Name: Estudio genético de la regeneración axonal en neuronas cultivadas de Adultos ganglio de la raíz dorsal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Aprende a cultivar neuronas de ganglio de la raíz dorsal de ratón adulto para estudiar la regeneración axonal mediante manipulación genética in vitro. Este modelo permite analizar el crecimiento neuronal tras electroporación.

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Este trabajo fue apoyado por becas de los NIH a FZ (R01NS064288) y la Fundación Craig H. Neilsen.

1. Preparación de cubreobjetos, medio de cultivo, y las enzimas de digestión <ol><li> La ronda 12-mm # 1 cubreobjetos de vidrio se utilizan para el cultivo neuronal. Los cubreobjetos se limpian con HCl al 10% durante la noche seguido por lavado ultrasónico con agua destilada y desionizada durante 3 veces (20 minutos / hora). Los cubreobjetos limpios se almacena en 70% de etanol para uso futuro. Antes de cada experimentos, los cubreobjetos se secan al aire y se coloca en la placa de cultivo. </li><li> Para recubrir los cubreobjetos secos, 100 l de solución de revestimiento que contiene 100 mg / ml de poli-D-lisina y 10 ug / ml de solución de trabajo laminina se añade en cada cubreobjetos y la placa de cultivo se transfiere a una incubadora a 37 ° C. Después de 1-2 horas, la solución de revestimiento se retira y los cubreobjetos se lavaron 3 veces con PBS estéril 1X. </li><li> Para preparar el medio de cultivo, el Medio Esencial Mínimo (MEM) se complementa con fetal al 5% de suero bovino (FBS), penicilina-estreptomicina 1X solución (500 unidades de penicilLin y 500 g de estreptomicina), suplemento 1X GlutaMAX-I, y los reactivos antimitóticos que contiene 20 mM de 5-fluoro-2-desoxiuridina y 20 mM uridina (FDU / R). Para el medio libre de suero, el FBS se sustituye con el suplemento de B27. </li><li> La colagenasa Se prepara una solución disolviendo colagenasa Un polvo con MEM para hacer una concentración de trabajo de 1 mg / ml. Para la tripsina, la 1X TrypLE Express se utiliza. </li></ol> 2. Disección y Cosecha de ratón adulto las neuronas DRG <ol><li> Después de la eutanasia de los 6 - de ratón adulto de 10 semanas de edad, retire la piel dorsal y le cortó toda la columna. Lavar la columna vertebral eliminado con 1 x PBS 2-3 veces. </li><li> Pin de la columna vertebral para eliminar la placa de la disección con el lado ventral y quita cuidadosamente los músculos para exponer los nervios sensoriales con un microscopio de disección. Los nervios conectados a los GRD a nivel de la madera son los más gruesos y fáciles de localizar. Por lo tanto, sólo para la mayoría de los experimentos lumbarGRD se cosechan. </li><li> Corte a través de cada vértebra a lo largo de la línea central con unas tijeras pequeñas y retire con cuidado los discos intervertebrales. El uso de pinzas para separar las vértebras para exponer la médula espinal. </li><li> Para diseccionar los GRD de madera, levanta cada nervio de madera con una pinza y trazar hacia la médula espinal para localizar a los GRD asociados lumbares (L1 a L6). </li><li> Cortar cada GRD del nervio periférico conectado, las raíces dorsales y ventrales con unas tijeras de primavera, y lo almacena en un tubo de microcentrífuga con medio MEM se coloca en hielo. Más GRD en diferentes niveles espinal (por ejemplo GRD torácica) puede ser disecado cabo de una manera similar, cuando sea necesario. </li></ol> 3. La digestión y la disociación de ratón adulto las neuronas DRG <ol><li> Después de recoger todos los GRD disecados, reemplace el medio MEM con colagenasa 1 ml de una solución e incubar el tubo de microcentrífuga a 37 ° C durante 90 min. </li><li> Vuelva a colocar la colagenasa una solución con 500 l Express 1X TrypLE paralución y se incuba a 37 ° C durante 15-20 min. </li><li> Retire la solución de TrypLE Express y lavar los GRD con un medio de cultivo preparado ml (con un 5% de SFB) por 3 veces. </li><li> Añadir 600 l medio de cultivo y suavemente la pipeta hacia arriba y abajo para triturar los tejidos de 20-30 veces con un 1 ml de azul, se graduó punta de la pipeta. </li><li> Después de la trituración, permitir que los tejidos no disociadas a asentarse en el fondo de la microcentrífuga y transferir la suspensión celular a un tubo de 10 ml estéril. Añadir otro medio de 600 l cultura y repita el paso de trituración hasta que la mayoría de los tejidos se disocian. La suspensión celular obtenida contiene tanto neuronas y células no neuronales. En la mayoría de los casos, las células de 6 GRD (~ 5 x 10 4) se utilizan para la reacción electroporación una. </li></ol> 4. La manipulación genética de las neuronas a través de electroporación <ol><li> Preparar la solución de transfección mediante la mezcla de la solución nucleofection Amaxa para las neuronas de ratón con plásmidos de ADN (~ 10 mg) O oligos siRNA (~ 0,2 nmol) para hacer un volumen final de 100 l por cada transfección. </li><li> Centrifugar las células disociadas a 680 rpm durante 7 minutos a temperatura ambiente, y desechar el sobrenadante tanto como sea posible. Añadir la solución de transfección preparada y suavemente la pipeta hacia arriba y abajo 3-4 veces con puntas de pipeta de 200 l para volver a suspender las células. </li><li> Transferir la suspensión celular se mezcla con la solución de transfección de la cubeta de electroporación y electroporate las células utilizando el programa Amaxa nucleofector sistema G-013. </li><li> Después de la electroporación, inmediatamente añadir 500 l de pre-calentado (37 ° C) que contenía FBS al medio de cultivo a la cubeta y transferir toda la solución (~ 600 l) en la placa de cultivo recubierto con densidades de células deseadas. Para el experimento que requiere re-suspensión y re-chapado, las neuronas se cultivan directamente sobre la placa de cultivo de plástico a alta densidad (10000-20000 células / pocillo). Para el experimento que se examina directamente el crecimiento del axón, las neuronas son ont plateadoo cubreobjetos de vidrio recubiertas con menor densidad (3000-5000 células / pocillo). Coloque la placa de cultivo en la incubadora (37 ° C, 5% de CO 2). </li><li> Cuatro horas después de placas cuando las neuronas se han unido a los sustratos, vuelva a colocar el medio de cultivo (que contiene la solución nucleofection Amaxa) con 500 l medio de cultivo fresco y pre-calentado, y devolver la placa a la incubadora para el cultivo adicional (37 ° C , 5% CO 2). Tanto medio de cultivo que contiene FBS o el medio libre de suero se puede utilizar en este paso. </li></ol> 5. El cultivo de neuronas DRG para adultos para el Análisis de Axon crecimiento <ol><li> Para las neuronas transfectadas con plásmidos de ADN, la expresión del gen de interés (por ejemplo, EGFP) se puede observar ya en una hora unos pocos después de la electroporación. Para las neuronas transfectadas con siRNAs, por lo general esperar 3-4 días para permitir que el agotamiento suficiente de las proteínas endógenas. Los cultivos de neuronas se puede, ya sea directamente fijada para el análisis de crecimiento de los axones en el varionos puntos de tiempo (1-4 días después de la electroporación) o re-suspendido y re-chapada para analizar axón rebrote (véase más adelante). </li><li> Para RNAi mediada por la pérdida de la función de los estudios, los cultivos de neuronas puede ser re-suspendido y vuelto a chapar para permitir que los axones de las neuronas a crecer de nuevo, en los que las proteínas específicas ya están agotadas. Para ello, sustituir el medio de cultivo antiguo de los cultivos de neuronas de alta densidad con 1 ml de pre-calentado medio fresco y la pipeta suavemente hacia arriba y hacia abajo para 6-10 veces para volver a suspender las neuronas conectados de la placa de cultivo. Debido a que las células no neuronales (por ejemplo, células de Schwann) adjuntar mucho más ajustada a la placa de cultivo de neuronas, las células suspendidas de re-son principalmente las neuronas. </li><li> Transferir las neuronas de re-suspendida en un tubo de microcentrífuga y se tritura suavemente 10-15 veces para volver a disociar los grupos de células en la suspensión de células individuales. </li><li> Placa de re-re-las neuronas disociadas en cubreobjetos recién preparados en el de baja densidad (3000-5000 células / pocillo) y la cultura durante toda la noche (16-24 horas). </li></ol> 6. Fijación, tinción inmuno-, e imágenes de fluorescencia <ol><li> Aspirar el medio y añadir un 4% paraformaldehído (PFA) (200 l / pocillo) para fijar las células durante 15-20 minutos a temperatura ambiente. Las células fijadas se lavan entonces con 1X PBS durante 3 veces. </li><li> Aspirar el PBS y añadir la solución de bloqueo (1% de albúmina sérica bovina, 0,1% de Triton X-100, y 2,0% de suero normal de cabra en PBS 1X) a las neuronas fijos durante 60 min a temperatura ambiente. </li><li> Para los axones de la etiqueta, las neuronas son inmuno-teñidas con anti-neurofilamentos o anti-anticuerpos βIII tubulina. Para ello, coloque una gota 30μl de la solución de anticuerpo primario (1:1200 dilución de la tubulina-βIII anticuerpos) en una parafina para cada cubreobjetos. Invertir los cubreobjetos y colocarlos en la solución de anticuerpo primario durante 60 min a temperatura ambiente. </li><li> Volver cubreobjetos a la placa de cultivo original y se lava con PBS 1X durante 3 veces. </li><li> Repita el mismo procedimiento para la una secundariatibody. </li><li> Lavar los cubres con agua destilada por 3 veces, y luego montar cubreobjetos sobre portaobjetos de vidrio con la solución de montaje (por ejemplo, prolongar la Antifade Oro). </li><li> Las neuronas teñidas se pueden visualizar con cualquier sistema de microscopía de fluorescencia equipado con una cámara digital. Las longitudes de los axones se miden y analizan con el software de análisis de imágenes. </li></ol> 7. Los resultados representativos En la ausencia de factores de crecimiento extracelulares agregado, las neuronas DRG adultos por lo general comienzan a crecer los axones de 48 horas después de sembrar primero. Los axones muestran a menudo morfologías ramificados (Figura 1). En contraste, las neuronas de re-chapados empezar a extender axones sólo una hora pocos después de placas, y los axones alargado con mucho menor ramificación (Figura 2). Estos resultados sugieren que la re-chapados neuronas comparten propiedades similares a las de las neuronas lesionadas acondicionado. Al utilizar este enfoque, hemos realizado recientemente la pérdida de-de la función de los estudios para examinar el papel de la regeneración axonal factor de transcripción c-Jun asociada en el crecimiento de los axones de las neuronas adultas DRG in vitro. Los resultados mostraron que la electroporación de un grupo de 4 diferentes siRNAs dirigidos a diferentes regiones de c-Jun (ON-TARGETplus) reduce notablemente los niveles de proteína de c-Jun en adultos neuronas DRG 3 días después de la transfección (Figura 3) 9. Cuando las neuronas se volvieron a plateado y culta el crecimiento durante la noche, los axones de las neuronas desmontables c-Jun se redujo significativamente (control: 348,37 ± 16.21mm; si-c-Jun: 262,32 ± 15,69 micras, Figura 3) 9. Estos resultados indican que las neuronas adultas cultivadas DRG proporciona un modelo útil para estudiar el crecimiento del axón de las neuronas adultas. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4141/4141fig1.jpg" /> Figura 1. Adultos DRG neuronas de ratón cultivadas en baja densidad durante 3 días. Las neuronas fueron teñidas con anti - &amp; bETA, anticuerpos III tubulina. Tenga en cuenta que la mayoría de los axones muestran morfologías ramificados. Barra de escala: 125 m. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4141/4141fig2.jpg" /> Figura 2. Re-chapado del ratón adulto las neuronas DRG después de 3 días de cultivo. (A), las neuronas cultivadas DRG para adultos en alta densidad de 3 días. (B) re-chapada DRG neuronas adultas fueron cultivados a baja densidad para pasar la noche. Tenga en cuenta que la mayoría de los axones muestran morfologías alargadas con poca ramificación del axón. Barra de escala: 250 m en A y 125 micras en B. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4141/4141fig3.jpg" /> Figura 3. El papel de c-Jun en el crecimiento de los axones de las neuronas DRG adultos in vitro. (A) Western blot de c-Jun en el ratón adulto las neuronas DRG después de la electroporación de c-Jun siRNAs. El resultado muestra el nivel notablemente reducido de c-Jun. (B) Control de las neuronas transfectadas con EGFP creció axones largos después de la re-siembra y el cultivo de una noche. (C) Co-transinfección de c-Jun siRNAs y EGFP crecimiento axonal deterioro de los adultos las neuronas DRG después de la re-siembra y el cultivo de una noche. Rojo: Tuj-1 tinción; Verde: EGFP. Barra de escala: 125 m. Estos resultados han sido publicados en Saijilafu et al. 9.

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<li>Saijilafu,, Hur, E. M., Zhou, F. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+axon+regeneration+via+in+vivo+electroporation+of+adult+mouse+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of axon regeneration via in vivo electroporation of adult mouse sensory neurons.</a> Nat. Commun. 2, 543-54 (2011).</li>
<li>Costigan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicate+high-density+rat+genome+oligonucleotide+microarrays+reveal+hundreds+of+regulated+genes+in+the+dorsal+root+ganglion+after+peripheral+nerve+injury%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Replicate high-density rat genome oligonucleotide microarrays reveal hundreds of regulated genes in the dorsal root ganglion after peripheral nerve injury.</a> BMC Neurosci. 3, 16(2002).</li>
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<li>Michaelevski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+to+transcription+networks+in+the+neuronal+retrograde+injury+response%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Signal%22%5BJournal%5D)">Signaling to transcription networks in the neuronal retrograde injury response.</a> Sci. Signal. 3, ra53(2010).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Adultos DRG neuronas regeneren sus axones firmeza después de la lesión del nervio periférico in vivo e in vitro, lo que proporciona un sistema útil para estudiar la regeneración de axones en los animales adultos. El cultivo in vitro de los adultos las neuronas DRG se está convirtiendo en un método ampliamente utilizado para investigar los mecanismos moleculares por los cuales la regeneración del axón está regulado. El procedimiento in vitro de neuronas de cultivo de ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11090-081 </td></tr><tr><td> Poli-D-lisina hidrobromuro </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P6407 </td></tr><tr><td> La laminina </td><td> Invitrogen </td><td> 23017-015 </td></tr><tr><td> 5-fluoro-2-desoxiuridina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F0503 </td></tr><tr><td> Uridina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> U3003 </td></tr><tr><td> Una colagenasa </td><td> Roche </td><td> 10103578001 </td></tr><tr><td> TrypLE expreso </td><td> Invitrogen </td><td> 12604-013 </td></tr><tr><td> Suero bovino fetal </td><td> Invitrogen </td><td> 10270-098 </td></tr><tr><td> La penicilina-estreptomicina (100 veces) </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122</td></tr><tr><td> GlutaMAX-I (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-038 </td></tr><tr><td> Vidrio cubreobjetos (# 1) </td><td> Microscopía Electrónica de Ciencias </td><td> 72196-12 </td></tr><tr><td> 24 células y placa de cultivo </td><td> Becton Dickinson </td><td> 35-3047 </td></tr><tr><td> 1X PBS </td><td> Mediatech </td><td> 21 a 040 CV </td></tr><tr><td> Agua estéril, destilada y desionizada </td><td> Mediatech </td><td> 25 a 055 CV </td></tr><tr><td> Nucleofector y electroporación Kits para las neuronas de ratón </td><td> Lonza </td><td> VPG-1001 </td></tr><tr><td> ON-TARGETplus siRNA contra c-Jun </td><td> Dharmacon </td><td> L-043776 </td></tr><tr><td> Anticuerpo anti - tubulina βIII (Tuj-1) </td><td> Covance </td><td> MMS-435P </td></tr><tr><td> Prolongar la solución de Oro Antifade de montaje </td><td> Invitrogen </td><td> P36930 </td></tr></tbody&gt; </table>

estudio genético de la regeneración axonal en neuronas cultivadas de adultos ganglio de la raíz dorsal

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

Es bien sabido que las neuronas maduras en el sistema nervioso central (SNC) no se puede regenerar sus axones después de lesiones debidas a la capacidad disminuida intrínseca para apoyar el crecimiento axonal y un ambiente hostil en el 1,2 SNC maduro. En contraste, las neuronas maduras en el sistema nervioso periférico (PNS) regenerar fácilmente después de las lesiones 3. XXX raíz dorsal (DRG ganglionares) neuronas son bien conocidos para regenerar robustamente después de lesiones de nervios periféricos. Cada neurona DRG crece un axón del soma celular, que se ramifica en dos ramas: una rama axonal periférico que inerva objetivos periféricos y una rama central que se extiende a la médula espinal. Lesiones de los resultados DRG axones periféricos en la regeneración de axones sustancial, mientras que los axones centrales en la médula espinal regenerarse poco después de la lesión. Sin embargo, si la lesión axonal periférica se produce antes de la lesión de la médula espinal (un proceso llamado la lesión acondicionado), la regeneración de los axones centrales es greatly mejora 4. Por otra parte, los axones de las neuronas DRG centrales comparten el mismo ambiente hostil como descendente corticoespinal axones en la médula espinal. En conjunto, es la hipótesis de que los mecanismos moleculares que controlan la regeneración de los axones de las neuronas DRG adultos pueden aprovecharse para mejorar la regeneración del SNC axón. Como resultado, adultos neuronas DRG se utilizan ahora ampliamente como un sistema modelo para estudiar el crecimiento axonal regenerativo 5-7. Aquí se describe un método de cultivo adulto DRG neurona que puede ser utilizado para el estudio genético de la regeneración axonal in vitro. En este ejemplo de un adulto las neuronas DRG están genéticamente manipulados a través de electroporación mediada por transfección de genes 6,8. Al transfectar neuronas con ADN plásmido o si / shRNA, este enfoque permite a ambos ganancia y la pérdida de la función de los experimentos para investigar el papel de un gen de interés en el crecimiento de los axones de las neuronas DRG adultos. Cuando las neuronas son transfectadas con SI / shRNA, la proteína endógena es dirigidageneralmente agotada después de 3-4 días en cultivo, durante el cual el crecimiento del axón tiempo robusta ya ha ocurrido, por lo que los estudios de pérdida de la función sea menos eficaz. Para resolver este problema, el método aquí descrito incluye un paso de re-suspensión y re-chapado después de la transfección, que permite que los axones para volver a crecer a partir de las neuronas en la ausencia de la proteína específica. Por último, ofrecemos un ejemplo del uso de este modelo in vitro para estudiar el papel de una regeneración axonal asociada a la genética, c-Jun, en la mediación de crecimiento de los axones de las neuronas DRG adultos 9.

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para el estudio genético de la regeneración axonal utilizando cultivos de neuronas de ratones adultos ganglio de la raíz dorsal se describe. El método incluye un paso para permitir re-suspension/re-plating axón re-crecimiento de las neuronas se someten a la manipulación genética. Este enfoque es especialmente útil para los estudios de pérdida de la función de regeneración axonal utilizando RNAi basado en caída proteína.

Estudio genético de la regeneración axonal en neuronas cultivadas de Adultos ganglio de la raíz dorsal

Es bien sabido que las neuronas maduras del sistema nervioso central (SNC) no pueden regenerar sus axones tras sufrir lesiones debido a una disminución de su capacidad intrínseca...

El objetivo general de este procedimiento es establecer un modelo in vitro para estudiar la regeneración axonal en mamíferos utilizando neuronas del ganglio raquídeo dorsal de adultos o neuronas DRG. Esto se logra primero mediante la disección de los ganglios DRG de ratones adultos, que luego se disocian en células individuales. A continuación, las neuronas disociadas se transfectan mediante electroforesis y se cultivan durante varios días para manipular genéticamente su expresión génica.El paso final consiste en resuspender e hiperinflar las neuronas para un cultivo adicional durante la noche. En última instancia, se utiliza un análisis de la longitud de los axones basado en microscopía para estudiar el crecimiento axonal a partir de neuronas manipuladas genéticamente. La ventaja principal de la resuspensión celular y la repetición del paso empleada en esta técnica es que permite analizar el crecimiento axonal de neuronas que ya han sido manipuladas genéticamente.Esta técnica es particularmente útil para estudios de pérdida de función en los que se utiliza el enfoque de RNI para regular a la baja el gen de interés. El procedimiento lo demostrará el Dr. Sfu, un investigador postdoc

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Neurociencia

En este protocolo, que describe un nuevo método para estudiar la influencia de la heterogeneidad de las células gliales en el crecimiento del axón con...

Estudio de células gliales Influencia heterogeneidad de crecimiento de los axones se utiliza un método co-cultivo de Nueva

Se presenta un método de inmunoprecipitación de la cromatina de los tejidos ganglios de la raíz dorsal después de una lesión axonal. El enfoque puede ser utilizado para identificar sitios específicos de factor de transcripción vinculante y la modificación epigenética de las histonas y el ADN importantes para la regeneración de los axones dañados, tanto en el sistema nervioso periférico y central.

Inmunoprecipitación de la cromatina de los tejidos ganglios de la raíz dorsal después de una lesión axonal

Fuente: Cheah, M., et al. Inyección de ganglios de la raíz dorsal y lesión por aplastamiento de la raíz dorsal como modelo para la regeneración sensorial de axones. J. Vis. Exp. (2017). Este video muestra un procedimiento paso a paso para inyectar una suspensión viral en los ganglios de la raíz dorsal (DRG) e inducir una lesión axonal controlada a través de un aplastamiento de la raíz dorsal en una rata anestesiada. El protocolo implica exponer los DRG, administrar un vector viral promotor del...

Modelado de la regeneración sensorial de axones en una rata mediante la inyección de ganglios de la raíz dorsal y la lesión por aplastamiento de la raíz dorsal

Fuente: Portela-Lomba, M., et. al. Cocultivo de neuronas ganglionares retinianas de rata axotomizadas con glia envolvente olfativa, como modelo in vitro de regeneración axonal adulta. J. Vis. Exp. (2020).Este video muestra la obtención de imágenes y la cuantificación de la regeneración axonal en neuronas ganglionares de la retina de rata axotomizadas (RGN) co-cultivadas con células gliales de envoltura olfativa humanas inmortalizadas. Las RGN están inmunomarcadas, con somas rojos y axones...

Imagen y cuantificación de la regeneración axonal en neuronas ganglionares de la retina de rata axotomizadas

Fuente: Li, Q. et al. Investigación de la regeneración de axones de mamíferos: electroporación in vivo del ganglio de la raíz dorsal de ratones adultos. J. Vis. Exp. (2018)Este video demuestra la transfección mediada por electroporación de neuronas DRG de ratón para estudiar la regeneración de axones. Describe los pasos para administrar construcciones de ácido nucleico a las neuronas DRG, inducir la lesión del nervio ciático y evaluar la regeneración axonal.

Transfección mediada por electroporación de ganglios de la raíz dorsal de ratón para promover la regeneración sensorial de axones

Ganglios de la raíz dorsal (DRG) son estructuras que contienen las neuronas sensoriales del sistema nervioso periférico. Cuando disociado, pueden ser co-cultivadas con células madre-SC como derivadas de tejido adiposo (ASC), que proporciona un valioso modelo para estudiar la regeneración in vitro en los nervios y la mielinización, imitando el entorno en vivo en el sitio de la lesión.

Ganglios de raíz dorsal neuronas y las células madre derivadas de la adiposa diferenciada: Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-cultivo modelo para estudiar la regeneración de los nervios periféricos

Este protocolo presenta el uso de una inyección de ganglios de la raíz dorsal (DRG) con un vector viral y una lesión concurrente por aplastamiento de la raíz dorsal en una rata adulta como modelo para estudiar la regeneración sensorial de los axones. Este modelo es adecuado para investigar el uso de la terapia génica para promover la regeneración sensorial de los axones.

Inyección de raíz dorsal ganglio de raíz dorsal y Lesión por aplastamiento como modelo para la regeneración del axón sensorial

Aquí, presentamos un protocolo usando Drosophila neurona sensorial - modelo de lesión de neurona arborización dendrítica (da), que combina en vivo en vivo la proyección de imagen, dos fotones láser axotomía/dendriotomy y potentes herramientas genéticas mosca, como una plataforma para la detección de potenciales promotores e inhibidores de Neurorregeneración.

Un modelo de lesión de Drosophila en Vivo para el estudio de Neurorregeneración en el periférico y sistema nervioso Central

La electroporación es un enfoque efectivo para entregar genes de interés en las células. Al aplicar este enfoque en vivo en las neuronas del ganglio de la raíz dorsal de ratón adulto (DRG), se describe un modelo para el estudio de la regeneración del axón en vivo.

Investigadora de axón mamífero de regeneración: En Vivo electroporación de ganglio de raíz Dorsal de ratón adulto

La grabación de una sola fibra es una técnica electrofisiológica eficaz que es aplicable a los sistemas nerviosos central y periférico. Junto con la preparación de DRG intacto con el nervio ciático adjunto, se examina el mecanismo de falla de conducción. Ambos protocolos mejoran la comprensión de la relación del sistema nervioso periférico con el dolor.

Uso de la grabación de una sola fibra In Vivo y el ganglio de raíz dorsal intacto con nervio ciático adjunto para examinar el mecanismo de falla de conducción

Presentamos un modelo in vitro para evaluar la capacidad neurorregenerativa olfativa ensheathing glia (OEG), después de una lesión neuronal. Se basa en un cocultivo de neuronas ganglionas de retina adultas axotomizadas (RGN) en monocapas OEG y posterior estudio de regeneración axonal, mediante el análisis de marcadores axoales y somatodendriáticos RGN.

Cocultura de neuronas ganglionas retinal de rata axotomizada con glia olfativa, como modelo in vitro de regeneración axonal adulta

Aprende a cultivar neuronas de ganglio de la raíz dorsal de ratón adulto para estudiar la regeneración axonal mediante manipulación genética in vitro. Este modelo permite analizar el crecimiento neuronal tras electroporación.

Estudio genético de la regeneración axonal en neuronas cultivadas de Adultos ganglio de la raíz dorsal

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