Fabricación y uso de microarrays microambiente (MEArrays)

El objetivo general del siguiente experimento es medir los efectos de diferentes microentornos sobre las funciones celulares de tipos celulares adherentes, exponiéndolos en paralelo a una amplia colección de microentornos Combinator. Esto se logra primero fabricando sustratos de impresión que permitan la absorción de mezclas de proteínas del microentorno. A continuación, se preparan placas maestras de proteínas del microentorno, que se utilizan para imprimir matrices de ME mediante un robot de impresión de microarrays con punzón de pluma o con punzón capilar.

A continuación, se preparan placas maestras de proteínas microambientales. Luego, las células adherentes se cultivan en la matriz ME con la opción de limitar el número de células. Los resultados obtenidos muestran el impacto de los diferentes microambientes en funciones celulares como la diferenciación o la proliferación, basándose en el análisis de inmunofluorescencia.

Tuvimos por primera vez la idea de este método cuando deseábamos cuantificar los efectos de los microentornos tisulares sobre las decisiones de destino de las células madre humanas de memoria, pero nos dimos cuenta de que trabajar in vivo es imposible. Ahora que ha sido desarrollado, tiene muchas aplicaciones en biología celular, investigación y descubrimiento de fármacos. El PDMS se utiliza como sustrato que imita tejidos más rígidos, ya que es económico, fácil de preparar y fácil de imprimir.

Sin embargo, la hidrofobicidad del PDMS puede hacerlo incompatible con algunas líneas celulares al trabajar con dispositivos de PDMS. Guantes sin látex, ya que el látex puede inhibir la polimerización del PDMS. Para comenzar, en un vaso plástico desechable, combine la base de elastómero de silicona Sylgard 184 con el agente de curado en una proporción de 10 a 1 y mezcle vigorosamente con un depresor lingual de madera o plástico.

A continuación, desgasifique la mezcla en una campana de vacío a temperatura ambiente durante 30 minutos. Luego coloque en el centro un portaobjetos estándar sobre el platillo de vacío accionado de una centrífuga Coer y vierta 0,5 mililitros del polímero elastómero mezclado sobre el centro de la superficie del portaobjetos; realice un recubrimiento por centrifugación a 6.000 RPM durante 60 segundos. Cure los portaobjetos recubiertos con PDMS a 70 grados Celsius durante cuatro horas o durante la noche.

Las láminas pueden almacenarse herméticamente a temperatura ambiente durante varios meses. PA es un hidrogel que puede imitar tejidos más blandos en el rango en el que las células de PA solo se adhieren a los lugares donde hay proteínas que favorecen la adhesión celular. Comience por grabar las láminas con hidróxido de sodio.

Coloque los portaobjetos en un bloque calefactor a 80 grados Celsius. Añada una mililitro de hidróxido de sodio 0,1 normal sobre cada portaobjeto. Asegúrese de cubrir toda la superficie del portaobjeto, ya que de lo contrario el PA fallará.

Deje que el hidróxido de sodio se evapore, dejando una película blanca. Repita este proceso si la superficie no está completamente cubierta. El portaobjetos puede almacenarse a temperatura ambiente durante varios días si es necesario.

A continuación, recubra los portaobjetos con una solución de PES en una campana extractora. Coloque los portaobjetos en un recipiente de 15 mililitros. Añada 300 microlitros de una solución de PES sobre cada portaobjeto grabado con hidróxido de sodio.

Deje que el A PES reaccione con los portaobjetos de hidróxido de sodio exactamente durante cinco minutos. No más tiempo. Lave bien el A PES con agua desionizada dos o tres veces por ambos lados de los portaobjetos.

De lo contrario, se oxidará y formará un depósito marrón en las laminillas en el siguiente paso. Ahora aspire todas las soluciones de las superficies de las laminillas hacia cada placa. Añada 25 mililitros de glutaraldehído al 0,5 % en PBS.

Coloque los portaobjetos en la oscuridad y espere 30 minutos. Pasados los 30 minutos, aspire cuidadosamente toda la solución de glutaraldehído de la superficie del portaobjeto. Luego, seque los portaobjetos cuidadosamente utilizando papel absorbente libre de pelusas.

Las láminas ya pueden almacenarse a temperatura ambiente durante la noche si es necesario. Después de preparar y desgasificar las mezclas de PA, colóquelas en hielo para ralentizar su polimerización. Justo antes de preparar las láminas, añada sulfato de amonio y TEMED a cada mezcla en hielo, y trítúrelas con una pipeta durante cinco a 10 segundos.

Ahora pipetee la mezcla de PA sobre las superficies del portaobjetos. La cantidad de PA varía según la dureza del gel requerida. Luego, coloque cubreobjetos de vidrio encima del PA sin aplicar presión para evitar la formación de burbujas.

Deje que el gel de PA polimerice durante dos horas y luego retire las laminillas bajo agua desionizada. Lave las placas de gel de PA con agua en frascos grandes coplan durante toda la noche. Al día siguiente, para eliminar las acrilamidas no reactivas, seque las placas hasta que el gel de PA se endurezca completamente.

Las láminas pueden entonces almacenarse a cuatro grados Celsius durante un mes en una caja de láminas sellada. Para comenzar, se coloca una cámara de plástico alrededor del arreglo impreso de una lámina con dos cámaras. Retire las cámaras y córtelas por la mitad con una cuchilla de afeitar.

Utilice una punta de pipeta de un mililitro para aplicar una fina línea de silicona para acuarios en el borde de una cámara y presiónela contra la superficie de un arreglo Emmy. Evite tocar la silicona con ninguna parte de las características del arreglo. Asegurar una buena fijación de las cámaras culturales al arreglo Emmy es crucial, ya que los defectos en la fijación de las cámaras permiten que el medio se filtre desde las cámaras, lo cual puede provocar una muerte celular generalizada.

Para portaobjetos recubiertos con PDMS, bloquee los portaobjetos incubándolos en F 108 acuoso al 1% durante 15 minutos bajo vacío para cualquier tipo de gel, enjuague las matrices con medio de cultivo celular que contenga antibióticos tres veces, cinco minutos por lavado. Esto elimina los monómeros no reactivos, que pueden ser tóxicos para las células en el caso de los geles de PA. Después del tercer lavado, permita una incubación adicional de 30 minutos en el medio para rehidratar el gel.

Ahora coloque cuatro o cinco matrices en una placa de Petri estéril de 15 centímetros. A la placa, agregue la mitad del volumen final del medio con las células de interés en la concentración requerida para su aplicación. Las matrices ME deben colocarse en una incubadora adecuada para el mantenimiento del tipo celular que se esté utilizando.

Verifique bajo el microscopio cada 15 a 20 minutos la adhesión uniforme de las células a las características impresas durante la observación. Agite suavemente las matrices ME para distinguir las células adheridas de las flotantes. El tiempo de adhesión variará, pero generalmente se completa dentro de dos horas en una matriz ME codificada con PA.

Después de alcanzar la saturación de la adhesión o el límite de tiempo, aspire las células no unidas y complete el recipiente al volumen final en matrices ME recubiertas con PDMS. Eliminar todo el medio matará las células. Por lo tanto, para todos los cambios de medio en estas placas, reemplace sucesivamente la mitad del volumen del medio y luego complete el recipiente al volumen final.

El cultivo puede proseguir durante muchos días con cambios normales del medio. Fijadores comunes como paraform, aldehído y acetona metanol son compatibles con los sistemas de matrices Emmy. No olvide que, incluso al teñir, las matrices ME recubiertas con PDMS deben mantenerse húmedas.

Continúe entonces con la técnica de reemplazo de volumen medio para preparar portaobjetos de las matrices de ME teñidas. Utilice una cuchilla de afeitar para retirar las cámaras y monte laminillas con flora. La proteína G montada se depositó sobre una matriz de ME de PDMS codificada impresa utilizando puntas de silicio cuadradas en un pin de pluma.

La deposición de diversas proteínas mediante robot impresor de microarreglos se verificó por inmunofluorescencia utilizando anticuerpos. Las diluciones de las soluciones proteicas en la placa maestra reflejaban la cantidad que se depositó sobre la superficie de los sustratos de impresión; las células se adhirieron a las características impresas de manera obviamente ordenada. Asimismo, el mismo patrón evidente de adhesión celular ocurre cuando se imprime un arreglo Emmy en una escala de 40.000 pases.

Los geles de PA con dos proteínas del microentorno provocaron perfiles de expresión de queratina dependientes de la concentración en una línea celular de progenitoras epiteliales mamarias humanas multipotentes. La razón logarítmica de las señales de queratina ocho respecto a las señales de queratina 14 ilustra la variación y la reproducibilidad de la señal. Después de 24 horas de cultivo, las células no unidas se eliminan mediante lavado en un análisis de 12 matrices me.

Se utilizaron análisis estadísticos estándar para determinar si las diferentes diluciones de colágeno tipo uno y p-cadherina humana recombinante inducían cambios en la expresión de queratina. Inicialmente, no hubo variación respecto a la media entre las células en las características inmediatamente después de la adhesión. Sin embargo, tras 24 horas, las altas concentraciones de colágeno tipo uno provocaron una expresión significativamente mayor de queratina ocho.

Dondeas las altas concentraciones de PCA aquí descritas provocaron una fuerte señal de queratina 14. Este hallazgo es consistente con informes previos sobre células progenitoras de memoria bipotentes. Debido a la naturaleza dinámica y recíproca de las interacciones de estos microentornos celulares, las propias células pueden alterar la composición de los microentornos impresos.

Por lo tanto, para comprender los impactos agudos de los microentornos impresos, el tiempo de exposición no debe exceder las 48 horas siguiendo este procedimiento. Cualquier proceso celular que pueda medirse de forma fluorescente o colorimétrica puede evaluarse como una función del microentorno con el fin de responder preguntas adicionales, como: ¿cómo alteran los diferentes microentornos las respuestas a fármacos en líneas de cáncer? Esto se determina mediante cambios en la apoptosis y la proliferación.

O cómo alteran los microentornos la diferenciación de las células progenitoras.