Microdiálisis de etanol durante etanol operante determinación y la auto-administración de etanol por cromatografía de gases

El objetivo general de este procedimiento es monitorear los niveles de etanol en el dializado cerebral durante una sesión de autoadministración de etanol. Con el fin de comparar esta medida con los comportamientos sincrónicos de autoadministración, esto se logra implantando primero quirúrgicamente una guía de microdiálisis, una cánula y un perno de sujeción, y luego entrenando a las ratas para que se autoadministren etanol de manera operante. El segundo paso es habituar a las ratas a la correa de la etapa de la cabeza para que no impida la autoadministración de etanol durante la microdiálisis.

A continuación, se realiza la microdiálisis durante una sesión de autoadministración de etanol durante la cual se prepara una porción de dialato para el análisis de etanol. A continuación, las muestras de dialato se analizan para determinar la concentración de etanol mediante un cromatógrafo de gases con detección de ionización de llama. En última instancia, los resultados obtenidos muestran el curso del tiempo en que el etanol llega a la región cerebral de interés durante una sesión de autoadministración de etanol.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la punción de la cola o la vena safena, es que este procedimiento es mínimamente disruptivo en el momento de la recogida de la muestra y permite la medición del fármaco a lo largo del tiempo en la región cerebral de interés mientras el animal realiza una tarea conductual. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque requiere una serie de habilidades especializadas, muchas de las cuales solo se pueden adquirir a través de la práctica o la experiencia repetidas. También demostrará el procedimiento Jeffrey Dilley, asistente de investigación de pregrado en nuestro laboratorio.

Todos los procedimientos con animales que se muestran están aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Texas y siguen todas las pautas para el cuidado y uso de las regulaciones de animales de laboratorio. La Universidad de Texas en Austin es una instalación acreditada por el ALAC para estos experimentos de microdiálisis conductual. Para estos experimentos de microdiálisis conductual se utilizan ratas Evans largas bien manejadas que han sido implantadas quirúrgicamente con una cánula de calibre 21 por encima de la región cerebral de interés. Todos los animales deben recibir al menos una semana de cuidados postquirúrgicos y recuperación, y estar sanos antes de comenzar los siguientes procedimientos.

Coloque la rata en una cámara operante de med associates, equipada con una palanca retráctil y un tubo basculante, y entrénela para que presione la palanca para acceder a una solución de sacarosa al 10%. Después de que la rata esté entrenada para responder a la solución de sacarosa, comience con un programa de entrenamiento adecuado durante el cual el etanol se agrega gradualmente a la solución durante múltiples sesiones de bebida la noche anterior a la penúltima sesión operante. Después de anestesiar al animal y verificar el nivel de sedación, conecte el resorte de amarre al perno de amarre en la etapa de la cabeza de la rata para habituarlo al aparato que consta de una palanca de contrapeso, un brazo, una correa giratoria, un resorte y un soporte de anillos.

Permita que la rata pase la noche en la sala de operaciones de su jaula doméstica con ad lido, comida y agua, y luego complete la sesión de entrenamiento del día siguiente con la correa y el equipo que la acompaña el día antes del experimento de microdiálisis. Después de anestesiar a la rata con flúor, compruebe si hay sedación realizando un pellizco en el dedo del pie e inserte una sonda de microdiálisis perfundida con líquido cefalorraquídeo artificial. Asegure la sonda adecuadamente y luego ajuste el caudal de la sonda a 0,2 microlitros por minuto.

Coloque a la rata en su jaula doméstica en la sala de operaciones para pasar la noche con todo el equipo de diálisis en su lugar y agregue lib, comida y agua. El día después de insertar la sonda, al menos dos horas antes de que comience el experimento, suba la sonda a su caudal de trabajo. Con una jeringa Hamilton, compruebe que el caudal de la sonda sea constante y que sea al menos el 90% del caudal establecido.

Si evalúa neurotransmisores en las muestras de diálisis, tome muestras durante todas las fases del experimento. Comience por recolectar muestras de diálisis mientras el animal está en su jaula de casa. Almacene las muestras de manera adecuada para su posterior análisis.

Transfiera con cuidado la rata a la cámara operante e inicie el programa operante que controla la cámara. Continúe tomando muestras mientras la rata espera que la palanca se extienda hacia la cámara dos muestras antes de que la palanca se extienda. Comience a recolectar una porción de cada muestra de dializado para el análisis de etanol pipeteando una alícuota adecuada de dializado en un vial de vidrio de dos mililitros y sellando el vial con un tabique hermético, pipetea y selle las muestras de etanol rápidamente.

Dado que el etanol es volátil y el volumen de la muestra es pequeño, la preparación inconsistente o lenta de la muestra dará lugar a resultados inexactos. Guarde el resto para el análisis de neurotransmisores. El período de bebida de 20 minutos comienza después de que el programa informático de Med Associates extiende la palanca dentro de la cámara y la rata la presiona para obtener acceso a una botella de solución para beber.

Continúe tomando muestras durante todo el período de bebida, después del período de bebida, el programa informático retira la botella de la cámara. Mantenga al animal en la cámara durante un período adicional de 20 minutos después de beber al final del experimento de microdiálisis. Después de anestesiar a la rata, retira la sonda.

Si el animal no es sacrificado humanitariamente de inmediato, reemplace el obterador para asegurar la visualización del tracto de la sonda. Recoge el cerebro dentro de los tres días posteriores al experimento. Analice las muestras junto con los patrones externos de etanol utilizando un cromatógrafo de gases con un detector de ionización de llama, un muestreador automático de espacio de cabeza, calentado a 50 grados Celsius, y una columna capilar con helio como fase móvil.

Para registrar y analizar los cromatogramas, utilice el software de la estación de trabajo de cromatografía para preparar el sistema para el análisis de etanol. Utilice un baño de agua de recirculación para calentar la placa del muestreador automático y abrir los tanques de aire e hidrógeno. A continuación, inicie el programa de inicio.

Cuando esté listo, inicie una combustión de 20 minutos, que descontamina la fibra. Elabore patrones utilizando un matraz aforado de 100 mililitros para diluir 238 microlitros de etanol al 95% con agua hasta un volumen final de 100 mililitros. Utilice una dilución en serie uno a uno para crear estándares.

Pipetee los patrones en viales de vidrio y séllelos exactamente como se prepararon las muestras. Asegúrese de dejar correr un agua en blanco junto con sus estándares. Coloque los estándares y las muestras en la bandeja del muestreador automático y caliéntelos hasta que se haya vaporizado toda la alícuota líquida.

Para ejecutar los estándares y las muestras, cree una lista de muestras anotando qué muestra está en qué ranura del muestreador automático y anotando que cada muestra debe perforarse. Una vez que enrute los archivos de datos a una carpeta seleccionada, seleccione un método de elección para las muestras y comience la ejecución. Una vez que el sistema haya ejecutado las muestras, compruebe que el programa ha integrado correctamente cada pico.

Represente gráficamente, la altura del pico en función de cada patrón externo conocido. Concentración de etanol. Utilice la función lineal dada por los puntos para interpolar la concentración de etanol de cada muestra de dializado.

Esta figura muestra ejemplos de cromatogramas para tres concentraciones de patrones de etanol y uno para una muestra de dializado en ratas recolectada al final de la sesión de autoadministración de etanol. Los picos de etanol deben ser relativamente simétricos, tener tiempos de retención consistentes y una relación señal/ruido superior a 10. El incumplimiento de estos criterios significa que el sistema requiere mantenimiento, cromatografía de calidad y los estándares correctos producen una curva estándar lineal que se utiliza para calcular la concentración de etanol de las muestras de dializado recolectadas de animales autoadministrados de etanol en el transcurso de su autoadministración.

Las concentraciones de etanol de dializado derivadas no se corrigen para la recuperación in vivo de la sonda y son solo una fracción de la concentración de etanol tisular cerebral. Si se requiere microdiálisis cuantitativa de etanol, se determina experimentalmente la fracción de extracción de etanol que se difunde desde el espacio extracelular hacia la sonda. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en aproximadamente cuatro o cinco horas si se realiza correctamente.

Esto variará en función de la duración de la sesión de comportamiento. La finalización exitosa de la fase de microdiálisis del experimento depende en gran medida de la calidad de las fases preparatorias. Al intentar este procedimiento, es importante asegurarse de que sus ratas estén bien manipuladas y de que las haya habituado a cualquier estímulo posiblemente distractor que pueda ocurrir durante el experimento de diálisis para que el comportamiento de autoadministración del animal no se vea afectado.