiliza microscopía de 2 fotones.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Modelo de ratón de la Diabetes Tipo 2: El aislamiento de los islotes pancreáticos y células en Vivo 2-Photon imágenes de islotes intactos

Se describe un protocolo en el presente documento para el aislamiento de islotes intactos de ratones neonatales. Páncreas se digirieron parcialmente con colagenasa, seguido de lavado y recolección a mano. 20 - 80 grupos de los islotes se pueden obtener por el páncreas de los ratones recién nacidos, que son adecuados para diversos estudios de los islotes.

El aislamiento efectivo de los islotes funcionales de páncreas de ratón neonatales

Este protocolo de aislamiento de islotes describió una novedosa vía de inyección de colagenasa para digerir el tejido exocrina y un procedimiento de gradiente simplificado para purificar los islotes de ratones. Implica digestión enzimática, separación/purificación de gradientes y selección manual de islos. El aislamiento exitoso puede producir entre 250 y 350 islotes de alta calidad y completamente funcionales por ratón.

Un protocolo simple de alta eficiencia para el aislamiento de islotes pancreáticos de ratones

Aquí presentamos un protocolo para aislar células de islote pancreático de ratón para la detección de las inducciones de ROS por los xenobióticos con el fin de identificar los potenciales químicos xenobióticos diabetogenic.

Una proyección basadas en células de islotes pancreáticos murinos Diabetogenic ambiental productos químicos

En este protocolo, se describe un método de aislamiento de islotes murinos y trasplante en el tejido adiposo blanco subcutáneo inguinal. Los islotes murinos sinémicos aislados se trasplantan en un receptor murino utilizando un hidrogel de membrana del sótano. Se controla el nivel de glucosa en sangre de los receptores y se realiza un análisis histológico de los injertos de islos.

Modelo de trasplante de tejido adiposo blanco subcutáneo inguinal (ISWAT) de islotes murinos

Aquí describimos y demostramos un protocolo para el aislamiento primario de células endoteliales sinusoidales sinusoidales hepáticas (LSEC) del ratón. El protocolo se basa en la perfusión de colagenasa hepática, la purificación de células no parentales por centrifugación de baja velocidad y la selección de perlas magnéticas CD146. También fenotipo y caracterizamos estos LSEC aislados mediante citometría de flujo y microscopía electrónica de barrido.

Aislamiento y caracterización de células endoteliales sinusoidales sinusoidales hepáticas primarias de ratón

Este estudio desarrolló un método simplificado para extraer eficientemente islotes primarios funcionales y células acinas del páncreas del ratón, ofreciendo una herramienta valiosa para estudiar la comunicación intercelular en la patogénesis de la Diabetes Inducida por Pancreatitis Aguda.

Un método sencillo y rápido para el aislamiento simultáneo de islotes primarios y células acinares pancreáticas primarias de ratones

Este protocolo describe un método estandarizado para la extracción quirúrgica, la digestión enzimática y la purificación con gradiente de densidad de islotes pancreáticos de rata Lewis, permitiendo preparaciones de alto rendimiento y alta pureza para su uso directo en trasplantes o estudios in vitro .

Aislamiento y purificación de islotes pancreáticos a partir de ratas Lewis mediante digestión enzimática y separación por gradiente de densidad

Aprende el aislamiento de islotes de Langerhans en ratón mediante canulación ductal y enzimas purificadas. Este protocolo mejora el rendimiento y la morfología celular para estudios endocrinológicos.

Aislamiento de ratón Islet Langerhans utilizando una combinación de colagenasa purificada y proteasa neutra

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