Presión constante controlada por extrusión Método para la preparación de vesículas de lípidos de tamaño nano-

El objetivo general del siguiente experimento es presentar un método robusto de preparación para vesículas lipídicas biológicamente relevantes. Esto se logra mezclando y transfiriendo fosfolípidos a viales de vidrio e hidratándolos con tampón acuoso para crear una suspensión de SLE multilaminar. Como segundo paso, se realiza un método de congelación y descongelación, que posteriormente da como resultado la producción de Ella Vesicles a partir de vesículas multilaminares.

A continuación, la suspensión de liposomas se pasa a través de una extrusora utilizando la presión óptima determinada para producir vesículas lipídicas homogéneas del tamaño deseado. Se obtuvieron resultados que muestran tamaños de vesículas submicrónicas consistentes basados en la dispersión dinámica de la luz y el análisis de seguimiento de nanopartículas. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la sonicación y la sedimentación, es que utiliza un sistema de control de presión con caudales de nitrógeno óptimos determinados para una preparación eficiente del tamaño de las vesículas lipídicas.

Para comenzar este procedimiento, tome un frasco de vidrio de 20 mililitros con una tapa forrada de teflón, limpie toda la cristalería y las jeringas con cloroformo antes de usarlo para evitar la contaminación. Transfiera 100 microlitros de cloroformo de grado reactivo al vial de vidrio con una jeringa de vidrio hermética de 250 microlitros. Agregue 30 microlitros de metanol de grado reactivo al mismo vial de vidrio con una jeringa de vidrio hermética de 100 microlitros.

Prepare una solución lipídica de colesterol de amapola C de dos milimolares transfiriendo 216 microlitros de 10 miligramos por mililitro pop C 42 microlitros de 10 miligramos por mililitro. Pop e y 20 microlitros de 11 miligramos por mililitro. Las soluciones de colesterol para el vial de vidrio de 20 mililitros evaporan los solventes orgánicos usando argón de flujo lento o gas nitrógeno hasta que se observe una película delgada de lípidos en el fondo del vial, coloque el vial de vidrio destapado en un desecado al vacío durante al menos 30 minutos.

Para eliminar el disolvente residual, transfiera dos mililitros de tampón previamente pasado a través de un filtro de 0,2 micras al vial de vidrio para hidratar los lípidos. Incubar la mezcla a cuatro grados centígrados durante la noche y usarla dentro de las 48 horas para tamaños de liposomas de 30 a 100 nanómetros. Libera la suspensión de liposomas en nitrógeno líquido durante 15 segundos.

A continuación, descongele la suspensión de liposomas utilizando un bloque calefactor a 42 grados SIU durante aproximadamente tres minutos. Repita el proceso de congelación y descongelación durante un total de cinco ciclos. La congelación y posterior descongelación produce Ella Les a partir de vesículas multilaminares y mejora la eficiencia de captura de lípidos durante la extrusión.

A continuación, prepárese para la extrusión siguiendo las instrucciones de Avastin para ensamblar cuidadosamente la lipo tan rápido. El ensamblaje correcto de la extrusora LF 50 es fundamental para evitar fugas de nitrógeno, lo que afecta los caudales deseables. Para garantizar el éxito, realice los siguientes pasos con cuidado.

Para producir un sello hermético. Coloque la pantalla de soporte de orificio grande en la base del filtro de soporte seguida del plato central circular, un disco de drenaje y una membrana de policarbonato. Coloque la pequeña junta tórica negra en la parte superior de la membrana y asegúrela a la base del filtro de soporte.

Fije el extrusor del filtro superior apretando cuatro tornillos en los cuatro orificios correspondientes. Ensamble la unidad extrusora de filtro debajo del barril extrusor grande. Agregue la solución de liposomas al cilindro en la parte superior del cilindro de extrusión.

Coloque una junta tórica circular grande, una tapa estrecha, una junta tórica circular grande y una tapa circular. Conecte el regulador de gas a la parte superior del barril de la extrusora y cierre todas las válvulas para evitar fugas de aire, incluida la válvula de alivio de presión. Coloque un frasco de vidrio de 20 mililitros o un matraz Erlenmeyer de 50 mililitros debajo de la unidad de filtro del extrusor.

Una válvula de seguridad está conectada al regulador y se liberará si la presión supera los 600 CV. Abro el gas nitrógeno y abro la válvula de gas conectada a la extrusora. Aumente la presión de nitrógeno a 25 PSI para liposomas de 400 nanómetros, a 125 PSI para liposomas de 100 nanómetros y a 400 a 500 PSI para liposomas de 30 nanómetros. Observe la suspensión del liposoma hasta que se expulse en el recipiente mientras es empujado por el nitrógeno.

Mantenga el nitrógeno fluyendo hasta que no se observe líquido. Pasando a través del filtro del extrusor al archivo de vidrio para realizar el análisis DLS. Primero, prepare 50 microlitros de una solución de liposomas de 20 micromolares diluida en solución salina tamponada con fosfato o PBS.

Luego encienda la fuente de alimentación y la fuente de la lámpara. Proceda a abrir el software dynapro. Configure el software en el modelo de algoritmo para detectar liposomas en el tamaño deseado.

Después de conectar a la pipeta de hardware 14 microlitros de muestra de liposomas en la veta de cuarzo e insertarla en el soporte de celdas, presione iniciar después de aproximadamente 20 a 30 adquisiciones, presione detener. Analice los picos de diámetro promedio de liposomas registrados en el histograma. El análisis de seguimiento de nanopartículas comienza con la preparación de una solución de liposomas de 500 microlitros y 0,1 micromolares solubilizada en PBS, enjuague el compartimento de la muestra con agua y etanol.

A continuación, seque el compartimento de muestras con una toalla de papel que no suelte pelusa. Encienda la fuente de alimentación del láser y la computadora suministrará 300 microlitros de solución de liposomas 0,1 molares al compartimento de la muestra. Abra el control de temperatura y el software de análisis de seguimiento de nanopartículas.

Presione el botón de captura para encender el láser. Utilice los ajustes horizontales y verticales para mover la platina y ajustar el enfoque del microscopio. Establezca la temperatura deseada y el tiempo de grabación.

Presione el botón de grabación para tomar varios fotogramas de las partículas de liposomas durante un período de tiempo específico. Analice los picos correspondientes a los tamaños de liposomas de diámetro en el histograma a medida que rastrea el movimiento de cada partícula. DLS es un método establecido que recolecta luz dispersa para determinar el diámetro de la partícula y se realizó para determinar el tamaño de los liposomas.

Los liposomas hidratados se extruyeron a través de membranas de policarbonato a varios tamaños y presiones como se describe en el protocolo escrito. Los diámetros de los liposomas medidos por DLS para un tamaño de poro de 30 nanómetros fueron de 66 más o menos 28 nanómetros. Para 100 nanómetros, el tamaño de poro fue de 138 más o menos 80 nanómetros, y para 400 nanómetros, el tamaño de poro fue de 360 más o menos 25 nanómetros.

Se utilizó como estándar de calibración una suspensión de cuentas Irene pulidas de 50 nanómetros, donde se registró un diámetro de 47 más o menos 16 nanómetros. El porcentaje de dispersión poligonal muestra que no hay superposición dentro de los tamaños de los liposomas. Es típico observar diámetros superiores a 30 nanómetros cuando se utiliza el análisis DLS debido al conocido sesgo que este instrumento tiene hacia las partículas más grandes.

A pesar de esta limitación instrumental, la curva de calibración describe una correlación alineada. El análisis de seguimiento de nanopartículas es una nueva tecnología que mide el tamaño de cada partícula a partir de observaciones directas de difusión en un medio líquido, independientemente del índice de refracción o la densidad de la partícula. Esta técnica de alta resolución se puede utilizar para complementar la medición de liposomas con DLS, se utilizaron para la calibración los diámetros registrados por la NTA de 95 más o menos 48 nanómetros y 356 más o menos 51 nanómetros para dos soluciones de poliestireno de 100 nanómetros y 400 nanómetros.

Las soluciones lipídicas tienen un diámetro más comparable en relación con el DLS, produciendo tamaños promedio de 29 más o menos 14 nanómetros para un tamaño de poro de 30 nanómetros, 95 más o menos 17 nanómetros para un tamaño de poro de 100 nanómetros y 359 más o menos 73 nanómetros para un tamaño de poro de 400 nanómetros. NTA puede ser una técnica de caracterización más general para cuantificar partículas microscópicas, ya que su sensibilidad permite las mediciones de partículas de 50 a 1000 nanómetros. La curva de calibración muestra una correlación lineal entre la pausa de la membrana de policarbonato y la transmisión de tinción negativa registrada en el diámetro de NTA Las imágenes de microscopía electrónica muestran cada tamaño de liposoma siguiendo los tamaños de extrusión de 3, 100 y 400 nanómetros claramente diferenciados entre sí.

El aumento se estableció en 25.000 veces con la barra de escala representando 0,5 micras. Se llevó a cabo un experimento de curso de tiempo con tres tamaños de liposomas. Se midió DLS para cada solución de liposoma inmediatamente después de la extrusión.

Todas las soluciones de liposomas se almacenaron a cuatro grados centígrados durante la noche. Sus diámetros fueron registrados nuevamente por DLS después de una incubación durante la noche. Se observaron pocos o ningún cambio después de un período de incubación de 60 horas Al intentar este procedimiento, es importante recordar que múltiples pasadas a través del filtro de extrusión mejorarán la homogeneidad de la solución Vesco.

Además, recuerde utilizar viales y jeringas de vidrio para la preparación de muestras para evitar la contaminación por lixiviación por tubos de polipropileno del cloroformo.