Name: Microdiálisis de etanol durante etanol operante determinación y la auto-administración de etanol por cromatografía de gases (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Aprende microdialisis cerebral para monitorear etanol en ratas durante auto-administración operante usando cromatografía de gases. Este método permite medir niveles de etanol en tiempo real con mínima perturbación.

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Esta investigación fue apoyada por las subvenciones del NIH / NIAAA (AA11852 y AA007471).

<ol><li>Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survivable+stereotaxic+surgery+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Survivable stereotaxic surgery in rodents.</a> J. Vis. Exp. (20), e880(2008).</li>
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<li>Doyon, W. M., Anders, S. K., Ramachandra, V. S., Czachowski, C. L., Gonzales, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+operant+self-administration+of+10%25+ethanol+plus+10%25+sucrose+on+dopamine+and+ethanol+concentrations+in+the+nucleus+accumbens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Effect of operant self-administration of 10% ethanol plus 10% sucrose on dopamine and ethanol concentrations in the nucleus accumbens.</a> J Neurochem. 93, 1469-1481 (2005).</li>
<li>Carrillo, J., Gonzales, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+exposure+to+voluntary+ethanol+self-administration+produces+adaptations+in+ethanol+consumption+and+accumbal+dopamine+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol%22%5BJournal%5D)">A single exposure to voluntary ethanol self-administration produces adaptations in ethanol consumption and accumbal dopamine signaling.</a> Alcohol. 45, 559-5566 (2011).</li>
<li>Howard, E. C., Schier, C. J., Wetzel, J. S., Duvauchelle, C. L., Gonzales, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+shell+of+the+nucleus+accumbens+has+a+higher+dopamine+response+compared+with+the+core+after+non-contingent+intravenous+ethanol+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The shell of the nucleus accumbens has a higher dopamine response compared with the core after non-contingent intravenous ethanol administration.</a> Neuroscience. 154, 1042-1053 (2008).</li>
<li>Robinson, D. L., Lara, J. A., Brunner, L. J., Gonzales, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Ethanol+Concentrations+in+the+Extracellular+Fluid+of+the+Rat+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Quantification of Ethanol Concentrations in the Extracellular Fluid of the Rat Brain.</a> J. Neurochem. 75, 1685-1693 (2000).</li>
<li>Gonzales, R. A., McNabb, J., Yim, H. J., Ripley, T., Bungay, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Microdialysis+of+Ethanol+in+Rat+Striatum%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin.+Exp.+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative Microdialysis of Ethanol in Rat Striatum.</a> Alcohol Clin. Exp. Res. 22, 858-867 (1998).</li>
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Este artículo fue financiado por Med Associates, Inc.

Aplicaciones y limitaciones Medicamentos auto-administración se utiliza en los roedores a la adicción de drogas modelo. Muchas drogas de abuso que se modelan de esta manera puede administrarse por vía intravenosa, en la que el fármaco se administra directamente en el compartimento central. Esto permite un control estricto de la dosis durante una sesión de auto-administración. Puesto que el etanol es habitualmente de forma oral auto-administrada, es mucho más difícil de controlar los niveles de fármaco debido a las diferencias individuales en la absorción y el metabolismo. Mediante el uso de microdiálisis a la muestra de la región cerebral de interés, no sólo son capaces de controlar el patrón de etanol de llegar a la región, pero también somos capaces de controlar simultáneamente los cambios de neurotransmisores en la misma región en el tiempo durante cada fase de auto-administración. Alteraciones neuroquímicas y las respuestas inducidas por las drogas en el cerebro están asociados con el abuso y dependencia de drogas, por lo que la capacidad para medir simultáneamenteneuroquímico seguro y las concentraciones de drogas específicas durante las fases de auto-administración es una herramienta muy poderosa y única. Una cuestión a tener en cuenta para la correlación de las concentraciones de analitos dializado con conductas son las características físicas de la tubería microdiálisis. Específicamente, el tiempo que tarda para que el líquido se transfiere desde el lumen de la sonda de microdiálisis para el tubo de recogida es crítica, y tiempos más cortos son mejores. En nuestro laboratorio, la construcción de las sondas de modo que el tiempo es de aproximadamente 90 segundos. Usando estas condiciones, hemos encontrado que hay un aumento de la dopamina accumbal en el inicio del consumo de etanol, lo que disminuye en el curso de los períodos de bebida y post-bebida al aumentar la concentración de etanol de dializado. 2,3,8,9 Estos experimentos , cuando se combinan con los datos de los estudios farmacológicos, nos han permitido analizar los efectos estrictamente farmacológicas de etanol y autoadministración señales ambientales asociadas en canalanges en las concentraciones de neurotransmisores. Cabe señalar que esta aplicación particular de la combinación del comportamiento de microdiálisis técnicas se adaptan a los intereses actuales de investigación de nuestro laboratorio. Está diseñado para evaluar el patrón temporal de etanol alcanza el cerebro en comparación con el patrón de cambios de neurotransmisores en la misma región, por lo que podemos relacionar estas medidas a síncronos de auto-administración comportamientos. Las concentraciones de etanol derivado de dializado no se corrigen por la sonda en la recuperación in vivo, y son sólo una fracción de la concentración de etanol en el tejido cerebral. Si microdiálisis cuantitativa de etanol se requiere, la fracción de extracción de etanol que se difunde desde el espacio extracelular en la sonda debe ser determinado experimentalmente. Ver publicaciones anteriores de nuestro laboratorio de métodos y nuevos debates. 10,11,12 Aunque este protocolo ilustra el uso de gas chromatography junto con microextracción en fase sólida de etanol del espacio de cabeza de muestras de microdiálisis, otros métodos para el análisis del contenido de etanol de la muestra de microdiálisis se podría utilizar. Sin embargo, los métodos alternativos pueden sufrir de algunas desventajas. Por ejemplo, los métodos analíticos menos sensibles pueden requerir un volumen de muestra más grande que requiere tiempos de muestreo mayor que el 7.5 min ilustra aquí. El tipo de sistema discutido aquí utiliza una microextracción en fase sólida que concentra el etanol en la fase de vapor en el vial de muestra sellada, permitiendo la absorción de la fibra colocada en el espacio de cabeza del vial. Esto mejora el límite de detección en comparación con el muestreo del espacio de cabeza directo que permite típicamente 50-100 microlitros de la que se inyecta vapor. Otra ventaja importante del método del espacio de cabeza es que la muestra inyectada para el análisis es extremadamente limpio y libre de sales. La inyección directa de la muestra de microdiálisis líquido también se puede usar con mayor Sensitividad, pero esto requerirá más tiempo de inactividad instrumento debido a un mantenimiento regular necesario para la limpieza de las sales inyectadas. Solución de problemas y otras notas <ol><li> Antes de que su experimento comienza, te dan un montón de tiempo para comprobar que sus microdiálisis montajes están funcionando correctamente y para localizar averías cualquier problema. Nosotros sugerimos que usted tiene un extra de puesta a punto, perfundidos con ACSF, dispuesto a cambiar con un mal funcionamiento del set-up para ahorrar tiempo, ya que la mayoría de las sesiones operantes tienden a ocurrir a una hora específica cada día. </li><li> Asegúrese de que las sondas de microdiálisis se insertan en un período de aproximadamente 5 min para minimizar el daño tisular producido por cizallamiento del tejido como la sonda penetra en el cerebro. </li><li> Cuando la transferencia de la rata en la cámara operante es útil tener una segunda persona ayudar de manera que la línea de transferencia (parte de la microdiálisis set-up) no se enreden, y para que el programa operante puede ser initiated a tiempo. </li><li> Asegúrese de que usted le debe suministrar agua suficiente automuestreador bañera de tiempo para alcanzar la temperatura adecuada. Nuestro sistema requiere normalmente dos horas para llegar a los 50 ° C. Además, aseguran que sus muestras están completamente vaporizado antes de analizar las muestras. Normalmente nos confirme visualmente que esto ha ocurrido antes de iniciar el análisis de la muestra. </li><li> Estándar de buenas prácticas de química analítica deben ser seguidas. Estos incluyen, pero no se limitan a, la validación de los individuos, equipos, y procedimientos. En resumen, contamos con los siguientes lineamientos: Los usuarios individuales deben demostrar la capacidad de generar reproducibles valores de altura de pico para las concentraciones estándar y curvas lineales estándar (R2 ≥ 0,99) a través de varios días. Para verificar el sistema GC-FID está trabajando correctamente, las normas deben ser siempre ser analizados antes de cualquier muestra de dializado se inyectan. La curva estándar generada debe tener un R2 ≥ 0,99. </li><li> La mayor parte del equipo que utilizamosfue comprado a través de Varian, Inc., que fue adquirida por Agilent Technologies en 2010. En este momento, Bruker Scientific Instruments laboratorio obtenido de Varian de cromatografía de gases de negocios instrumentos. Para futuras compras, consultar cualquiera de estas sociedades. </li><li> El presente protocolo muestra un comportamiento operante con ratas, pero el espectador debe ser consciente de que más interrupción de comportamiento es probable que ocurra con el modelo de ratón más pequeño. Otra cuestión a tener en cuenta es que la colocación de una sonda de microdiálisis en otras regiones del cerebro de la corteza medial prefrontal o núcleo accumbens puede perturbar el comportamiento operante a un mayor grado que se muestra aquí. Es importante examinar de cerca numerosos parámetros de comportamiento para determinar si el daño causado por la colocación de la sonda produce graves cambios en el comportamiento. </li></ol>

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> 95% de etanol </td><td> AAPER Alcohol and Chemical Co., Shelbyville, KY </td><td> E190, 111000190 </td></tr><tr><td> Ultra-Pure sacarosa </td><td> MP Biomedicals, LLC, Solon, OH </td><td> 821721 </td></tr><tr><td> Ultra Alta Pureza helio </td><td> Mezcla combustible </td><td> HE UHP300 </td></tr><tr><td> Aire </td><td> Mezcla combustible </td><td> AIZ300 </td></tr><tr><td> Hidrógeno </td><td> Mezcla combustible </td><td> AIZ300 </td></tr><tr><td> GC 2 ml viales </td><td> Agilent </td><td> # 8010-0015 </td></tr><tr><td> GC tapas de los viales con PTFE / silicona septa </td><td> Agilent </td><td> # 8010-0084 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Reactivos específicos

microdiálisis de etanol durante etanol operante determinación y la auto-administración de etanol por cromatografía de gases

Microdialysis of Ethanol During Operant Ethanol Self-administration and Ethanol Determination by Gas Chromatography

Operantes de auto-administración métodos se utiliza comúnmente para estudiar los efectos conductuales y farmacológicas de muchas drogas de abuso, incluyendo el etanol. Sin embargo, el etanol es típicamente auto-administrarse por vía oral, en lugar de por vía intravenosa como muchas otras drogas de abuso. La farmacocinética de los fármacos administrados por vía oral son más complejos que los medicamentos administrados por vía intravenosa. Debido a la comprensión de la relación entre los efectos farmacológicos y de comportamiento de etanol requiere el conocimiento de la evolución en el tiempo de etanol alcanza el cerebro durante y después de beber, utilizamos microdiálisis in vivo y cromatografía de gases con detección de ionización de llama para supervisar el cerebro concentraciones de etanol de dializado a través del tiempo. Combinados de comportamiento microdiálisis-experimentos implican el uso de varias técnicas. En este artículo, la cirugía estereotáxica, y la formación del comportamiento de microdiálisis, que puede ser adaptado para probar una multitud de auto-administración y neupetroquímicas hipótesis centrada, sólo se incluyen para ilustrar cómo se relacionan con las fases posteriores de la toma de muestras y análisis de etanol dializado. Dializado análisis etanol concentración por cromatografía de gases con detección de ionización de llama, que es específico para los estudios de etanol, se describe en detalle. Los datos producidos por estos métodos revelar el patrón de etanol alcanza el cerebro durante el procedimiento de auto-administración, y cuando se combina con el análisis neuroquímico de las muestras de dializado mismas, permite conclusiones que se haya efectuado sobre los efectos farmacológicos y de comportamiento de etanol.

Un método para determinar el curso temporal de la concentración de etanol en el cerebro de ratas durante etanol operante auto-administración se describe. La cromatografía de gases con detección de ionización de llama se utiliza para cuantificar de etanol en las muestras de dializado, debido a que tiene la sensibilidad necesaria para los pequeños volúmenes que se generan.

Microdiálisis de etanol durante etanol operante determinación y la auto-administración de etanol por cromatografía de gases

Los métodos de autoadministración operante se utilizan comúnmente para estudiar los efectos conductuales y farmacológicos de muchas drogas de abuso, incluido el etanol.

El objetivo general de este procedimiento es monitorear los niveles de etanol en el dializado cerebral durante una sesión de autominición de etanol. Con el fin de comparar esta medida con los comportamientos sincrónicos de autominición, esto se logra primero mediante la implantación quirúrgica de una guía de microdiálisis, una cánula y un perno de sujeción, y luego entrenando a las ratas para que administren operativamente etanol. El segundo paso consiste en habituar a las ratas al arnés de sujeción craneal para que este no interfiera con la autominición de etanol durante la microdiálisis.Luego se realiza una microdiálisis durante una sesión de autominicistración de etanol, en la cual se prepara una porción del dializado para el análisis de etanol. A continuación, las muestras de dializado se analizan para determinar la concentración de etanol mediante un cromatógrafo de gases con detección por ionización de llama. Finalmente, los resultados obtenidos muestran el curso temporal del etanol al alcanzar la región cerebral de interés durante una sesión de autominicistración de etanol.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la punción de la cola o de la vena safena es que este procedimiento es mínimamente invasivo en el momento de la recolección de la muestra y permite la medición de fármacos a lo largo del tiempo en la región cerebral de interés mientras el animal realiza una tarea conductual. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque requiere varias habilidades especializadas, muchas de las cuales solo pueden adquirirse mediante práctica repetida o experiencia. Asimismo, el procedimiento será demostrado por Jeffrey Dilley, un asistente de investigación de pregrado en nuestro laboratorio.Todos los procedimientos con animales mostrados han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Texas y siguen todas las guías para el cuidado y uso de animales de laboratorio. Para estos experimentos de microdiálisis conductual se utilizan ratas Long Evans bien manipuladas, alojadas en una instalación acreditada por ALAC, la Universidad de Texas en Austin, que han sido implantadas quirúrgicamente con una cánula de 21 gauge por encima de la región cerebral de interés. Todos los animales deben recibir al menos una semana de cuidados y recuperación postquirúrgica, y deben encontrarse sanos antes de comenzar los siguientes procedimientos.Coloque la rata en una cámara operante de Med Associates, equipada con una palanca retráctil Lichter y un tubo dosificador, y entrénela para que presione la palanca a fin de obtener acceso a una solución de sacarosa al 10 %. Una vez que la rata esté entrenada para responder por la solución de sacarosa, comience con un programa de entrenamiento adecuado durante el cual se agregue etanol gradualmente a la solución en varias sesiones de consumo la noche anterior a la penúltima sesión operante. Después de anestesiar al animal y verificar el nivel de sedación, sujete el muelle del arnés al perno del arnés en la plataforma craneal de la rata para habituarla al aparato, que consiste en una palanca de contrapeso, un brazo, un arnés giratorio, un muelle y un soporte con anillos.Deje que la rata pase la noche en la sala de condicionamiento operante dentro de su jaula con acceso ad libitum a alimento y agua, y luego realice la sesión de entrenamiento del día siguiente con el cable y el equipo correspondiente colocados el día anterior al experimento de microdiálisis. Después de anestesiar a la rata con isoflurano, verifique la sedación realizando una compresión del dedo del pie e inserte una sonda de microdiálisis perfundida con líquido cefalorraquídeo artificial. Fije adecuadamente la sonda y luego ajuste la velocidad de flujo de la sonda a 0,2 microlitros por minuto.Coloque la rata en su jaula de alojamiento en la sala de condicionamiento operante para pasar la noche con todo el equipo de diálisis colocado, y suministre alimento y agua ad libitum. Al día siguiente de la inserción de la sonda, al menos dos horas antes de que comience el experimento, aumente el flujo de la sonda hasta su velocidad de trabajo. Utilizando una jeringa Hamilton, verifique que el caudal de la sonda sea constante y que sea al menos el 90 % del caudal establecido.Si se evalúan neurotransmisores en las muestras de diálisis, tome muestras durante todas las fases del experimento. Comience recolectando muestras de diálisis mientras el animal está en su jaula de origen. Almacene las muestras de manera adecuada para su análisis posterior.Transfiera cuidadosamente la rata a la cámara operante e inicie el programa operante que controla la cámara. Continúe tomando muestras mientras la rata espera a que la palanca se extienda dentro de la cámara, dos muestras antes de que la palanca se extienda. Comience a recolectar una porción de cada muestra de dializado para el análisis de etanol pipeteando una alícuota adecuada de dializado en un vial de vidrio de dos mililitros y sellando el vial con una septa hermética, pipeteando y sellando rápidamente las muestras de etanol.Dado que el etanol es volátil y el volumen de la muestra es pequeño, una preparación de muestras inconsistente o lenta dará lugar a resultados inexactos. Almacene el resto para el análisis de neurotransmisores. El período de bebida de 20 minutos comienza después de que el programa informático de Med Associates extienda la palanca en la cámara y la rata la presione para acceder a una botella de solución bebible.Continúe tomando muestras durante todo el período de bebida. Después del período de bebida, el programa informático retrae la botella de la cámara. Mantenga al animal en la cámara durante un período adicional de 20 minutos tras la ingesta, al final del experimento de microdiálisis. Tras anestesiar la rata, retire la sonda.Si el animal no se sacrifica de inmediato de forma humanitaria, reemplace el obturador para asegurar la visualización del trayecto de la sonda. Recolecte el cerebro dentro de los tres días posteriores al experimento. Analice las muestras junto con patrones externos de etanol utilizando un cromatógrafo de gases con detector de ionización de llama, un muestreador automático de espacio de cabeza calentado a 50 grados Celsius y una columna capilar con helio como fase móvil.Para registrar y analizar los cromatogramas, utilice un software de estación de trabajo de cromatografía para preparar el sistema para el análisis de etanol. Utilice un baño de agua con recirculación para calentar la placa del muestreador automático y abra los tanques de aire e hidrógeno. A continuación, inicie el programa de arranque.Cuando esté listo, inicie una combustión de 20 minutos, que descontamina la fibra. Elabore estándares utilizando un matraz aforado de 100 mililitros para diluir 238 microlitros de etanol al 95 % con agua hasta un volumen final de 100 mililitros. Utilice una dilución seriada uno a uno para crear los estándares.Pipetee los patrones en viales de vidrio y séllelos exactamente como se prepararon las muestras. Asegúrese de incluir un blanco de agua junto con sus patrones. Coloque los patrones y las muestras en la bandeja del muestreador automático y caliéntelos hasta que toda la alícuota líquida se haya vaporizado.Para ejecutar los estándares y las muestras, cree una lista de muestras indicando qué muestra se encuentra en cada ranura del muestreador automático y especifique que cada muestra debe ser perforada. Una vez que las rutas de los archivos de datos se hayan dirigido a una carpeta seleccionada, elija un método adecuado para las muestras e inicie la corrida. Después de que el sistema haya procesado las muestras, verifique que el programa haya integrado correctamente cada pico.Represente gráficamente la altura del pico en función de cada estándar externo conocido. Concentración de etanol. Utilice la función lineal proporcionada por los puntos para interpolar la concentración de etanol de cada muestra de dializado.Esta figura muestra cromatogramas de ejemplo para tres concentraciones de patrones de etanol y uno para una muestra de dializado de rata recolectada al final de la sesión de autoadministración de etanol. Los picos de etanol deben ser relativamente simétricos, tener tiempos de retención consistentes y una relación señal/ruido mayor que 10. El incumplimiento de estos criterios indica que el sistema requiere mantenimiento, cromatografía de calidad y patrones correctos que produzcan una curva patrón lineal, la cual se utiliza para calcular la concentración de etanol en las muestras de dializado recolectadas de animales que autoadministran etanol durante su período de autoadministración.Las concentraciones de etanol en el dializado derivadas no se corrigen por la recuperación del sonda in vivo y representan solo una fracción de la concentración tisular de etanol en el cerebro. Si se requiere microdiálisis cuantitativa de etanol, se determina experimentalmente la fracción de extracción del etanol que difunde desde el espacio extracelular hacia la sonda. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en aproximadamente de cuatro a cinco horas si se lleva a cabo adecuadamente.Esto variará según la duración de la sesión conductual. La finalización exitosa de la fase de microdiálisis del experimento depende en gran medida de la calidad de las fases preparatorias. Es importante, al intentar este procedimiento, asegurarse de que sus ratas hayan sido bien manipuladas y de que las haya habituado a cualquier estímulo potencialmente distractor que pueda ocurrir durante el experimento de diálisis, de modo que la conducta de autominición del animal no se vea afectada.

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Investigación

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Neurociencia

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