Name: Fabricación y uso de microarrays microambiente (MEArrays) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: Aprende a fabricar microarrays microambiente para estudiar funciones celulares mediante análisis de diferenciación y proliferación. Este método permite investigar cómo la composición molecular afecta el comportamiento celular.

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<ol><li>Bissell, M. J., Labarge, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Context%2C+tissue+plasticity%2C+and+cancer%3A+are+tumor+stem+cells+also+regulated+by+the+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Context, tissue plasticity, and cancer: are tumor stem cells also regulated by the microenvironment.</a> Cancer Cell. 7, 17-23 (2005).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126, 677-689 (2006).</li>
<li>McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+shape%2C+cytoskeletal+tension%2C+and+RhoA+regulate+stem+cell+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment.</a> Dev. Cell. 6, 483-495 (2004).</li>
<li>LaBarge, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mammary+progenitor+cell+fate+decsions+are+products+of+interactions+with+combinatorial+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Human mammary progenitor cell fate decsions are products of interactions with combinatorial microenvironments.</a> Integrative Biology. 1, 70-79 (2009).</li>
<li>Kim, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+Methods+for+Polymers+in+Cell+and+Tissue+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+biomedical+engineering%22%5BJournal%5D)">Patterning Methods for Polymers in Cell and Tissue Engineering.</a> Annals of biomedical engineering. , (2012).</li>
<li>Boudou, T., Ohayon, J., Picart, C., Pettigrew, R. I., Tracqui, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+elastic+properties+of+polyacrylamide+gels%3A+implications+for+quantification+of+cellular+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Biorheology%22%5BJournal%5D)">Nonlinear elastic properties of polyacrylamide gels: implications for quantification of cellular forces.</a> Biorheology. 46, 191-205 (2009).</li>
<li>Tse, J. R., Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+hydrogel+substrates+with+tunable+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties.</a> Current protocols in cell biology. Chapter 10, Unit 10(2010).</li>
<li>Flaim, C. J., Chien, S., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extracellular+matrix+microarray+for+probing+cellular+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">An extracellular matrix microarray for probing cellular differentiation.</a> Nat. Methods. 2, 119-125 (2005).</li>
<li>Soen, Y., Mori, A., Palmer, T. D., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+regulation+of+human+neural+precursor+cell+differentiation+using+arrays+of+signaling+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Exploring the regulation of human neural precursor cell differentiation using arrays of signaling microenvironments.</a> Mol. Syst. Biol. 2, 37(2006).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El método que aquí se presenta permite MEArray análisis funcionales de las células y las interacciones combinatorias microambiente 4. Análisis MEArray combina el uso de las tecnologías de micropatterning básicos, biología celular, y los robots de microarrays de impresión y dispositivos de análisis que están disponibles en muchas instalaciones multiusuario. MEArray pantallas son compatibles con la mayoría de tipos de células adherentes, aunque sin suero formulaciones de medios puede ser necesario ajustar en al...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> El número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> Portaobjetos de vidrio 25 mm x 75 mm </td><td> VWR </td><td> 48311-600 </td><td></td></tr><tr><td> Vidrio cubreobjetos (no.1) 24 mm x 50 mm </td><td> VWR </td><td> 48393-241 </td><td></td></tr><tr><td> Placa de tinción (o tarro Coplan) </td><td> VWR </td><td> 25461-003 </td><td></td></tr><tr><td> Placas de Petri (15 cm) </td><td> BD Falcon </td><td> 351058 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH (1,0 N) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S2567 </td><td></td></tr><tr><td> APES (&gt; 98% (3-aminopropil) trietoxisilano) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3648 </td><td></td></tr><tr><td> Glutaraldehído </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G7651 </td><td> 50% en agua </td></tr><tr><td> APS (&gt; 98% de persulfato de amonio) </td><td> SIGMA-Aldrich </td><td> A3678 </td><td> Preparar 10% de solución de trabajo con ddH 2 O </td></tr><tr><td> TEMED (N, N, N &#39;, N&#39;-tetrametiletilendiamina) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9281 </td><td></td></tr><tr><td> La acrilamida (40%) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4058 </td><td></td></tr><tr><td> Bis-acrilamida (2% w / v) </td><td> Fisher BioReagents </td><td> BP1404-250 </td><td></td></tr><tr><td> 0,45 micras filtro de jeringa de 4-mm nylon </td><td> Nalgene </td><td> 176-0045 </td><td></td></tr><tr><td> FITC </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F4274 </td><td></td></tr><tr><td> PDMS (polidimetilsiloxano) </td><td> Dow Corning </td><td> 3097358-1004 </td><td> Sylgard 184 Elastómero kit a través de Adhesivos Ellsworth </td></tr><tr><td> 2-cámara de diapositivas </td><td> NUNC </td><td> 177380 </td><td></td></tr><tr><td> Pluronic F108 </td><td> BASF </td><td> 30089186 </td><td></td></tr><tr><td> Aquarium sellador </td><td> Dow Corning </td><td> DAP 00688 </td><td></td></tr><tr><td> Fluormount-G </td><td> Southern Biotech </td><td> 0100-01 </td><td></td></tr><tr><td> Vasos de plástico desechables </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Depresores de lengua </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Los guantes de nitrilo </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Plástico cajas portaobjetos del microscopio </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Girar revestidor </td><td> WS-400B-6NPP/LITE </td><td> Laurell Technologies Corporation </td><td></td></tr><tr><td> Horno </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Placa Digital </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 384-y placas </td><td></td><td></td><td> Una marca apropiada para el robot microarray </td></tr><tr><td> Microarray robot impresión </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fase invertida y microscopio de fluorescencia </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Axon microarrays escáneres </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td> Existen múltiples configuraciones </td></tr></tbody></table>

fabricación y uso de microarrays microambiente (mearrays)

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays (MEArrays)

Las interacciones entre las células y su microambiente circundante tienen consecuencias funcionales para el comportamiento celular. En el nivel de células individuales, distintos microambientes puede imponer diferenciación, migración, proliferación y fenotipos, y en el nivel de los tejidos del microambiente procesos tan complejos como la morfogénesis y la tumorigénesis 1. No sólo el contenido celular y molecular de las células impacto microambientes dentro, pero también lo hacen la elasticidad 2 y 3 de la geometría del tejido. Se define como la suma total de la célula-célula, ECM-, y solubles en interacciones de los factores, además de las características físicas, el microambiente es complejo. Los fenotipos de las células dentro de un tejido son parcialmente debido a su contenido genómico y parcialmente debido a las interacciones combinatorias con el microenviroment. Un reto importante es vincular las combinaciones específicas de componentes microambientales con comportamientos distintivos. ent &quot;&gt; A continuación, presentamos el microambiente de microarrays (MEArray) plataforma de base de células de cribado funcional de las interacciones con los microambientes combinatorias 4. El método permite el control simultáneo de la composición molecular y el módulo de elasticidad, y combina el uso de microarrays ampliamente disponible y tecnologías micropatterning. pantallas MEArray requieren tan pocos como 10.000 células por matriz, lo que facilita los estudios funcionales de tipos de células raras, tales como células progenitoras adultas. Una limitación de la tecnología es que microambientes enteros de tejido no puede ser completamente recapitulado en MEArrays. Sin embargo, la comparación de los respuestas en el mismo tipo de célula a numerosos microambientes relacionados, por ejemplo combinaciones pareadas de proteínas ECM que caracterizan un tejido dado, se proporciona una visión de cómo los componentes microambientales obtener tejidos específicos de fenotipos funcionales. MEArrays se puede imprimir utilizando una amplia variedad de gro recombinantefactores wth, citoquinas, y proteínas purificadas ECM, y sus combinaciones. La plataforma está limitada sólo por la disponibilidad de reactivos específicos. MEArrays son susceptibles de tiempo-caducada análisis, pero más a menudo se utilizan para el análisis de punto final de las funciones celulares que son medibles con sondas fluorescentes. Por ejemplo, la síntesis de ADN, la apoptosis, la adquisición de estados diferenciados, o la producción de productos génicos específicos se miden comúnmente. En pocas palabras, el flujo básico de un experimento MEArray es preparar portaobjetos recubiertos con sustratos de impresión y para preparar la placa maestra de proteínas que se van a imprimir. A continuación, las matrices se imprimen con un robot de microarrays, las células se dejan adherir, crecer en cultivo, y luego se fija químicamente al alcanzar el punto final experimental. Ensayos fluorescentes o colorimétrico, con imágenes de microscopios tradicionales o escáneres de microarrays, se utilizan para revelar correspondientes fenotipos moleculares y celulares (Figura 1).

Un método combinatorio cribado funcional para obtener ideas sobre los impactos de la composición molecular de los microambientes sobre las funciones celulares se describe. El método aprovecha existentes basados ​​en las tecnologías de microarrays para generar matrices de microambientes definidos combinatorias que soportan la adhesión de células y análisis funcional.

Fabricación y uso de microarrays microambiente (MEArrays)

Las interacciones entre las células y su microentorno circundante tienen consecuencias funcionales para el comportamiento celular. A nivel de célula individual, ...

El objetivo general del siguiente experimento es medir los efectos de diferentes microentornos sobre las funciones celulares de tipos celulares adherentes, exponiéndolos en paralelo a una amplia colección de microentornos Combinator. Esto se logra primero fabricando sustratos de impresión que permitan la absorción de mezclas de proteínas del microentorno. A continuación, se preparan placas maestras de proteínas del microentorno, que se utilizan para imprimir matrices de ME mediante un robot de impresión de microarrays con punzón de pluma o con punzón capilar.A continuación, se preparan placas maestras de proteínas microambientales. Luego, las células adherentes se cultivan en la matriz ME con la opción de limitar el número de células. Los resultados obtenidos muestran el impacto de los diferentes microambientes en funciones celulares como la diferenciación o la proliferación, basándose en el análisis de inmunofluorescencia.Tuvimos por primera vez la idea de este método cuando deseábamos cuantificar los efectos de los microentornos tisulares sobre las decisiones de destino de las células madre humanas de memoria, pero nos dimos cuenta de que trabajar in vivo es imposible. Ahora que

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Un procedimiento sencillo de llevar a cabo experimentos de microarrays de encargo de microARN se describe. Los pasos incluyen el aislamiento de ARN, el ARN y el ADN de referencia el etiquetado, la hibridación de las muestras de microarrays, el escaneado de los microarrays, cuantificar y analizar las señales de hibridación.

Realización de experimentos de microarrays personalizados microARN

Una descripción de la formación de un microarray de polímero utilizando una técnica de fotopolimerización en el chip. La caracterización rendimiento de alta superficie mediante microscopía de fuerza atómica, las mediciones de ángulo de contacto del agua, de rayos X y espectroscopía de fotoelectrones de tiempo de vuelo espectrometría de masa iónica secundaria y un ensayo de adhesión celular también se describe.

Microarrays de polímeros de alto rendimiento para el descubrimiento de Biomateriales

Este video muestra una técnica que aplica la tecnología de microarrays de péptidos para perfilar la especificidad de los anticuerpos reconociendo modificaciones postraduccionales (PTM) en péptidos de histonas. Un portaobjetos de microarray que contiene péptidos de histonas conjugados con fluoróforos inmovilizados con combinaciones conocidas de PTM se trata con anticuerpos específicos de PTM diana. Este proceso ayuda a identificar la especificidad del anticuerpo para el objetivo y su posible...

Una tecnología de microarrays de péptidos para el perfil de especificidad de los anticuerpos

Un microarray de la amplificación de PCR asimétrica combina la amplificación y la hibridación de microarrays en una sola cámara, lo que simplifica significativamente microarrays de flujo de trabajo para el usuario final. La simplificación de los microarrays de flujo de trabajo es un primer paso necesario para la creación de diagnósticos basados ​​en microarrays que se pueden utilizar de forma rutinaria en los entornos más bajos recursos.

Demostración de un resistente a múltiples fármacos<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Microarray Amplificación

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Fácil y Precisa mecanoterapia perfiles en micropost Arrays

La diferenciación celular está regulada por una serie de factores microambientales, incluyendo tanto la composición de la matriz y de material de sustrato propiedades. Se describe aquí una técnica utilizando microarrays de células en combinación con microscopía de fuerza de tracción para evaluar tanto la diferenciación celular y las interacciones célula-sustrato biomecánicas como una función del contexto microambientales.

Una de alto rendimiento plataforma de microarrays de células para análisis correlativo de la diferenciación celular y las fuerzas de tracción

El desarrollo de las comunidades microbianas depende de una combinación de factores, incluyendo la arquitectura ambiental, la abundancia de los miembros, los rasgos y las interacciones. Este protocolo describe un ambiente sintético y microfabricado para el seguimiento simultáneo de miles de comunidades contenidas en pozos de femtoliter, donde factores clave como el tamaño de nicho y el confinamiento pueden ser aproximados.

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Fabricación de una Matriz microambiente celular Artificial multiplexados

El propósito del método presentado aquí es mostrar cómo los microarrays de microambiente (MEMA) pueden ser fabricados y utilizados para interrogar el impacto de miles de microambientes combinatorios simples en el fenotipo de las células cultivadas.

Uso de microarrays para interrogar el impacto microambiental en fenotipos celulares en cáncer

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